Clara細(xì)胞分泌蛋白對(duì)創(chuàng)傷性休克肺損傷的保護(hù)作用

翟宏鵬，張春陽，張健，李金暉

（沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院 普外3科，遼寧 沈陽 110024）

Clara細(xì)胞分泌蛋白對(duì)創(chuàng)傷性休克肺損傷的保護(hù)作用

翟宏鵬，張春陽，張健，李金暉

（沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院 普外3科，遼寧 沈陽 110024）

目的探討Clara細(xì)胞分泌蛋白（Clara cell secretion protein 16，CC16）對(duì)創(chuàng)傷性休克大鼠模型繼發(fā)性肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法選擇30只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)均分為3組：假手術(shù)組、對(duì)照組、CC16處理組（n＝10）。采用創(chuàng)傷性休克動(dòng)物模型，假手術(shù)組均完成基本手術(shù)操作，但不放血和復(fù)蘇；對(duì)照組放血后在液體復(fù)蘇前霧化吸入與CC16處理組等容量的生理鹽水；CC16處理組在復(fù)蘇前給予霧化吸入0.1μg／mL的重組人Clara細(xì)胞分泌蛋白（reconstituted Clara cell secretion protein，rh-CCSP）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血?dú)夥治黾胺螡瘢芍乇鹊戎笜?biāo)變化，并測(cè)定肺組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）及肺組織病理學(xué)的改變。結(jié)果與對(duì)照組相比，CC16處理組的pH、PaO2值顯著升高，BE值顯著降低（P＜0.05），肺濕／干重比顯著減少（P＜0.05）；CC16處理組與假手術(shù)組間各項(xiàng)指標(biāo)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，CC16處理組的MDA、MP0含量明顯降低（P＜0.05），肺組織病理學(xué)形態(tài)也有改善（P＜0.05）。結(jié)論霧化吸入rh-CCSP可減輕創(chuàng)傷性休克大鼠繼發(fā)性肺損傷的炎癥反應(yīng)，對(duì)肺組織具有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)用有關(guān)。

Clara細(xì)胞分泌蛋白；創(chuàng)傷性休克；肺損傷；大鼠

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及創(chuàng)傷性休克動(dòng)物模型的制備 動(dòng)物分組：健康成年SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量300～350 g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（沈）2013-0004。隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、對(duì)照組、CC16處理組，每組10只動(dòng)物。

創(chuàng)傷性休克動(dòng)物模型的制備［4］：各組動(dòng)物在手術(shù)前禁食過夜，自由飲水，10%水合氯醛（0.3 mL／100 g，腹腔注射）麻醉后，頸部正中線左右2mm處做切口，以20號(hào)動(dòng)靜脈留置針穿刺右側(cè)頸動(dòng)靜脈置管，動(dòng)脈連接多參數(shù)生理監(jiān)測(cè)儀，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，靜脈插管用于補(bǔ)液，假手術(shù)組操作至此；其他2組：在監(jiān)測(cè)血壓情況下，用外科咬骨鉗于左側(cè)股骨中段下1／3處鉗斷、止血、包扎，待血壓穩(wěn)定后，頸動(dòng)脈快速放血5 mL，使平均動(dòng)脈壓降至35～40mmHg。對(duì)照組在血壓穩(wěn)定后霧化吸入0.9%生理鹽水10min；CC16處理組于血壓穩(wěn)定后霧化吸入50μg／mL的重組人Clara細(xì)胞分泌蛋白（rh-CCSP）10min。兩組分別于90 min后，回輸自體抗凝血與乳酸林格氏液進(jìn)行復(fù)蘇，補(bǔ)液量為失血量的2倍。

1.2 檢測(cè)方法 復(fù)蘇后4 h，大鼠麻醉處死。各組取動(dòng)脈血1mL，血?dú)夥治鰞x進(jìn)行分析，記錄pH值、PaO2值、BE值。取大鼠右肺中、下葉，用冷DEPC水對(duì)肺組織進(jìn)行灌洗后，立即取右肺中、下葉放入凍存管于－80℃冰箱中保存，以備測(cè)定肺組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，方法按試劑盒所述。另取大鼠右肺上葉，稱取濕重，經(jīng)烤箱干燥后稱取干重，計(jì)算肺濕／干重比。再取大鼠左肺，10%福爾馬林固定后，經(jīng)過脫水透明、石蠟包埋、切片染色后，分別于光鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“x±s”表示，各組計(jì)量數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血?dú)夥治鲋笜?biāo)的變化 從表1可以看出，與對(duì)照組相比，CC16處理組的pH、PaO2值顯著升高，BE值降低（P＜0.05）。CC16處理組與假手術(shù)組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組血?dú)夥治鲋笜?biāo)的變化Tab.1 Analysis of the changes of blood gas of different groups

2.2 肺濕／干重比及MPO、MDA活性的測(cè)定 從表2可以看出，與假手術(shù)組比較，對(duì)照組肺濕／干重比顯著增高（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，CC16處理組肺濕／干重比明顯降低（P＜0.05）。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組MPO及MDA活性顯著增高（P＜0.05）；而CC16處理組MPO及MDA活性雖然較假手術(shù)組有顯著增高，但顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 各組肺組織MPO、MDA活性以及肺濕／干重比Tab.2 MPO、MDA and wet／dry weight of different groups

2.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)改變 正常大鼠肺泡壁完整，無明顯病變；復(fù)蘇后對(duì)照組大鼠部分肺泡壁完整性破壞，間質(zhì)水腫、增寬，肺泡腔內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)聚集；而CC16處理組大鼠肺泡間隔略有增寬，肺間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，充血及間質(zhì)水腫較對(duì)照組減輕（見圖1）。

圖1 肺葉組織病理學(xué)變化（×100）Fig.1 Pathological changes of lung tissue pathology（×100）

3 討論

創(chuàng)傷性休克病程發(fā)展復(fù)雜多變，病理過程尚未完全清楚。創(chuàng)傷性休克肺損傷的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)在普遍認(rèn)為是由于機(jī)體大量失血造成的肺組織微循環(huán)功能障礙，體內(nèi)的代償作用使肺組織內(nèi)動(dòng)、靜脈直接大量的聯(lián)通，從而造成動(dòng)脈血中的氧含量嚴(yán)重不足，且全身代謝產(chǎn)物經(jīng)過血液可能儲(chǔ)留于肺［5-6］。這種作用可逐漸損傷肺泡上皮細(xì)胞，使肺泡表面活性物質(zhì)減少，肺泡功能損害。另外血管通透性增加可以造成肺水腫、肺出血、肺泡萎縮和肺不張，使肺部通氣和血液灌注比例失調(diào)。低氧血癥持續(xù)性加重和呼吸困難造成肺部不可逆損傷引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征，形成休克肺。機(jī)體對(duì)外部創(chuàng)傷和休克的急性應(yīng)激引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征。以上2種綜合征均為引起創(chuàng)傷性休克患者死亡的主要原因。因此，研究如何進(jìn)行創(chuàng)傷后休克早期肺功能保護(hù)成為當(dāng)前急需解決的問題之一。

Clara細(xì)胞分泌蛋白作為肺部新的敏感標(biāo)志物，其功能多樣，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等保護(hù)肺組織的作用［4］，被越來越多的研究者所重視。Rosenberger［7］等人研究發(fā)現(xiàn)，通過糖皮質(zhì)激素作用于鼠、兔肺，其肺內(nèi)的CC16明顯升高水平，說明CC16對(duì)肺部具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。羅佛全等［7］將SD大鼠用內(nèi)毒素致急性肺損傷后，發(fā)現(xiàn)靜脈注射內(nèi)毒素后0.5 h開始肺組織勻漿液中CC16蛋白含量和肺組織CC16mRNA表達(dá)水平均進(jìn)行性下降，于6 h達(dá)最低水平，傷后24 h兩者均有所回升。致傷后6 h內(nèi)，隨著肺組織CC16蛋白和CC16mRNA表達(dá)水平的恢復(fù)，肺組織炎性損害程度明顯恢復(fù)。大鼠靜脈注射脂多糖后支氣管肺泡灌洗液中CC16的含量有明顯變化，脂多糖作用于大鼠24 h后CC16表達(dá)明顯降低，結(jié)果表明CC16對(duì)急性肺損傷有保護(hù)作用［7］。最近對(duì)青少年吸煙狀況的研究發(fā)現(xiàn)，在每天吸煙次數(shù)不同的情況下，吸煙最為頻繁的人群中CC16在支氣管肺泡灌洗液中的含量明顯降低，而且CC16在支氣管肺泡灌洗液中的含量隨著每天吸煙次數(shù)的增多逐漸降低［8］。Saha等研究發(fā)現(xiàn)：在肺部黑色素瘤患者中，CC16含量降低，黑色素瘤細(xì)胞大量浸潤(rùn)，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)［9］。Katavolos等學(xué)者最近研究發(fā)現(xiàn)提取馬的血液，使CC16作用于馬血后，能使馬血中的中性粒細(xì)胞促炎功能顯著降低，同時(shí)使中性粒細(xì)胞具有抗炎作用［10］。這些結(jié)果均提示CC16對(duì)肺局部炎癥反應(yīng)有調(diào)控作用，可抑制肺部過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

在本實(shí)驗(yàn)中，創(chuàng)傷失血性休克復(fù)蘇后對(duì)照組動(dòng)脈血pH及Pa02值明顯降低，而BE值升高，反映存在明顯的呼吸功能障礙及酸中毒。隨著給予外源性rh-CCSP后處理組血?dú)夥治黾皾窀芍乇鹊雀髦笜?biāo)均得到不同程度改善，這提示內(nèi)源性CC16濃度的減少在創(chuàng)傷失血性休克的損傷過程中具有重要意義。在肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷失血性休克液體復(fù)蘇后，肺泡壁的完整性被破壞，肺間質(zhì)和肺泡壁內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和滲出，結(jié)合肺濕／干重比升高提示肺組織損傷嚴(yán)重。而在CC16處理組，肺組織病理?yè)p傷及水腫程度均有不同程度的減輕。已有研究表明CC16抗炎作用可能的機(jī)制如下：①CC16可以抑制磷脂酶A2和前列腺素D2的作用，減少引發(fā)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而減少花生四烯酸的產(chǎn)生，抑制炎癥的發(fā)生［11］。②CC16還有抑制血液中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞遷移的作用，這些細(xì)胞的遷移與一些細(xì)胞因子的誘導(dǎo)有關(guān)［12-15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：在創(chuàng)傷失血性休克中，對(duì)照組中反映體內(nèi)氧化應(yīng)激及炎癥程度的指標(biāo)MDA含量增加、MPO活性增加，表明機(jī)體清除氧自由基能力下降，自由基損傷程度加重，機(jī)體內(nèi)大量CC16可能被消耗于清除氧自由基的過程中。CC16處理后大鼠肺組織MDA含量及MPO活性降低，從而推測(cè)CC16抗炎機(jī)制還可能通過抑制髓過氧化物酶活力，清除氧自由基，降低脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)，減輕肺損傷。

綜上所述，外源性rh-CCSP可在創(chuàng)傷失血性休克模型中對(duì)繼發(fā)性肺組織損傷起到一定的保護(hù)作用，而且這種保護(hù)作用的機(jī)制可能與CC16的抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

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（編校：李璐璐）

Protective effects of Clara cell secretory protein on lung injury in traumatic shock model

ZHAIHong-peng，ZHANG Chun-Yang，ZHANG Jian，LIJin-Hui

（The Third Department of General Surgery，F(xiàn)engtian Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Clara cell secretory protein（CC16）on lung injury of traumatic shock rats.MethodsThirty SDmale rats were randomly assigned to three groups：sham-operation group，control group and CC16-treatment group.The rat model of traumatic shock was used in this study.Rats of sham-operation group were operated，but not treated by depletion and recovery.Rats of control group inhaled the physiological saline before fluid resuscitation.Rats of CC16-treatment group inhaled 0.1μg／mL of recombinant human Clara cell secretory protein（rh-CCSP）before fluid resuscitation.Arterial blood gas analysis and wet／dry weight were detected in each group.The contents of malondialdehyde（MDA），myeloperoxidase（MPO）of lung tissues and lung tissue pathology changeswere also studied.ResultsCompared with control group，pH and PaO2value in CC16-treatment group increased significantly.Meanwhile，BE value and lung wet／dry weight ratio also decreased significantly（P＜0.05）.Compared with control group，contents of MDA and MPO in CC16-treatment group decreased significantly（P＜0.05）.Lung tissue pathology improved in the CC16 group compared with that of control group（P＜0.05）.ConclusionInhaled Rh-CCSP may have potential protective effect on lung injury tissues of traumatic shock ratsmodel through its antioxidative effect.

Clara cell secretory protein；traumatic shock；lung injury；rat

R641

A

1005－1678（2014）03－0061－03

創(chuàng)傷性休克［1］多由于機(jī)體遭受嚴(yán)重創(chuàng)傷使有效循環(huán)血量銳減，微循環(huán)灌注不足，導(dǎo)致機(jī)體代償失調(diào)，因此較單純失血性休克的病因、病理更加復(fù)雜。細(xì)胞代謝障礙造成乳酸堆積，液體復(fù)蘇的同時(shí)誘導(dǎo)大量炎癥因子的釋放，造成凝血障礙和缺血-再灌注損傷，繼而并發(fā)急性全身炎癥綜合征和多器官功能衰竭。肺作為最易受損的重要器官之一，肺微循環(huán)功能障礙，使肺泡上皮細(xì)胞損傷，肺泡表面活性物質(zhì)減少，血管通透性增加造成肺水腫和出血肺泡萎縮和肺不張，使通氣和血液灌注比例失調(diào)。Clara細(xì)胞分泌蛋白（Clara cell secretion protein 16，CC16）是肺泡上皮分泌的20種蛋白之一，隨著人們對(duì)CC16的研究逐漸加深，發(fā)現(xiàn)CC16對(duì)肺局部炎癥反應(yīng)有很好的調(diào)控作用，可抑制肺部過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生［2-3］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用創(chuàng)傷失血性休克模型，觀察給與外源性重組人Clara細(xì)胞分泌蛋白后對(duì)于創(chuàng)傷后繼發(fā)性肺損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研項(xiàng)目（CSY12J002）

翟宏鵬，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：普外疾病治療，E-mail：zhaihongpeng12＠163.com。