內(nèi)皮祖細(xì)胞移植前后兔肺動(dòng)脈高壓模型血漿血栓素A2和前列腺素I2的水平變化

楊志瑜，夏岳，戚國(guó)慶

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 石家莊 050017）

內(nèi)皮祖細(xì)胞移植前后兔肺動(dòng)脈高壓模型血漿血栓素A2和前列腺素I2的水平變化

楊志瑜，夏岳，戚國(guó)慶

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 石家莊 050017）

目的探討移植內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）后，野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導(dǎo)兔肺動(dòng)脈高壓（pulmonary artery hypertension，PHA）模型中血漿血栓素 A2（thromboxane A2，TXA2）、前列腺素 I2（prostaglandin I2，PGI2）水平的變化。方法建立野百合堿誘導(dǎo)兔肺動(dòng)脈高壓模型；體外分離誘導(dǎo)兔內(nèi)皮祖細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定；將50只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組和模型組經(jīng)尾靜脈注射M199培養(yǎng)基，EPCs治療組經(jīng)尾靜脈注射熒光標(biāo)記的EPCs。3周后測(cè)定兔血漿血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）和6-酮-前列腺素1α（6-keto-prostagland in F1 alpha，6-keto-PGF1α）的含量，并計(jì)算2者的比值。結(jié)果與模型組相比，EPCs治療組血漿中6-keto-PGFlα的含量顯著增加，為（130.67±17.54）μmol／L；TXB2的含量顯著降低，為（402.89±27.98）μmol／L；2組TXB2／6-keto-PGF1α的比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論移植內(nèi)皮祖細(xì)胞可以降低由野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中TXA2的含量及增加PGI2的含量，從而逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓的損傷。

內(nèi)皮祖細(xì)胞；肺動(dòng)脈高壓；TXA2；PGI2

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)新西蘭大白兔50只，雌雄各半，兔齡6個(gè)月左右，體質(zhì)量為（2.5±0.5）kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。本實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例，所有動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.2 主要試劑和儀器 MI99培養(yǎng)基購(gòu)自杭州四季青生物有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京經(jīng)緯博恒生物公司；胎牛血清、熒光染料購(gòu)自Sigma公司；兔抗人CD34抗體、兔抗人FLK-1抗體、兔抗人CD133單抗購(gòu)自Santa Cruz公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔購(gòu)自北京東亞免疫技術(shù)研究所；血栓素B2（Thromboxane B2，TXB2）和6-keto-PGF1α放免試劑盒購(gòu)自北京美科迪生物技術(shù)有限公司；DAPI熒光染料購(gòu)自Sigma公司。

iMark酶標(biāo)儀（BIO-RAD，美國(guó)）；ThermoForma CO2孵箱（Thermo Scientific，美國(guó)）；EPICS-XL流式細(xì)胞儀（Beekman-Coulte，美國(guó)）；olympus-lx7o倒置熒光顯微鏡（olympus，日本）；SSI-3000多普勒彩超（東莞市健威醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)）。

1.3 兔肺動(dòng)脈高壓模型的建立和動(dòng)物分組 50只新西蘭大白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在同等飼養(yǎng)條件下，采用隨機(jī)數(shù)表法將其分為3組，正常對(duì)照組16只，雌雄各半，腹腔注射與模型組相同劑量的溶劑混合物；MCT單純誘導(dǎo)PAH模型組16只，雌雄各半，注射MCT溶液，給藥劑量為60 mg／kg；EPCs移植治療組18只，雌雄各半，造模方式與模型組相同。3組均注射1次。2周后，對(duì)各組行彩超鑒定。

1.4 兔內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的分離培養(yǎng)與鑒定 采用Ficoll密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞［6-7］。將新西蘭大白兔以10%水合氯醛麻醉后，仰臥位綁定在兔臺(tái)上，直接心臟穿刺采血。抗凝管收集血液，緩慢搖動(dòng)，加入等體積PBS。吸取淋巴細(xì)胞分離液5mL，放入15mL離心管。沿試管壁加入血液。4℃，2 000 r／min離心20min，離心后離心管中內(nèi)容物分為3層，在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單個(gè)核細(xì)胞層。小心吸取界面層單個(gè)核細(xì)胞，移入另一離心管中。末次離心后，棄上清，用5mL含有20%胎牛血清的M199重懸細(xì)胞。洗去懸浮細(xì)胞，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)到第7天，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞后，用經(jīng)過多聚賴氨酸處理的玻片進(jìn)行爬片。

選取生長(zhǎng)良好的原代細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)滿約一半時(shí)用4%的甲醛溶液固定，免疫組化染色鑒定內(nèi)皮標(biāo)記物CD31、CD34、Flk-1的表達(dá)?？瞻讓?duì)照時(shí)除一抗用PBS代替外基本步驟同其他2組。

1.5 兔EPCs的體外標(biāo)記和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)第7天，在50μg／mL EPCs培養(yǎng)液中加入熒光染料DAPI，37℃培養(yǎng)箱孵育30min。經(jīng)離心，棄上清，PBS反復(fù)沖洗細(xì)胞3次（每次2min），洗去多余的DAPI。熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記率。將標(biāo)記好的細(xì)胞重懸于100 uLM199培養(yǎng)基中，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106／mL，用于細(xì)胞移植。

1.6 兔EPCs的細(xì)胞移植 經(jīng)彩超檢查，PAH模型造模成功后，正常對(duì)照組及MCT誘導(dǎo)模型組動(dòng)物經(jīng)尾靜脈連續(xù)注射100 uL的M199培養(yǎng)基，連續(xù)3 d；EPCs移植治療組動(dòng)物經(jīng)尾靜脈連續(xù)注入DAPI標(biāo)記的EPCs，連續(xù)3 d，每次注入5×105個(gè)EPCs。3組動(dòng)物在相同條件下，喂養(yǎng)3周后，腹主動(dòng)脈收集血液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.7 TXA2、PGI2的測(cè)定及TXA2／PGI2比值的計(jì)算 血漿中6-keto-PGFlα和TXB2濃度測(cè)定采用放射免疫法測(cè)定并計(jì)算比值，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。由于TXA2和PGl2性質(zhì)極不穩(wěn)定，含量難以測(cè)定。但PGl2和TXA2的代謝產(chǎn)物6-keto-PGFlα和TXB2極其穩(wěn)定，故目前多通過測(cè)定6-keto-PGFlα和TXB2的含量來反映血漿中PGI2和TXA2水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔子注射MCT溶液后，彩超檢查結(jié)果 彩色多普勒結(jié)果顯示：正常組的肺動(dòng)脈內(nèi)徑遠(yuǎn)小于主動(dòng)脈寬度，肺動(dòng)脈高壓模型組肺動(dòng)脈主干內(nèi)徑大于主動(dòng)脈寬度，說明肺動(dòng)脈壓力高，肺動(dòng)脈擴(kuò)張，肺動(dòng)脈高壓。肺動(dòng)脈高壓模型組可探測(cè)到三尖瓣返流，呈五彩加速血流，示肺動(dòng)脈高壓模型成功（見圖1）。

圖1 肺動(dòng)脈彩色多普勒檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Pulmonary artery color Doppler test results

2.2 EPCs的形態(tài)學(xué)觀察與熒光染料標(biāo)記 在鏡下觀察剛分離出來的單個(gè)核淋巴細(xì)胞，細(xì)胞小呈圓形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸變大，呈條形或梭形細(xì)胞。7d后在誘導(dǎo)成熟的EPCs加入熒光染料DAPI 30min后，暗室觀察，可見細(xì)胞核被染成藍(lán)色熒光（見圖2）。

圖2 EPCs形態(tài)及熒光染料標(biāo)記Fig.2 EPCsmorphology and fluorescent dye-labeled

2.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定 每天觀察內(nèi)皮組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)第二天時(shí)即有少數(shù)細(xì)胞貼壁，形態(tài)圓形，較均勻，核位于細(xì)胞中心處。第五天時(shí)，細(xì)胞貼壁數(shù)明顯增多，細(xì)胞開始變形，呈梭形。第七天時(shí)，細(xì)胞梭形形狀更加明顯，貼壁完全。此時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)志物免疫組化實(shí)驗(yàn)，熒光顯微鏡觀察EPCs均強(qiáng)顯示CD34＋、Flk-1＋、CD31＋等標(biāo)記物（見圖3）。

圖3 內(nèi)皮祖細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果（×400）Fig.3 EPCs immunofluorescence results（×400）

2.3 EPCs移植對(duì)血漿TXB2、6-keto-PGFlα的含量及其比值的影響 與空白對(duì)照組相比，MCT模型組血漿中6-keto-PGFlα的含量明顯降低，TXB2的含量也明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TXB2／6-keto-PGFlα的比值較空白對(duì)照組明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。EPCs移植后，移植動(dòng)物血漿中6-keto-PGFlα的含量顯著增加，TXB2的水平顯著降低，與MCT模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見表1）。

表1 血漿中TXB2、6-keto-PGFlα的含量及其比值變化Tab.1 Changes of the content of TXB2，6-keto-PGFlαand its ratio in Plasma

3 討論

MCT誘導(dǎo)動(dòng)物PAH模型為經(jīng)典模型［8］，該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用次造模方式2個(gè)星期后，經(jīng)彩超檢查，鏡下可見，與正常對(duì)照組相比，模型組肺動(dòng)脈主干內(nèi)徑均增寬，提示PHA形成，PHA模型造模成功。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明EPCs不但具有促進(jìn)新生血管形成能力，還能分泌多種血管生長(zhǎng)的因子［9-10］。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過釋放前列環(huán)素（PGE2）、血栓素A2（TXA2）等細(xì)胞活性因子來調(diào)節(jié)肺血管的收縮和血管內(nèi)血栓形成等。在PHA發(fā)生時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受到破壞，分泌的各種細(xì)胞因子之間的調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致血管重塑，在PHA的后期治療及疾病發(fā)展進(jìn)展中起著重要作用［11-12］。研究表明靜脈來源的EPCs注入到肺的細(xì)動(dòng)脈及移植腎上腺素轉(zhuǎn)導(dǎo)的EPCs可以很大程度的改善肺動(dòng)脈高壓［12］。

TXA2和PGI2是一對(duì)在PHA發(fā)病過程中起重要作用的血管收縮、舒張活性物質(zhì)［13］。TXA2具有高效血小板聚集和促進(jìn)血管收縮的能力，具有收縮肺動(dòng)脈、促進(jìn)肺內(nèi)各級(jí)血管平滑肌細(xì)胞和纖維母細(xì)胞增生、增值的作用，但在體內(nèi)極不穩(wěn)定，發(fā)揮作用后，會(huì)迅速代謝轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的TXB2。肺血管收縮和肺小動(dòng)脈內(nèi)微血栓形成的主要原因就是由于PHA患者肺循環(huán)血漿及組織中TXA2含量明顯升高。PGI2具有強(qiáng)大的擴(kuò)血管和抗血小板凝集、釋放功能。PGI2半衰期也很短，代謝后形成穩(wěn)定的6-keto-PGF1α。PHA時(shí)，由于血管內(nèi)皮受損、合成和分泌PGI2減少，血漿循環(huán)中PGI2含量呈降低趨勢(shì)，導(dǎo)致血管收縮，血小板聚集形成血栓［13-15］。本實(shí)驗(yàn)中，采用MCT誘導(dǎo)PHA模型，血漿中TXB2的含量明顯升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血漿中6-keto-PGFlα的含量明顯降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過體外誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞，誘導(dǎo)成EPCs，經(jīng)尾靜脈移植，可以逆轉(zhuǎn)PHA模型血漿中TXB2的含量升高及血漿中6-keto-PGFlα的含量降低，降低 TXB2／6-keto-PGFlα的比值，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示EPCs緩解了MCT誘導(dǎo)的PHA模型中內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

綜上所述，PHA模型造模成功后，經(jīng)過移植內(nèi)皮祖細(xì)胞，能降低模型組血漿中TXB2的含量，升高血漿中6-keto-PGFlα的含量，TXB2／6-keto-PGFlα比值降低，從而保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂，舒張血管，降低了血小板的聚集，減少血栓的形成，抑制肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)一步損傷。但EPCs移植能改善PH的肺動(dòng)脈高壓的狀態(tài)，所有的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象目前只局限于動(dòng)物，而每次外周血的采集能力有限，對(duì)于多次分離培養(yǎng)對(duì)治療效果有沒有效果仍然未知，關(guān)于其具體的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步探究。

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（編校：吳茜）

The change of TXA2 and PGI2 in Rabbitmodel of pulmonary hypertension after progenitor cell transplantation

YANG Zhi-yu，XIA Yue，QIGuo-qing

（Department of Cardiology，The First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo discuss the changes of plasma TXA2 and PGI2 levels in the rabbitmodel of pulmonary hypertension（PHA）induced by monocrotaline（MCT）when transplanted with endothelial progenitor cells（EPCs）.MethodsThe rabbit pulmonary hypertensionmodelwas constructed by MCT induction.Rabbit endothelial progenitor cells were induced，separated and identified in vitro.50 New Zealand white rabbits were random ly divided into 3 groups，normal control group and model group were given M199 culturemedium by tail vein injection，EPCs treatment group were given EPCsmarked with fluorescent though tail vein injection.The levels of plasma TXB2 and 6-keto-PGF1αwere detected and their ratiowere calculated after three weeks.ResultsCompared with model group，the content of 6-keto-PGFlαin plasma in EPCs group was（130.67±17.54）umol／L，which was increased sinnificantly.The content of TXB2 was（402.89±27.98）u mol／L，which was decreased significantly.The ratio of TXB2 to 6-keto-PGF1 alpha between two groups was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionEPCs transplantation can reduce the content of TXA2 and increase the content of PGI2 in the pulmonary hypertension rabbits induced bymonocrotaline，then reverse the damage of pulmonary hypertension.

endothelial progenitor cells；pulmonary arterial hypertension；TXA2；PGI2

R453.9

A

1005－1678（2014）03－0031－04

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）在肺部循環(huán)疾病中占據(jù)重要位置，是由多種因素如心、肺本身或全身性疾病引起的在臨床中表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壓進(jìn)行性增高的一種疾?。?］。PAH的發(fā)病機(jī)制由多種因素共同參與，牽涉到多種生物學(xué)途徑。目前，在PAH的臨床治療中，主要通過延緩患者臨床癥狀的進(jìn)展來控制疾病發(fā)展，從而達(dá)到延長(zhǎng)患者壽命的目的。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞在PAH的發(fā)展進(jìn)程中，具有重要作用［2-3］。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種前體細(xì)胞，能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)維持正常內(nèi)皮功能起重要作用，對(duì)PAH患者進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞移植，在體內(nèi)可募集、歸巢到血管損傷區(qū)，促進(jìn)血管損傷后內(nèi)皮修復(fù)、減少內(nèi)膜增生，糾正內(nèi)皮功能從而改善肺動(dòng)脈高壓癥狀［4］。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以分泌一些調(diào)節(jié)肺血管舒張度及血栓形成的各種活性物質(zhì)如前列環(huán)素、血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）。前列腺素不但具有舒張血管及抗血小板聚集作用，而且還有抗增殖作用，TXA2具有強(qiáng)效血管收縮和血小板促凝作用，因此前列腺素和血栓A2代謝失調(diào)在PAH形成的過程中具有重要作用［5］。本試驗(yàn)擬運(yùn)用野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導(dǎo)兔PAH模型，收集培養(yǎng)兔外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)、分化為EPCs，經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)行移植手術(shù)。TXA2在體內(nèi)極不穩(wěn)定，會(huì)快速代謝為穩(wěn)定的化合物TXB2；前列腺素I2（prostaglandin I2，PGI2）的半衰期也很短，但其代謝物6-酮-前列腺素1α（6-keto-prostaglandin F1 alpha，6-keto-PGF1α）卻非常穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)中擬采用檢測(cè)TXB2、6-keto-PGF1α的含量并計(jì)算TXB2／6-keto-PGF1α的比值來間接表征TXA2、PGI2的變化關(guān)系，以期更好的研究EPCs移植對(duì)PAH的影響。

楊志瑜，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心血管疾病，E-mail：yangzhiyuhrz＠126.com。