補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)A549／DDP細(xì)胞PI3K、AKT、Survivin表達(dá)的影響

于丹，于寧，易佳麗，唐瑩，劉春英Δ

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032；3.遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 教務(wù)處，遼寧 沈陽(yáng) 110101）

補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)A549／DDP細(xì)胞PI3K、AKT、Survivin表達(dá)的影響

于丹1，于寧2，易佳麗3，唐瑩1，劉春英1Δ

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032；3.遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 教務(wù)處，遼寧 沈陽(yáng) 110101）

目的觀察補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株（A549／DDP）磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、絲／蘇氨酸蛋白激酶（protein kinase B，AKT）、生存素（Survivin）蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法制備中劑量補(bǔ)中益氣湯含藥血清（0.576 g／mL），將A549／DDP細(xì)胞分成4組：空白血清組、最佳含藥血清組、LY294002組、最佳含藥血清組＋LY294002組（即聯(lián)合組）。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫蛋白印跡法（western blot）方法檢測(cè)PI3K、AKT和Survivin蛋白的表達(dá)。結(jié)果最佳含藥血清組和聯(lián)合組PI3K、AKT、Survivin蛋白的表達(dá)顯著低于空白血清組（P＜0.05），聯(lián)合組PI3K、AKT、Survivin蛋白減少的更加明顯，但與最佳含藥血清組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LY294002組Survivin蛋白的表達(dá)明顯低于空白血清對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論補(bǔ)中益氣湯含藥血清作用于PI3K／AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能降低肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株P(guān)I3K、AKT、Survivin蛋白的表達(dá)，提高A549／DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株；補(bǔ)中益氣湯含藥血清；磷脂酰肌醇3激酶；絲／蘇氨酸蛋白激酶；生存素

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物部提供SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，動(dòng)物許可證號(hào)：遼實(shí)動(dòng)質(zhì)（字）（2012-0012號(hào)）。人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549／DDP由中國(guó)醫(yī)科院腫瘤研究中心細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清（FBS）、高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司。美國(guó)PI3K、AKT抗體購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。Triozol Reagent購(gòu)于美國(guó) Invitrogen Life technologies公司；青霉素由東北制藥生產(chǎn)（國(guó)藥準(zhǔn)字H21022424），鏈霉素購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。鼠抗人Survivin單克隆抗體購(gòu)于PTGLAB公司，羊抗兔熒光二抗購(gòu)于凱基生物技術(shù)有限公司。

1.3 補(bǔ)中益氣湯含藥血清制備 根據(jù)《方劑學(xué)》規(guī)定補(bǔ)中益氣湯用藥劑量（黃芪18 g，白術(shù)9 g，柴胡6 g，甘草9 g，人參6 g，當(dāng)歸 3 g，人參6 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術(shù)9 g），按“動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”計(jì)算大鼠的等效用藥劑量。實(shí)驗(yàn)所用中藥全部購(gòu)于遼寧中醫(yī)院。所用藥材經(jīng)冷水浸泡、煮沸過(guò)濾2次，于水浴上濃縮待冷去后放入4℃冰箱保存。本次實(shí)驗(yàn)采用臨床常用人劑量的中劑量按照“動(dòng)物與人的每千克體重劑量折算系數(shù)表”轉(zhuǎn)換成大鼠的中劑量，即含藥0.576 g／mL。SD大鼠灌胃給藥每日一次，連續(xù)3 d，末次給藥1 h后，麻醉，腹主動(dòng)脈采血，無(wú)菌管靜置30min后，離心，取上清，56℃水浴滅活，過(guò)濾除菌，分裝，－20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 A549／DDP細(xì)胞培養(yǎng) A549／DDP細(xì)胞株在37℃，95%濕度，5%C02條件下培養(yǎng)，含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液中、含青霉素100U／mL，鏈霉素100 ug／mL，0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2天換液一次，每3天傳代一次。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)PI3K、AKT、Survivin蛋白表達(dá)

將進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549／DDP細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白血清組、最佳含藥血清組、LY294002組、LY294002＋最佳含藥血清組（聯(lián)合組）。分別加入含10%SD大鼠空白血清、10%中劑量補(bǔ)中益氣湯含藥血清［3］、含濃度為20μM LY294002的10%SD大鼠空白血清和含1μL／100μL LY294002的10%中劑量補(bǔ)中益氣湯含藥血清。培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20min，10%山羊血清封閉30min，一抗孵育，4℃過(guò)夜，加二抗作用30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。采用Image Pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，在400倍高倍鏡下，隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野為2592×1944像素點(diǎn)，分別測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的總面和積分光密度，求出平均光密度（average optical density，AOD）。

2.2 免疫印跡法檢測(cè) A549／DDP細(xì)胞株中 PI3K、AKT、Survivin蛋白的表達(dá) 將A549／DDP細(xì)胞株隨機(jī)分為4組，接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，具體分組及處理方法參照上述免疫細(xì)胞化學(xué)法，培養(yǎng)48 h后，提取總蛋白，4℃離心10min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，與5×SDS上樣緩沖液煮沸5min，每孔加樣10μg，SDS-PAGE凝膠電泳，72 V恒壓轉(zhuǎn)移2 h或者35 V轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，5%的脫脂奶粉封閉2 h。一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗4次，在暗室用ECL發(fā)光，圖像掃描并分析結(jié)果。采用所測(cè)蛋白條帶與內(nèi)參條帶的光密度比值來(lái)表示蛋白的表達(dá)水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組A549／DDP細(xì)胞PI3K、AKT蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示，PI3K、AKT蛋白的表達(dá)具有較高的一致性，空白血清組及LY294002組兩種蛋白的表達(dá)水平較高，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)粗大的棕黃色顆粒（見(jiàn)圖1、圖2）。LY294002組比較空白血清組，測(cè)得的AOD值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3）。最佳含藥血清組與聯(lián)合組PI3K、AKT蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布均明顯減少，僅能看見(jiàn)少量，染色較淺的棕黃顆粒，2組數(shù)據(jù)分別與空白血清組比較，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3）。且聯(lián)合組較最佳含藥血清組PI3K、AKT蛋白減少的更加明顯。

圖1 各組A549／DDP細(xì)胞PI3K蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果（×200）Fig.1 Immunohistochemical results of PI3K protein expression in A549／DDP cell（×200）

圖2 各組A549／DDP細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果（×200）Fig.2 Immunohistochemical results of AKT protein expression in A549／DDP cell（×200）

圖3 PI3K、AKT在各組 A549／DDP細(xì)胞中的AOD值*P＜0.05，與空白血清組比較Fig.3 AOD value of PI3K and p-AKT in A549／DDP cell*P＜0.05，compared with control serum group

3.2 A549／DDP細(xì)胞中 PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況Western blot結(jié)果顯示，A549／DDP最佳含藥血清組及聯(lián)合組的PI3K、AKT蛋白表達(dá)均明顯低于空白血清對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LY294002組細(xì)胞內(nèi) PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平與空白血清對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖 4）。

圖4 Western blot技術(shù)檢測(cè)A549／DDP細(xì)胞PI3K、AKT蛋白的表達(dá)1.聯(lián)合組；2.LY294002組；3.最佳含藥血清組；4.空白血清組Fig.4 Expression of PI3K and AKT by western blotmethod

3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)A549／DDP細(xì)胞中Survivin表達(dá) Survivin蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中均有表達(dá)。A549／DDP空白血清組中Survivin表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，可見(jiàn)大量粗大的棕黃色顆粒，顏色較深。最佳含藥血清組、LY294002組和聯(lián)合組，Survivin蛋白表達(dá)的較少，棕黃色的顆粒密度較低，顏色較淺，明顯低于空白血清對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖5）。聯(lián)合組Survivin蛋白表達(dá)減少的更加明顯。各組Survivin蛋白表達(dá)的光密度值見(jiàn)圖6。

圖5 各組A549／DDP細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果（×200）Fig.5 Expression of Survivin in A549／DDP（×200）

圖6 PI3K、AKT在各組A549／DDP細(xì)胞中的AOD值*P＜0.05，與空白血清組比較Fig.6 AOD for Survivin expression in A549／DDP cell*P＜0.05，compared with control serum group

3.4 Western blot技術(shù)檢測(cè)各組A549／DDP細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，A549／DDP最佳含藥血清組、LY294002組及聯(lián)合組的Survivin蛋白表達(dá)均明顯低于空白血清對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖7）。

圖7 Western blot檢測(cè)A549／DDP細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)1.空白血清組；2.最佳含藥血清組；3.LY294002組；4.聯(lián)合組Fig.7 Expression of Survivin by western blotmethod 1.control serum group；2.the bestmedicated serum group；3.LY294002（blockers）group；4.LY294002＋bestmedicated serum group

4 討論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤，全球每年死于肺癌人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，約85%為非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）［7］?；熓桥R床常用的治療手段，而惡性腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性是腫瘤化療的主要障礙［8］。如何解決腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性成為腫瘤治療中丞待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。補(bǔ)中益氣湯有補(bǔ)中益氣，升陽(yáng)舉陷之功效。方中黃芪，補(bǔ)益中士，溫養(yǎng)脾胃；方中人參、白術(shù)、甘草，甘溫益氣，補(bǔ)益脾胃［9］。臨床將補(bǔ)中益氣湯應(yīng)用于肺癌的治療，能夠提高患者免疫力，補(bǔ)氣健脾，減輕化療副反應(yīng)，有效改善肺癌耐藥，提高臨床治療效果［10-11］。

PI3K／Akt信號(hào)通路與肺腺癌的細(xì)胞增殖、存活、耐藥密切相關(guān)。PI3K由異源二聚體復(fù)合物組成，包括有一個(gè)催化亞單位（p110）和調(diào)節(jié)亞單位（p85）［12］。Akt基因又被稱為蛋白激酶 B，是PI3K下游的作用靶點(diǎn)。Akt是化療耐藥的中樞介質(zhì)，研究表明抑制Akt，阻止Akt的磷酸化，可以中斷PI3K／Akt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低化療的耐藥性［13-14］，Brognard等［15］報(bào)道 PI3K活化的非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)用PI3K的抑制劑可使肺癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性增加。

本研究根據(jù)中藥血清藥理學(xué)理論制備補(bǔ)中益氣湯含藥血清，根據(jù)前期的研究結(jié)果，采用已篩選出來(lái)的最佳換藥血清濃度，即10%中劑量的含藥血清作用于A549／DDP細(xì)胞48 h。免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blot法結(jié)果一致，最佳含藥血清組和聯(lián)合組PI3K、Akt的表達(dá)均明顯減少，與空白血清對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明補(bǔ)中益氣湯含藥血清能夠有效降低PI3K、Akt蛋白的表達(dá)，影響PI3K／Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中聯(lián)合組較最佳含藥血清組PI3K、Akt蛋白減少的更加明顯，分析補(bǔ)中益氣湯含藥血清與LY294002可能存在著協(xié)同作用。LY294002是PI3K／Akt信號(hào)通路的抑制劑，具有靶向抑制PI3K催化亞基p110的作用，PI3K阻斷劑作用于亞基p110，抑制Akt磷酸化，使磷酸化的 Akt（p-Akt）減少［4］，阻斷 PI3K／Akt通路在肺癌順鉑耐藥中的作用，但對(duì)PI3K、Akt這2種蛋白的總體表達(dá)影響不大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明LY294002組PI3K、Akt蛋白表達(dá)與空白血清對(duì)照組相比，2種蛋白的表達(dá)并沒(méi)有明顯的變化。

Survivin是凋亡抑制蛋白IPA家族成員，又名存活素，是凋亡抑制最強(qiáng)的因子。直接抑制半胱氨酸天冬氨酸酶-3、半胱氨酸天冬氨酸酶-7（Caspase-3、Caspase-7）的活性［16］，阻斷細(xì)胞凋亡。Survivin蛋白在正常分化組織中幾乎不表達(dá)，但在大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)。有報(bào)道，部分腫瘤Survivin的表達(dá)與AKT的活性是密切相關(guān)的［17］。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)A549／DDP細(xì)胞Survivin蛋白進(jìn)行定位和定量分析，免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western blot法結(jié)果顯示，最佳含藥血清組、LY294002組、聯(lián)合組Survivin蛋白的表達(dá)下降，與空白血清對(duì)照組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明補(bǔ)中益氣湯能夠有效的降低A549／DDP細(xì)胞內(nèi)Survivin的表達(dá)。Survivin作為PI3K／Akt細(xì)胞信號(hào)通路的下游因子，其表達(dá)的下調(diào)與PI3K、Akt蛋白表達(dá)的減少存在一定的相關(guān)性，推測(cè)補(bǔ)中益氣湯含藥血清通過(guò)降低PI3K、Akt蛋白的表達(dá)進(jìn)一步調(diào)節(jié)Survivin活性，以實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)肺腺癌順鉑耐藥。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，補(bǔ)中益氣湯含藥血清以PI3K／Akt信號(hào)通路為靶點(diǎn)，下調(diào)PI3K、Akt蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)以提高A549／DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。補(bǔ)中益氣湯含藥血清降低肺癌順鉑耐藥為多靶向，多作用位點(diǎn)，具體機(jī)制仍有待于更進(jìn)一步的研究。

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（編校：吳茜）

Effect of Buzhong Yiqi Decoction medicated serum to the expression of PI3K、AKT、Survivin in lung adenocarcinoma cell lines A549／DDP

YU Dan1，YU Ning2，YIJia-li3，TANG Ying1，LIU Chun-ying1Δ

（1.Preclinical Medicine Academy，Liaoning university of traditional Chinesemedicine College，Shenyang 110032，China；
2.The First Clinical Academy，Liaoning university of traditional Chinesemedicine，Shenyang 110032，China；
3.Dean’s Office，Liaoning College of Health Vocational Technology，Shenyang 110101，China）

ObjectiveTo observe the effectof Buzhong Yiqi Decoctionmedicated serum on PI3K、AKT、survivin in lung adenocarcinoma A549／DDP cells，and explore its functionalmechanism.MethodsBuzhong Yiqi Decoction medicated serum ofmiddle dosage（0.576 g／mL）were prepared，and A549／DDP cellswere divided into four groups：blank serum group，the best containingmedicine serum group and LY294002 group（blockers group），the best containing medicine serum＋LY294002 group（combination group）.The protein expression of PI3K，AKT and Survivin were detected by Immunocytochemistry and Western blot.ResultsComparewith blank serum group，the protein expression of PI3K、AKT and Survivin in best containing medicine serum and combination group were significantly lower（P＜0.05），and the later was more lower，but there was no significant differences between best containingmedicine serum and combination group.The expression of survivin in LY294002 group were significantly lower than blank serum group（P＜0.05）.ConclusionBuzhong Yiqi Decoction can reduce the protein expression of PI3K，AKT and surviving，increase the sensitivity of A549／DDP to DDP through PI3K／AKT signal transduction pathway.

A549／DDP；Buzhong Yiqi Decoctionmedicated serum；PI3K；AKT；Survivin

R734.2

A

1005－1678（2014）03－0004－04

肺癌的發(fā)病率在世界范圍呈明顯增高趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織報(bào)告肺癌將是21世紀(jì)危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一［1］?；瘜W(xué)藥物治療是綜合治療肺癌的重要手段，但是肺癌細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的耐受，使得非小細(xì)胞肺癌的5年生存率不超過(guò)20%［2］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為正氣虛損是肺癌順鉑耐藥的主要原因，已有研究表明［3-4］，培土生金法可有效干預(yù)肺癌順鉑耐藥。補(bǔ)中益氣湯為培土生金中藥代表方劑，臨床應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯以減輕化療引起的不良反應(yīng)，改善肺癌耐藥，但機(jī)制尚不清楚。磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化、腫瘤的血管形成和轉(zhuǎn)移等方面起著重要的作用［5］。近幾年，已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道PI3K／Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常與腫瘤生長(zhǎng)、維持和化療耐藥等方面有關(guān)［6］。本研究通過(guò)血清藥理學(xué)方法，觀察補(bǔ)中益氣湯藥對(duì)A549／DDP細(xì)胞PI3K、Akt及Survivin蛋白表達(dá)的影響，以期從分子生物學(xué)水平探討補(bǔ)中益氣湯逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥的具體機(jī)制。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81072743）

于丹，女，博士生，講師，研究方向：中藥干預(yù)腫瘤細(xì)胞凋亡，E-mail：yudanzzm＠163.com；劉春英，通信作者，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥抗腫瘤作用機(jī)制研究，E-mail：chunying99＠163.com。