羥基紅花黃色素A腸溶微丸的研究

鄒宇，李智勇，周麗，趙，潘虹，牛英才

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院骨科，黑龍江齊齊哈爾161000）

羥基紅花黃色素A腸溶微丸的研究

鄒宇1，李智勇2，周麗1，趙1，潘虹1，牛英才Δ

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院骨科，黑龍江齊齊哈爾161000）

目的制備羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSY-A）微丸，對(duì)體外釋藥和體內(nèi)動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行考察。方法采用擠出滾圓-流化床包衣技術(shù)制備HSY-A微丸，考察粉體學(xué)性質(zhì)，研究影響體外釋藥的處方因素，通過數(shù)學(xué)原理和相關(guān)模型探討其釋放行為和機(jī)制，評(píng)價(jià)其在體內(nèi)的口服吸收的藥物動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果HSY-A微丸體外釋放更符合Ritger-peppas動(dòng)力學(xué)方程，以擴(kuò)散形式釋放藥物，體內(nèi)吸收試驗(yàn)進(jìn)一步說明其在胃中不釋放，具有良好的腸溶特性。結(jié)論本研究獲得較為滿意的HSY-A微丸，達(dá)到預(yù)期的目的。

羥基紅花黃色素；腸溶微丸；體外釋放度；體內(nèi)動(dòng)力學(xué)

紅花黃色素是從紅花的花瓣中提取出的主要有效成分之一，其主要有效單體為羥基紅花黃色素A，具有緩解心肌缺血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗氧化、降血壓、免疫抑制和腦保護(hù)等多種藥理功能，臨床應(yīng)用廣泛。然而，紅花黃色素A經(jīng)口服給藥后存在吸收不完全，體內(nèi)生物利用度低，半衰期較短等問題，嚴(yán)重限制了其口服給藥制劑的開發(fā)［1-3］。微丸具有刺激性小，血藥濃度重現(xiàn)性好，易調(diào)節(jié)釋藥速率，減少給藥次數(shù)，維持平穩(wěn)的有效濃度，提高藥物生物利用度等優(yōu)點(diǎn)，作為緩釋/控釋制劑受到極大的關(guān)注［4-5］。筆者開發(fā)紅花黃色素A緩釋微丸，對(duì)其制備工藝和體外溶出度體內(nèi)動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行研究，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 JBZ-300型多功能微丸包衣造粒機(jī)（中國遼寧醫(yī)聯(lián)新藥技術(shù)研究所）；mini-GLATT流化床（德國GLATT公司）；LC-10AD型高效液相色譜儀，SPD-10A型紫外檢測(cè)器（島津中國有限公司）；SZ-93A自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；超高速冷凍離心機(jī)（LE-80K，美國Beckman公司）；紫外分光光度計(jì)（UV-2550，日本島津株式會(huì)社）；星火牌C型玻璃儀器氣流烘干器（長城科工貿(mào)有限公司）；RCZ-6B3型藥物溶出儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）。羥基紅花黃色素-A（HSY-A，自制，純度大于90%）；羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品（上海金穗生物科技有限公司，純度大于95%）；雙蒸水（自制）；微晶纖維素（MCC，山東泰安瑞泰纖維素有限公司）；Eudragit L30D-55（德國Evonik公司）；檸檬酸三乙酯（TEC，上海邦成化工有限公司）；滑石粉（桂林滑石粉制品有限公司）。健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，大連實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（遼）2008-0002，實(shí)驗(yàn)操作遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2 體外分析方法的建立

1.2.1 測(cè)定波長的選擇：用pH 1.2的鹽酸溶液及pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖鹽溶液）配成0.25 mg/mL的紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按紫外分光光度法在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描；同時(shí)取適量空白輔料，分別溶pH 1.2的鹽酸溶液、pH 6.8的PBS溶液中，超聲溶解30min，過濾，采用相同方法對(duì)其進(jìn)行掃描，確定藥物吸收波長。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取HSY-A10 20 mg置50 mL量瓶中，分別加pH 1.2的鹽酸溶液、pH 6.8的PBS溶液溶解并稀釋至刻度，分別制得濃度為0.51，1.02，2.04，8.16，10.20，40.80，80.1 mg/mL的系列溶液。于403 nm的波長處測(cè)定吸光度。

1.2.3 精密度測(cè)定：分別配制低、中、高，3種不同濃度的HSY-A pH 1.2的鹽酸溶液、pH 6.8的PBS溶液各5份。將低、中、高三種濃度的溶液，用相應(yīng)溶液定容，并分別在一天內(nèi)測(cè)定5次，記下吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)計(jì)算日內(nèi)精密度；此后每天再按相同方法再測(cè)低、中、高三種濃度溶液的吸光度，連續(xù)測(cè)5天，并計(jì)算日間精密度。

1.2.4 回收率測(cè)定：分別配制低、中、高，3種不同濃度的HSY-A pH 1.2的鹽酸溶液、pH 6.8的PBS溶液各3份，分別加處方量的輔料于溶液中。用相應(yīng)溶液定容。將配好的低、中、高濃度的溶液分別于403 nm處進(jìn)行紫外掃描，計(jì)算回收率。

1.3 HSY-A微丸丸芯的制備 經(jīng)前期處方篩選和工藝因素考察，將HSY-A同處方量的MCC過100目篩，混合均勻，加3%的HPMC作為黏合劑制備軟材，以30 Hz的擠出速度經(jīng)機(jī)篩板擠出（孔徑0.8mm），將條狀擠出物移至滾圓機(jī)，滾圓速度為50 Hz，滾圓時(shí)間為5min，制成球形；滾圓后將微丸于55℃干燥。干燥后篩分出18～30目間微丸進(jìn)行評(píng)價(jià)，連續(xù)制備3批，考察粉體學(xué)性質(zhì)。

1.4 HSY-A包衣微丸的制備 取載藥微丸丸芯適量，取Eudragit L30D-55水分散體，加水適量，攪勻，將TEC及滑石粉加入適量水中，攪拌均勻后將其慢慢加入到Eudragit L30D-55中，磁力攪拌1 h，過濾，在包衣過程中持續(xù)攪拌，以流化床底噴的方式進(jìn)行包衣。包衣條件為霧化壓力35 kPa，鼓風(fēng)頻率30Hz，流化壓力45 kPa，流化床出口溫度36℃～38℃，包衣液流速0.4mL/ min，包衣后于38℃烘箱干燥2 h。

1.5 HSY-A包衣微丸的釋放及影響因素測(cè)定 研究采用轉(zhuǎn)藍(lán)法，分別將不同處方組成的微丸裝于轉(zhuǎn)藍(lán)中，于900 mL的溶出介質(zhì)中，在pH=1.2的鹽酸中釋放2 h，分別于0.5、1、2 h取樣5m L，并及時(shí)補(bǔ)充等量同溫的溶出介質(zhì)，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜濾過，更換溶出介質(zhì)，在pH 6.8的PBS中釋放10 h，溫度控制在（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，繼續(xù)分別于2.5、3、4、5、6 h取樣5 m L，同上操作取續(xù)濾液，用紫外分光光度法測(cè)其吸光度，計(jì)算累計(jì)釋放百分率。以下藥物釋放考查均按此法。

1.5.1 TEC用量的影響：分別將相當(dāng)于包衣材料量的5%、15%、30%的TEC加入到包衣液中，制備包衣微丸，測(cè)定累積釋放率，繪制釋藥曲線。

1.5.2 包衣增重水平的影響：取適量的HSY-A微丸丸芯進(jìn)行包衣，制備包衣（Eudragit L30D-55）增重分別為5%，10%，15%的微丸，考察不同包衣增重的條件下的累積釋放率。

1.5.3 滑石粉用量的影響：包衣過程中分別加入相當(dāng)于Eudragit量20%，30%，40%的超細(xì)滑石粉作為抗黏劑，考察其對(duì)釋放的影響。

1.6 包衣微丸重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn) 按“1.4”項(xiàng)下制備方法，以確定的最佳包衣處方，即增塑劑用量為包衣材料量的15%，滑石粉的用量為包衣材料量的30%，包衣增重為10%時(shí)，制備3批樣品，考察其外觀，并按“1.5”項(xiàng)方法測(cè)定體外釋藥特性。

1.7 HSY-A微丸在小鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究

1.7.1 血樣的處理［6-7］：精密吸取血漿100μL于2mL尖底離心管中，加入甲醇150μL，渦旋混合器混勻2min，離心（10000 r/min）10min。取出上清液至另一離心管中，于60℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)铀?00μL，超聲溶解30 s，渦旋混合1min，上清液過濾，取20μL進(jìn)樣，用HPLC分析，色譜條件為：色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm），預(yù)柱：DIKMA C18（150 mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇：乙腈：0.05%磷酸水=20：2：78（用三乙胺調(diào)pH至5.96）；檢測(cè)波長：403 nm；流速：1 mL/ min；柱溫箱：室溫。

1.7.2 小鼠灌胃給藥：分別取健康SD大鼠6只，給藥前12 h禁食，自由飲水?？诜辔窰SY-A微丸每只按500 mg/kg的劑量灌胃，并于給藥0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10 h后尾靜脈采血0.2mL，置于用肝素鈉抗凝的離心管中，離心（5000 r/ min）10min，取出上層血清置于離心管中，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫础?.7.1”項(xiàng)進(jìn)行處理和測(cè)定，結(jié)果用DAS2.1.1藥動(dòng)學(xué)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 體外分析方法的建立 紅花黃色素A的最大吸收波長為403 nm，而空白輔料此處無吸收，因此選擇403 nm作為測(cè)定波長。以吸光度為橫坐標(biāo)，HSY-A濃度為縱坐標(biāo)，分別得紅花黃色素A濃度和吸光度在加pH 1.2的鹽酸溶液、pH 6.8的PBS溶液的回歸方程：y=0.1001x-0.0076，r=0.9999和y=0.0902x-0.0068，r=0.9999，線性關(guān)系均良好。精密度試驗(yàn)吸光度RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。回收率試驗(yàn)吸光度RSD值均小于2%，表明均符合方法學(xué)要求。

2.2 HSY-A微丸丸芯的制備 制備3批HSY-A微丸丸芯，粉體學(xué)性質(zhì)見表1。

表1 HSY-A微丸丸芯的粉體學(xué)性質(zhì)及回收率（n=3）Tab.1 Themicromeritic properties and yield of HSY-A pellets（n=3）

2.3 HSY-A包衣微丸的釋放及影響因素測(cè)定

2.3.1 TEC用量的影響：TEC用量對(duì)藥物釋放有顯著影響（見圖1），當(dāng)其用量較小時(shí)，藥物的釋放較快，前2 h釋放較快，可能由于低含量的TEC不能完全起到增塑劑的作用，未能形成連續(xù)完整的包衣膜，HSY-A包衣微丸抗酸性下降所致；TEC用量增加時(shí)，HSY-A微丸釋藥速率明顯減緩，提高TEC含量有利于丸芯表面鋪展和融合作用，促進(jìn)完整的腸溶衣的形成［8］，但當(dāng)用量為30%時(shí)，微丸間易粘連、聚結(jié)，收率下降；增塑劑用量為15%包衣效果理想，可有效控制藥物釋放的速度。

圖1 TEC用量對(duì)包衣微丸釋放率的影響Fig.1 Effect of the TEC amount on the release rate of coated pellets

2.3.2 包衣增重水平的影響：隨包衣增重的增加，微丸的釋藥速率逐漸變慢，與文獻(xiàn)一致［9］，包衣增重為5%時(shí)，HSY-A在酸性環(huán)境中釋放較多，達(dá)不到腸溶效果；包衣增重為15%時(shí)，抗酸性較好，但釋放率明顯下降，后期藥物釋放不完全。包衣增重為10%時(shí)，一定程度增加了包衣膜厚度，降低了介質(zhì)向包衣膜內(nèi)的滲透速率，而且增加了包衣膜的抗張強(qiáng)度，釋藥曲線具有較好的緩釋特性（見圖2）。

圖2 包衣增重對(duì)包衣微丸釋放率的影響Fig.2 Effect of the coating weight on the release rate of coated pellets

2.3.3 滑石粉用量的影響：隨著滑石粉用量的增加，釋放的速度和程度也同時(shí)增加，但當(dāng)用量較大時(shí)，盡管起到較好的抗黏作用，但包衣液易發(fā)生沉淀，易造成藥物含量降低［10］，且包衣微丸的圓整度和回收率不好；當(dāng)滑石粉用量為20%時(shí)，微丸之間會(huì)發(fā)生一定的聚集及粘連現(xiàn)象，抗粘作用不明顯，故選擇滑石粉的用量為30%（見圖3）。

圖3 滑石粉用量對(duì)包衣微丸釋放率的影響Fig.3 Effect of the talcum powder amount on the release rate of coated pellets

2.4 包衣微丸重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn) 制備3批樣品，觀察微丸無裂縫、崩解或軟化現(xiàn)象，體外釋放結(jié)果見圖4，將釋藥行為進(jìn)行釋藥數(shù)學(xué)模型擬合，擬合優(yōu)度和數(shù)學(xué)釋放模型擬合結(jié)果見表2。前1.5 h累積釋藥百分率小于0.5%，基本不釋放，5 h釋放率達(dá)90%以上（見圖4）。

圖4 HSY-A微丸的累積釋放率（n=3）Fig.4 Cumulative release rate of HSY-A coated pellets（n=3）

表2 HSY-A微丸體外釋藥模型擬合Tab.2 The regression equation of HSY-A coated pellets in vitro

2.5 HSY-A微丸在小鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究 大鼠口服HSY-A微丸后血漿中的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表3，其藥物動(dòng)力學(xué)特征可用雙室模型來擬合，權(quán)重系數(shù)w=1/c2（見圖5）。

表3 大鼠口服HSY-A微丸后血漿中的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=6）Tab.3 The pharmacokinetic parameters of HSY-A after oral administration of coated pellets in rats（n=6）

圖5 大鼠口服HSY-A微丸后血藥濃度與時(shí)間變化的關(guān)系曲線（n=6）Fig.5 The plasma concentration-time curve after oral administration of HSY-A coated pellets in rats（n=6）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用擠出滾圓法制備了含藥丸芯，利用流化床包衣技術(shù)進(jìn)行了腸溶包衣，制備了HSY-A微丸。經(jīng)過前期處方和工藝研究，確定擠出滾圓法制備微丸的擠出速度為30 Hz，滾圓速度為50Hz，滾圓時(shí)間為5min。所制備的微丸的圓整度、堆密度、脆碎度和回收率均達(dá)到要求，批間重復(fù)性高，這也與篩選合適比例的TEC作為增塑劑、滑石粉作為抗黏劑有關(guān)，即確定的最佳包衣作為增塑劑，用量為包衣材料量的15%，滑石粉的用量為包衣材料量的30%，包衣增重為10%。

良好的結(jié)腸靶向制劑是在胃酸環(huán)境下（pH 1～2）不溶解，在結(jié)腸中性或弱堿性環(huán)境下溶解［11-12］，HSY-A微丸在前1.5 h累積釋藥百分率小于3%，說明其不易受胃酸液體環(huán)境的影響，進(jìn)入結(jié)腸（回腸末端）后（pH 6.8緩沖液），釋放率達(dá)90%以上，較好的控制了藥物的釋放，具有良好的腸溶特性，達(dá)到了預(yù)期的目的。且釋放更符合Ritger-peppas動(dòng)力學(xué)方程（lnQ=2.4974lnt-0.1324，r=0.9775，n=0.2497），當(dāng)n≤0.43時(shí)，為Fick擴(kuò)散機(jī)制［13］，說明藥物從微丸的釋放主要通過包衣膜的微孔和孔隙擴(kuò)散［14-15］。

HSY-A微丸在1.5 h即達(dá)到最大血藥濃度峰，2 h后血藥濃度逐漸降低，藥-時(shí)曲線趨于平坦。大鼠的胃排空時(shí)間平均在0.75～2 h左右［16］，在2 h前，藥物吸收量比較少，說明HSY-A微丸在胃中比較穩(wěn)定且沒有釋放或釋放很少，其體外溶出結(jié)果和藥物體內(nèi)的吸收規(guī)律較為一致，較好的控制了藥物的釋放，即進(jìn)一步驗(yàn)證了其在胃中基本不釋放，有一定的腸溶特性或結(jié)腸釋放特點(diǎn)，且生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、簡(jiǎn)單，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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（編校：譚玲）

Study on hydroxysafflor yellow A enteric pellets

ZOU Yu1，LIZhi-yong2，ZHOU Li1，ZHAO Kun1，PAN Hong1，NIU Ying-cai1Δ

（1.Department of Pharmacology，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China；2.Department of Orthopaedics，Traditional Chinese Medicine Hospital of Qiqihar，Qiqihar 161000，China）

ObjectiveTo prepare the hydroxysafflor yellow A（HSY-A）enteric coating pellets，and investigate in vitro release and in vivo pharmacokinetic characteristics.MethodsHSY-A enteric coating pellets were prepared by extrude-rounding and fluid bed technique.The micromeritic characteristics，the factorsaffecting the release properties ofenteric coating pellets the releasemechanism were explored，and the in vivo pharmacokinetic behaviorswere also evaluated.ResultsThe in vitro release behavior of HSY-A from enteric coating pellets could be described by Ritger-peppas equation，and fitdiffusionmechanism，in vivo pharmacokinetic test confirmed the argument thatpellets have good acid residence and enteric properties.ConclusionHSY-A enteric coating pellets have been successfully prepared and the expected release properties is achieved in the study.

hydroxysafflor yellow A；enteric pellets；in vitro release；in vivo pharmacokinetics

RR283.6

A

1005-1678(2014）07-0180-04

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究（面上）項(xiàng)目（12531806）

鄒宇，女，在讀碩士，助理研究員，研究方向：藥劑學(xué)與神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：zouyu22311@sina.com；牛英才，通信作者，男，博士，研究員，研究方向：藥劑學(xué)與神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：nyc1968@sohu.com。