葛花總黃酮對阿霉素所致中毒性心肌炎的保護(hù)作用研究

徐慶國，談金強，宋希林，陳沅

（1.山東省交通醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)南250031；2.山東省濟(jì)陽縣人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)陽251400；3.山東省腫瘤醫(yī)院胃腸外科，山東濟(jì)南250012；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，重慶400010）

葛花總黃酮對阿霉素所致中毒性心肌炎的保護(hù)作用研究

徐慶國1，談金強2，宋希林3，陳沅4

（1.山東省交通醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)南250031；2.山東省濟(jì)陽縣人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)陽251400；3.山東省腫瘤醫(yī)院胃腸外科，山東濟(jì)南250012；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，重慶400010）

目的探討葛花總黃酮對阿霉素中毒性心肌炎的保護(hù)作用及其機制。方法健康昆明種小鼠96只，雄雌不拘，分為6組，每組16只。正常對照組(control）：每天經(jīng)口灌胃(ig）生理鹽水(NS）20mL/kg，并于實驗第2天起，腹腔注射(ip）NS 10mL/kg，隔天1次，共7次；阿霉素模型對照組(model）：每天ig 20mL/kg NS，同時于實驗第2天起，ip阿霉素3mg/kg，隔天1次，共7次；阿霉素+葛花總黃酮小劑量組(50mg/kg）；阿霉素+葛花總黃酮中劑量組(100mg/kg）；阿霉素+葛花總黃酮大劑量組(200mg/kg）；維生素E陽性對照組(Vit E）：造模同阿霉素模型對照組，同時每天ig Vit E 0.04 g/kg。阿霉素+葛花總黃酮各組的造模方法同阿霉素模型對照組，同時每天分別ig葛花總黃酮相應(yīng)劑量，各組實驗連續(xù)進(jìn)行15 d。采用HE染色檢測心肌組織結(jié)構(gòu)變化，采用免疫組織法檢測心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)情況，并進(jìn)行組織學(xué)檢查，觀察心肌結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果與正常對照組比較，阿霉素(3mg/kg，ip，7次）可致小鼠血清肌酸激酶(CK）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT）、乳酸脫氫酶(LDH）和iNOS活力均顯著升高(P＜0.01），同時使心肌丙二醛(MDA）含量明顯上升(P＜0.01），而超氧化物歧化酶(SOD）活力則顯著下降(P＜0.01）。另外，小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯升高，細(xì)胞凋亡率達(dá)(40.5±5.2）%，凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2含量均明顯升高，與正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.01），但Bcl-2/Bax值降低。葛花總黃酮(50、100、200mg/kg，15 d）和Vit E組劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)阿霉素所致的上述改變，表現(xiàn)為降低小鼠血清CK、GOT、LDH和iNOS活力，降低心肌MDA含量和增加SOD活力，降低促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)，使Bcl-2/Bax值增加，尤其以高劑量組作用最為明顯。光鏡和電鏡結(jié)果對心肌形態(tài)學(xué)的觀察也證實了葛花總黃酮對阿霉素中毒性心肌炎保護(hù)作用。結(jié)論阿霉素可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，引起實驗小鼠中毒性心肌炎。葛花總黃酮能拮抗阿霉素所致的心肌損傷，其作用機制與增強心肌SOD活力和抗心肌脂質(zhì)過氧化、降低凋亡基因Bax蛋白表達(dá)等有關(guān)。

葛花總黃酮；阿霉素；脂質(zhì)過氧化；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2；

阿霉素（adriamycin，ADR）屬于蒽環(huán)類抗生素［1］，從松鏈絲菌淺灰色變株（Str.peucetius-var.caseus）中提取，有一個四環(huán)的發(fā)色基團(tuán)，第14位C加上一個羥基（-OH）［2］。從20世紀(jì)60年代開始，阿霉素廣泛用于白血病、惡性淋巴瘤、乳癌、肺癌等多種癌癥的治療，是一種高效的廣譜抗腫瘤藥物，其療效顯著，且價格相對低廉，至今仍然是臨床一線抗癌用藥物［3-7］。本實驗首先提取、分離葛花中的黃酮類化合物，并測定其總黃酮的產(chǎn)率和濃度；然后再通過建立阿霉素中毒性心肌炎小鼠模型，研究葛花總黃酮對阿霉素所致中毒性心肌炎的保護(hù)作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 干葛花（經(jīng)鑒定為豆科蝶形花亞科葛屬植物野葛的干燥花蕾，江西省橫峰縣葛源鎮(zhèn)葛源綠山葛粉廠）。注射用鹽酸阿霉素（鹽酸多柔比星），浙江海正藥業(yè)股份有限公司，每瓶10mg。維生素E（Vit E）膠丸，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，每粒100mg，用植物油溶解配制。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induciblenitric oxide synthase，iNOS）測試盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒為德國寶靈曼公司產(chǎn)品。Bcl-2、Bax多克隆抗體試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物 健康昆明種小鼠96只，動物許可證號：SCXK-（吉）2003-20 l4，雄雌不拘，分為6組，每組16只，體質(zhì)量25～30 g。動物室飼養(yǎng)溫度（23±2）℃、濕度0.50～0.60、人工光照明暗各12 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料。本實驗遵循《實驗動物保護(hù)條例》。

1.3 實驗方法

①正常對照組（control）：每天經(jīng)口灌胃（ig）生理鹽水（NS）20mL/kg，并于實驗第2天起，腹腔注射（ip）NS 10mL/kg，隔天1次，共7次；

②阿霉素模型對照組（model）：每天ig 20mL/kg NS，同時于實驗第2天起，ip阿霉素3mg/kg，隔天1次，共7次；

③阿霉素+葛花總黃酮小劑量組（50 mg/kg）：每天ig 50 mL/kg NS，同時于實驗第2天起，ip阿霉素50mg/kg，隔天1次，連續(xù)進(jìn)行15 d；

④阿霉素+葛花總黃酮中劑量組（100mg/kg）：每天ig 100 mL/kg NS，同時于實驗第2天起，ip阿霉素100 mg/kg，隔天1次，連續(xù)進(jìn)行15 d；

⑤阿霉素+葛花總黃酮大劑量組（200mg/kg）：每天ig 200 mL/kg NS，同時于實驗第2天起，ip阿霉素200 mg/kg，隔天1次，連續(xù)進(jìn)行15 d；

⑥維生素E陽性對照組（Vit E）：造模同第②組，同時每天ig Vit E 0.04 g/kg。

阿霉素+葛花總黃酮各組的造模方法同第②組，同時每天分別ig葛花總黃酮相應(yīng)劑量，各組實驗連續(xù)進(jìn)行15 d。采用HE染色檢測心肌組織結(jié)構(gòu)變化，采用免疫組織法檢測心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)情況，并進(jìn)行組織學(xué)檢查，觀察心肌結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況與存活率 小鼠一般情況與存活率：正常對照組小鼠精神活動狀況良好，進(jìn)食正常，體質(zhì)量增長正常，未出現(xiàn)死亡。阿霉素模型對照組小鼠第6天后活動減少，攝食減少，步態(tài)蹣跚，精神萎靡，體質(zhì)量開始下降，10 d時體質(zhì)量降低明顯，被捕捉時掙扎少，少數(shù)出現(xiàn)腹瀉腹脹中毒癥狀；第12天以后出現(xiàn)死亡，解剖可見胸腔和腹腔均有少量積液，腸道脹氣多見。葛花各劑量組和Vit E組小鼠精神狀況比阿霉素模型對照組好，但與正常對照組相比，一般情況較差，各組小鼠存活率見表1。

表1 各組小鼠存活率比較Tab.1 Groups ofmice survival rate

2.2 小鼠各組心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比（HW/BW） 各組心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比（HW/BW）：實驗結(jié)束后，阿霉素模型對照組和葛花小劑量組HW/BW明顯降低，和正常對照組比較差異均有顯著性（P＜0.05）。葛花總黃酮和Vit E可使HW/BW比值升高，尤其是葛花高劑量組作用較為明顯，與阿霉素模型對照組比較差異均有顯著性（P＜0.05）。

表2 各組小鼠HW/BW的變化比較（n=10）Tab.2 Comparison of each group ofmice HW/BW change（n=10）

2.3 血清生化指標(biāo) 血清CK、LDH和GOT活性變化：阿霉素模型對照組小鼠血清CK、LDH和GOT活力均高于正常對照組，2組比較均有非常統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。葛花各劑量組CK、LDH和GOT活力較阿霉素模型對照組降低，2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。Vit E組對CK、LDH和GOT活力有抑制作用，和阿霉素模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 各組小鼠血清CK、LDH和GOT活性變化比較（n=10）Tab.3 The comparison of serum CK，LDH and GOT activeness change（n=10）

2.4 心肌生化指標(biāo) 心肌SOD活性、MDA含量和血清iNOS活性變化：與正常對照組比較，阿霉素模型對照組心肌組織SOD活性下降，心肌MDA含量和血清iNOS活力增加，2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。葛花各劑量組和Vit E組小鼠心肌MDA含量下降，SOD活力升高，與阿霉素模型對照組比較，差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）；葛花中、高劑量組還能使血清iNOS活力下降，與阿霉素模型對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）。

表4 各組小鼠心肌SOD活性、MDA含量和血清iNOS活性變化比較（n=10）Tab.4 The comparison ofmicemyocardial SOD activity，MDA content and serum iNOS activity in each group（n=10）

2.5 心肌形態(tài)學(xué)指標(biāo) 光鏡下觀察，如圖1所示：正常對照組：心肌組織結(jié)構(gòu)層次清晰，細(xì)胞間隙正常，無水腫，無心肌纖維破壞，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻，胞膜完整，核清晰可見；阿霉素模型對照組：心肌細(xì)胞空泡變，大片壞死，肌纖維斷裂；葛花小劑量組：大片壞死，肌纖維斷裂，炎性細(xì)胞浸潤；葛花中劑量組：心肌細(xì)胞病理改變輕微；葛花高劑量組：心肌細(xì)胞未見病理改變；Vit E組：心肌細(xì)胞未見病理改變。

圖1 各組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)變化（HE，×400）Fig.1 Groups ofmicemyocardial tissue structure change（HE，×400）

2.6 心肌細(xì)胞凋亡陽性率及心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá) 如表5阿霉素模型對照組凋亡心肌細(xì)胞較多，為棕褐色深淺不一的凋亡小體，與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。葛花高劑量組和Vit E組棕褐色凋亡細(xì)胞明顯減少，與阿霉素模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。

阿霉素模型對照組Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá)較正常對照組明顯增加，2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。葛花各劑量組和Vit E組Bax基因蛋白表達(dá)較阿霉素模型對照組顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），而Bcl-2基因蛋白的表達(dá)與阿霉素模型對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，但是Bcl-2/Bax比值高于阿霉素模型對照組。

表5 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡陽性率及心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá)比較（n=10）Tab.5 Groups ofmicemyocardial apoptosis positive rate and themyocardial cells the Bcl-2 and Bax genes protein expression is（n=10）

3 結(jié)論

以阿霉素（多柔比星）、表阿霉素（表柔比星）和吡喃阿霉素（吡柔比星）為代表的蒽環(huán)類抗癌藥（ATC），是近40年來被廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤譜較廣，抗癌作用強，化療指數(shù)較高，對造血系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤具有高效作用，對于在年輕人群中發(fā)病率高而且有望治愈的腫瘤，如急性白血病、霍奇金淋巴瘤以及乳腺癌等更具有不可替代的作用［8-13］。在本實驗中，通過對模型對照組小鼠經(jīng)口灌胃（ig）阿霉素3 mg/kg（隔天1次，共7次）。實驗結(jié)束后，和正常對照組比較，阿霉素模型對照組HW/ BW明顯降低，血清CK、LDH、GOT和iNOS活力均增高，心肌組織SOD活性下降、MDA含量增加，2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）；鏡下觀察，阿霉素模型對照組心肌損傷明顯，心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞部分呈現(xiàn)水腫和空泡變性，部分呈現(xiàn)灶狀或片狀壞死，肌間隙變寬，部分肌纖維溶解、心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞間有中性粒細(xì)胞及單核、淋巴細(xì)胞浸潤。說明本實驗阿霉素所致小鼠中毒性心肌炎造模成功。

阿霉素模型對照組Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá)較正常對照組明顯增加，2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。葛花各劑量組和Vit E組Bax基因蛋白表達(dá)較阿霉素模型對照組顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），而Bcl-2基因蛋白的表達(dá)與阿霉素模型對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，但是Bcl-2/Bax比值高于阿霉素模型對照組。表明阿霉素可導(dǎo)致小鼠心肌Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)明顯增加，且Bcl-2/Bax比值最小，促凋亡基因Bax蛋白占主導(dǎo)地位，使小鼠心肌細(xì)胞凋亡增加；葛花總黃酮能使促凋亡基因Bax蛋白的表達(dá)明顯降低，同時葛花總黃酮和Vit E對阿霉素所誘發(fā)的抑制凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)增加無拮抗作用。

在本實驗中阿霉素抑制了SOD的活性，使得本來含有較少的SOD等酶的心肌組織，抗自由基酶進(jìn)一步耗盡，從而使自由基大量產(chǎn)生、蓄積，心肌不可避免受到損傷，脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物MDA的含量亦增多；葛花總黃酮可以增強SOD活性，抑制MDA含量的升高，減少LDH的漏出，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，同時具有抗脂質(zhì)過氧化作用，使之具有保護(hù)阿霉素中毒心肌細(xì)胞的功效?？怪|(zhì)過氧化可能是葛花保護(hù)阿霉素心肌細(xì)胞毒性機制之一，但這種保護(hù)作用的確切機制有待于進(jìn)一步探討。

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（編校：譚玲）

Protective effect of flos puerariae flavonoid on adriam ycin-induced toxic m yocarditis

XU Qing-guo1，TAN Jin-qiang2，SONG Xi-lin3，CHEN Yuan4

（1.Department of Cardiology，Shandong Provincal Traffic Hospital，Jinan 250031，China；2 Department of Cardiology，People's Hospital of Jiyang County，Jiyang 251400，China；3.Department of Gastrointestinal Surgery，Tumor Hospital of Shandong Province，Ji'nan 250012，
China；4.Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of flos puerariae flavonoid on adriamycin（ADR）-induced toxic myocarditis and its mechanisms from morphological，biochemical and molecular levels.Methods96 healthy Kunming male mice were random ly divided into 6 groups：normal control group，ADRmodel control group，ADR+low dose of flos puerariae flavonoid group（50mg/kg），ADR+middle dose of flos puerariae flavonoid group（100mg/kg），ADR+high dose of flos puerariae flavonoid group（200mg/kg），and Vit E positive control group（40mg/kg），16 in each group.The drugswere orally administered for consecutive 15 d and themodelof toxicmyocarditiswas induced by intraperitoneal injection of ADR（3mg/ kg）in mice from day 2，one time every other day，for 7 times Colorimetry was used tomeasure the changes ofmarker enzymes aboutmyocardial injury and inducible nitric oxide synthase（iNOS）activity in serum and tissue；immunohistochemicalmethod was adopted to detecte the expression ofmyocardial apoptosis related proteins Bax and bcl-2；HE staining was conducted to observe the pathological changes of cardiac structure.ResultsCompared with normal control group，ADR（3 mg/kg，ip，7 times）induced the elevation of serum creatine kinase（CK），lactate dehydrogenase（LDH），aspartate transaminase（GOT）and iNOS activity increased significantly in mice（P＜0.01）.Meanwhilemyocardial superoxide dismutase（SOD）activity decreased，and themalondialdehyde（MDA）content increased（P＜0.01）.Myocardial cell apoptosis inmice increased significantly，and the apoptosis rate was（40.5±5.2）%；the expressions of Bax and Bcl-2 were significantly increased（P＜0.01），However，the Bcl-2/Bax ratio decreased.The flos puerariae flavonoid（50，100，200mg/kg，ig，15 d）and Vit E positive control group could reverse the changes induced by ADR，decrease serum CK，LDH，GOT and iNOS activities，increased myocardial SOD activity，lower MDA content and the expression of bax protein，and elevated Bcl-2/Bax ratio，in a dosedependentmanner.Lightmicroscopy confirmed that flos puerariae flavonoid significantly alleviated the changes ofmyocardialmicrostructure.ConclusionADR could inducemyocardial cell apoptosis and lead toxic myocarditis in experimentalmice.The flos puerariae flavonoid has protective effect on ADR-induced myocardial injury and themechanism may be related to elevatingmyocardial SOD activity and anti-lipid peroxidation，inhibiting the expression of Bax protein and adriamycin-induced cardiomyocyte apoptosis.

flos puerariae flavonoid；adriamycin；myocardial lipid peroxidation；apoptosis；Bax；Bcl-2

R285

A

1005-1678(2014）07-0027-04

國家自然科學(xué)基金（C030306）

徐慶國，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：冠心病介入，E-mail：qch1821460091@163.com。