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    HPLC 同時(shí)分析芎菊上清丸中7個(gè)化學(xué)成分的含量研究

    2014-09-13 07:15:16孫承浩王吉華
    中國(guó)生化藥物雜志 2014年7期
    關(guān)鍵詞:?;?/a>小檗連翹

    孫承浩,王吉華

    (1.遼陽(yáng)市中心醫(yī)院,遼寧遼陽(yáng)111000;2.遼陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所,遼寧遼陽(yáng)111000)

    HPLC 同時(shí)分析芎菊上清丸中7個(gè)化學(xué)成分的含量研究

    孫承浩1,王吉華2

    (1.遼陽(yáng)市中心醫(yī)院,遼寧遼陽(yáng)111000;2.遼陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所,遼寧遼陽(yáng)111000)

    目的建立HPLC同時(shí)測(cè)定芎菊上清丸中7個(gè)活性成分(梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩帷Ⅺ}酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿)含量的方法。方法采用PorosheLL 120 SB-C18(100mm×3.0mm,2.7μm)色譜柱,柱溫30℃,以乙腈為流動(dòng)相A,0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B,梯度洗脫,流速1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm 0~4.5min(測(cè)定梔子苷),348 nm 4.5~9.0 min(測(cè)定連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩幔?,278 nm 9.0~15.0min(測(cè)定鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿)。結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的線性范圍分別為4.024~80.48μg/mL(r= 0.9991),2.042~40.84μg/mL(r=0.9993),3.956~79.12μg/mL(r=0.9996),6.090~121.80μg/mL(r=0.9990),4.026~80.52μg/ mL(r=0.9995),3.924~78.48μg/mL(r=0.9998),6.030~120.6μg/mL(r=0.9998)。平均加樣回收率(n=6)分別為96.5%,97.5%,95.9%,98.6%,99.8%,98.4%和97.3%;RSD分別為1.5%,1.3%,1.2%,1.4%,1.2%,1.1%和0.9%。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,為評(píng)價(jià)和監(jiān)控芎菊上清丸的質(zhì)量提供了可靠的方法。

    芎菊上清丸;HPLC;含量測(cè)定

    芎菊上清丸收載于《中國(guó)藥典》(2010版)一部,由川芎、菊花、黃芩、連翹、黃連等15味中藥材組成,具有清熱解表、散風(fēng)止痛之功效,用于外感風(fēng)邪引起的惡風(fēng)身熱、偏正頭痛、鼻流清涕、牙疼喉痛[1],含量測(cè)定項(xiàng)為薄層色譜掃描法測(cè)定黃連中鹽酸小檗堿的含量。藥典規(guī)定的含量測(cè)定方法基本上是在開(kāi)放體系中進(jìn)行,因此影響定量結(jié)果的因素較復(fù)雜,準(zhǔn)確性差。另?yè)?jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[2-5],可見(jiàn)對(duì)芎菊上清丸中黃芩苷、綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定的研究,未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定處方中多組分含量的研究報(bào)道。為了更好的評(píng)價(jià)和監(jiān)督芎菊上清丸的質(zhì)量,本文采用RP-HPLC梯度洗脫法在同一色譜條件下變換檢測(cè)波長(zhǎng)同時(shí)分析處方中5味藥材的7個(gè)特征性成分的含量。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑 Agilent 1260高效液相色譜儀系統(tǒng),由G1311A四元泵、G1314B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(VWD)、G1322A在線脫氣機(jī)組成。

    對(duì)照品梔子苷(批號(hào)為110749-201316)、連翹酯苷A(批號(hào)為111810-201103)、綠原酸(批號(hào)為110753-201314)、3,5-O-二咖啡?;鼘幩幔ㄅ?hào)為111782-201204)、黃芩苷(批號(hào)為110715-201117)、鹽酸藥根堿(批號(hào)為110733-201108)、鹽酸小檗堿(批號(hào)為110713-201212)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。供試品芎菊上清丸為北京同仁堂制藥有限公司提供,批號(hào)為2083068,2083079,3082187。

    甲醇、乙腈均為色譜純,水為重蒸水,其他所用試劑均為分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 溶液的制備:混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:取梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿等對(duì)照品適量,加甲醇制成每1mL分別含上述相應(yīng)物質(zhì)0.2012 mg、0.1021 mg、0.1978 mg、0.3045 mg、0.2013 mg、0.1962mg、0.3015mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

    混合對(duì)照品溶液:精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5.0mL于50mL容量瓶中,用60%甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,制得混合對(duì)照品溶液。

    供試品溶液:取芎菊上清丸10丸,稱定重量,剪碎,混勻,研細(xì),取3.0g,精密稱定,精密加入60%甲醇水溶液50mL,稱定重量,超聲處理(250 w,50 kHz)30min,放冷,稱重,用60%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量,離心,取上清液,即得。

    陰性樣品溶液:按芎菊上清丸的處方比例和工藝方法分別制備不含梔子、連翹、菊花、黃芩和黃連的5種陰性樣品,并按“1.2.1”項(xiàng)下供試品溶液方法制備陰性溶液。

    1.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn):色譜柱:安捷倫Poroshell 120 SB-C18(100mm×3.0 mm,2.7μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~5 min,8%A;5~10 min,8%A→20%A;10~15min,20%A→40%A);流速:1.0mL/ min;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm 0~4.5 min(測(cè)定梔子苷),348 nm 4.5~9.0min(測(cè)定連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩幔?,278 nm 9.0~15.0min(測(cè)定鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿);進(jìn)樣量:5μL。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算應(yīng)不低于5000,各峰的分離度均大于1.5。

    1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)芎菊上清丸樣品(批號(hào)2083068),稱定重量,研細(xì),取約3.0g,共6份,精密稱定,分別按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件分別進(jìn)樣5μL。

    1.2.4 回收率試驗(yàn):取已知含量的芎菊上清丸樣品(梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量分別為1.485,0.784,1.012,1.544,1.069,3.969,1.221mg/g)粉末6份,每份1.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加入新配置的混合對(duì)照品溶液(各對(duì)照品濃度為:梔子苷0.2024 mg/mL、連翹酯苷A 0.1154 mg/mL、綠原酸0.1520mg/mL、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?.2187mg/mL、鹽酸藥根堿0.1616mg/mL、黃芩苷0.6033 mg/mL、鹽酸小檗堿0.1979 mg/mL)10mL,再精密加入60%甲醇水溶液40mL,按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件分別進(jìn)樣5μL,計(jì)算回收率。

    2 結(jié)果

    2.1 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

    2.1.1 干擾性試驗(yàn):在上述色譜條件下,供試品中其他成分對(duì)梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的測(cè)定無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

    圖1 HPLC色譜圖A.混合對(duì)照品溶液;B.供試品溶液;C.梔子陰性溶液;D.連翹陰性溶液;E.菊花陰性溶液;F.黃芩陰性溶液;G.黃連陰性溶液吸收峰:1.梔子苷;2.連翹酯苷A;3.綠原酸;4.3,5-O-二咖啡?;鼘幩幔?.鹽酸藥根堿;6.黃芩苷;7.鹽酸小檗堿Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substances solution;B.sample solution;C-Fructus Gardeniae nagtive solvent;D.Forsythiae Fructus nagtive solvent;E.Flos Chrysanthemi nagtive solvent;F.Radix Scutellariae nagtive solvent;G.Rhizoma Coptidis nagtive solvent;1.Jasminoidin;2.Forsythoside A;3.Caffeotannic acid;4.3,5-Di-O-caffeoylquinic acid;5.Jatrorrhizine hydrochloride;6.Baicalin;7.Berberine hydrochloride

    2.1.2 線性關(guān)系考察:分別精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0,2.0,5.0,10.0,15.0,20.0mL于50mL容量瓶中,用60%甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,制得混合對(duì)照品系列濃度溶液,依次精密吸取上述混合對(duì)照品系列濃度溶液按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以樣品濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的線性關(guān)系詳見(jiàn)表1。

    表1 7個(gè)成分的線性關(guān)系Tab.1 Reasults of linear equations of 7 components

    2.1.3 精密度試驗(yàn):精密吸取同一混合對(duì)照品溶液5μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.6%,0.5%,1.0%,0.4%,0.7%,0.4%,0.6%。表明儀器精密度良好。

    2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液,在0,2,4,8,12,24 h分別進(jìn)樣5μL,結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩帷Ⅺ}酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.8%,1.2%,1.8%,1.6%,0.6%,0.7%,0.5%。表明供試品溶液中的7個(gè)待測(cè)成分在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn):樣品中的梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿含量平均值分別為1.485,0.784,1.012,1.544,1.069,3.969,1.221 mg/g;RSD分別為1.5%,0.9%,0.9%,1.2%,1.1%,1.3%,1.0%,表明其重復(fù)性良好。

    2.1.6 回收率試驗(yàn)結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的平均回收率(n=6)分別為96.5%,97.5%,95.9%,98.6%,99.8%,98.4%和97.3%;RSD分別為1.5%,1.3%,1.2%,1.4%,1.2%,1.1%和0.9%。

    2.2 樣品測(cè)定 取3種批號(hào)的芎菊上清丸,分別按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件分別進(jìn)樣5 μL,每批次樣品取樣2份,并進(jìn)行2次平行測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算含量,平均值結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 芎菊上清丸中7個(gè)活性成分的含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)Tab.1 The contents of seven active ingredients in Xiongju Shangqing pills(mg/g)

    3 討論

    3.1 提取條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別采用超聲提取、加熱回流方法對(duì)芎菊上清丸中7個(gè)成分的提取效率進(jìn)行考察,結(jié)果表明采用超聲提取法提取時(shí)效率更高,且相對(duì)簡(jiǎn)便易行;提取溶劑考察水、60%甲醇溶液、甲醇、乙酸乙酯等,結(jié)果表明,60%甲醇溶液與甲醇對(duì)7個(gè)成分綜合提取效率最高,二者相當(dāng),考慮到溶劑成本,采用60%甲醇溶液作提取溶劑;同時(shí)對(duì)60%甲醇溶液的用量(25、50、100mL)以及超聲時(shí)間(15、30、45min)進(jìn)行考察,最終確定提取條件為采用60%甲醇水溶液50 mL超聲處理30min。

    3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取混合對(duì)照品溶液,采用DAD檢測(cè)器,按上述色譜條件在200~400 nm范圍內(nèi)光譜掃描,兼顧7個(gè)成分的紫外最大吸收波長(zhǎng),最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm 0~4.5min(測(cè)定梔子苷),348 nm 4.5~9.0min(測(cè)定連翹酯苷A、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩幔?,278 nm 9.0~15.0min(測(cè)定鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿)。

    3.3 流動(dòng)相的確定 由于待測(cè)組分多,本實(shí)驗(yàn)采用HPLC梯度洗脫結(jié)合可變波長(zhǎng)進(jìn)行含量測(cè)定,分別考察3種溶劑系統(tǒng):甲醇-水、乙腈-水,乙腈-0.1%磷酸水溶液,結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相的峰型較好,分離效果較理想。參照相關(guān)文獻(xiàn)的液相洗脫條件[4-7],最終確定梯度洗脫條件。在15min內(nèi)完成對(duì)芎菊上清丸中7個(gè)活性成分的同時(shí)分析測(cè)定,大大縮短了分析時(shí)間。

    3.4 測(cè)定成分的選擇 芎菊上清丸現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2010年版一部,含量測(cè)定方法為薄層色譜掃描法檢測(cè)黃連中鹽酸小檗堿含量。芎菊上清丸由菊花、黃芩、連翹、黃連等15味中藥材制成,現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不能檢測(cè)出多種藥材的有效成分,且該方法基本上是在開(kāi)放體系中進(jìn)行,因此影響定量結(jié)果的因素較復(fù)雜,準(zhǔn)確性和重復(fù)性差,影響藥品質(zhì)量的評(píng)價(jià),不能有效的對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本文同時(shí)測(cè)定處方中5味主要中藥材的7個(gè)有效活性成分,并進(jìn)行定量分析,可以整體反映芎菊上清丸產(chǎn)品質(zhì)量,并節(jié)約提取溶劑及縮短分析時(shí)間。

    本文采用RP-HPLC梯度洗脫法在同一色譜條件下變換檢測(cè)波長(zhǎng)同時(shí)對(duì)處方中5味藥材的7個(gè)特征性成分(梔子苷、連翹酯苷A[6-7]、綠原酸、3,5-O-二咖啡?;鼘幩幔?-9]、鹽酸藥根堿[10-11]、黃芩苷[12]、鹽酸小檗堿[13-14])進(jìn)行含量測(cè)定,具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷的特點(diǎn),簡(jiǎn)化了多次制備供試品溶液及流動(dòng)相的繁瑣步驟,節(jié)約分析時(shí)間。采用該方法可有效的控制芎菊上清丸的質(zhì)量,為芎菊上清丸質(zhì)量監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

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    (編校:吳茜)

    Simultaneous determ ination of seven active ingredients in Xiongju Shangqing pills by HPLC

    SUN Cheng-hao1,WANG Ji-hua2

    (1.Liaoyang Central Hospital,Liaoyang 111000,China;2.Liaoyang Institute for Food and Drug Control,Liaoyang 111000,China)

    ObjectiveTo establish amethod for simultaneous determination of seven active ingredients(Jasminoidin,F(xiàn)orsythoside A,Caffeotannic acid,3,5-Di-O-caffeoylquinic acid,Jatrorrhizine Hydrochloride,Baicalin,Berberine Hydrochloride).MethodsThe determination was carried outwith Agilent Poroshell120 SB-C18(100mm×3.0mm,2.7μm);The mobile phase consisted of acetonitrile(A)-0.1%phosphoric acid solution(B)with gradient elution at a flow rate of 1.0mL/min;The detection wavelengthswere 230 nm in 0~4.5min(determination of Jasminoidin),348 nm in 4.5~9.0min(determination of Forsythoside A,Caffeotannic acid,3,5-Di-O-caffeoylquinic acid),and 278 nm in 9.0~15.0 min(determination of Jatrorrhizine Hydrochloride;Baicalin;Berberine Hydrochloride).ResultsThe calibration curveswere linear in the ranges of4.024~80.48μg/mL for Jasminoidin(r=0.9991),2.042~40.84μg/mL for Forsythoside A(r=0.9993),3.956~79.12μg/mL for Caffeotannic acid(r=0.9996),6.090~121.80μg/mL for 3,5-Di-O-caffeoylquinic acid(r=0.9990),4.026~80.52μg/mL for Jatrorrhizine Hydrochloride(r=0.9995),3.924~78.48μg/ mL for Baicalin(r=0.9998),6.030~120.6μg/mL for Berberine Hydrochloride(r=0.9998).The average recoveries(n=6)were 96.5%,97.5%,95.9%,98.6%,99.8%,98.4%and 97.3%;RSDs were 1.5%,1.3%,1.2%,1.4%,1.2%,1.1%and 0.9%respectively.ConclusionThe method is simple and repeatable,which can be applied to the quality control of Xiongju Shangqing pills.

    Xiongjushangqing pills;HPLC;content determination

    R917

    A

    1005-1678(2014)07-0177-04

    遼寧省教育廳高等學(xué)??蒲杏?jì)劃(20100352)

    孫承浩,男,本科,副主任藥師,研究方向:臨床藥學(xué),E-mail:sunchenghao_s@163.com。

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