雷米普利對舒張性心力衰竭大鼠心房肌L型鈣通道的影響

郭作兵++++孫淑娟

[摘要] 目的 觀察雷米普利對舒張性心力衰竭（DHF）大鼠模型心房肌細(xì)胞L型鈣通道的影響。 方法 腹主動脈縮窄術(shù)建立DHF大鼠模型，隨機(jī)分為DHF組及雷米普利大、中、小劑量組，另設(shè)對照組。全細(xì)胞膜片鉗檢測心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流（ICa-L）；RT-PCR檢測L型鈣通道上Cav1.2 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測鈣調(diào)控相關(guān)蛋白LTCC的表達(dá)。 結(jié)果 與對照組比較，DHF組大鼠心房肌細(xì)胞ICa-L電流密度峰值、Cav1.2 mRNA表達(dá)及鈣調(diào)蛋白LTCC的表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與DHF組比較，雷米普利組心房肌細(xì)胞ICa-L電流密度峰值明顯增加、Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)控蛋白LTCC的表達(dá)增加（P<0.05），且劑量越大增加越明顯。 結(jié)論 雷米普利能上調(diào)舒張性心力衰竭大鼠心房肌ICa-L電流密度峰值，增加Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)控蛋白LTCC的表達(dá)，對DHF大鼠有治療作用，其機(jī)制與調(diào)控心房肌細(xì)胞L型鈣通道的功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 舒張性心力衰竭；L型鈣通道；雷米普利；Cav1.2

[中圖分類號] R972[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1674-4721（2014）06（b）-0015-04

Influences of ramipril on L-type calcium channel in rats with diastolic heart failure

GUO Zuo-bing1,2 SUN Shu-juan1,3▲

1.School of Pharmaceutical Sciences,Shandong University,Jinan 250012,China;2.Department of Pharmacy,Central Hospital of Qilu Petrochemical Hospital Group,Zibo 255400,China;3.Department of Pharmacy,Shandong Qianfoshan Hospital,Jinan 250014,China

[Abstract] Objective To observe the influence of ramipril on L-type calcium channel in rats with diastolic heart failure (DHF). Methods The rat model of DHF was established by using abdominal aortic coarctation,and then the rats were randomly divided into DHF group,high-dose,mid-dose and low-dose ramipril groups and control group.L-type calcium channel current (ICa-L) was investigated by using a whole cell patchclamp technique.The expression levels of Cav1.2 mRNA were measured by RT-PCR analysis.The expression levels of LTCC were measured by Wsetern blot analysis. Results Compared with control group,the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels of LTCC was lower in DHF group (P<0.05).Compared with the DHF group,the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels ofLTCC increased in three ramipril groups (P<0.05).The more dose of ramipril,the more increasing in ramipril group. Conclusion Ramipril can improve the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels of LTCC,has the therapeutic effect on DHF in rats,and the mechanism may be related to improving the activties of L-type calcium channel.

[Key words] Diastolic heart failure;L-type calcium channel;Ramipril;Cav1.2

舒張性心力衰竭（diastolic heart failure，DHF）是一組以具有心力衰竭的癥狀和體征，射血分?jǐn)?shù)正常而舒張功能異常為特征的臨床綜合征[1]。近年來，DHF的發(fā)病率增高，心房肌細(xì)胞L型鈣通道功能的異常是其發(fā)生的主要原因之一。研究證實，DHF發(fā)生時常伴有心房顫動，心房顫動對心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流（ICa-L）有下調(diào)作用[2-3]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）在心房顫動一級預(yù)防和治療中具有重要意義。本研究擬通過觀察雷米普利對DHF大鼠心房肌細(xì)胞ICA-L電流密度峰值、與L型鈣通道相關(guān)的Cav1.2 mRNA表達(dá)水平、L型鈣通道相關(guān)的鈣調(diào)控蛋白LTCC表達(dá)水平的影響，以探討雷米普利對DHF大鼠L型鈣通道的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體重為200～250 g，許可證號：SYXK（魯）2012-2010。

1.1.2 試劑與溶液

HEPES、EGTA和牛磺酸均購于Sigma公司，DHPRa1（LTCC）抗體購于Abcam公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，其余的試劑均為國產(chǎn)的分析純。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組

選擇SD雄性大鼠30只，腹主動脈縮窄法制造DHF大鼠模型。模型組大鼠以3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉。固定，剃毛，消毒，開腹腔。暴露左腎上緣腹主動脈，分離腹主動脈，銀夾造成腹主動脈部分狹窄，關(guān)閉腹腔。對照組僅游離腹主動脈但不縮窄，其他操作與手術(shù)組相同。術(shù)后8周，通過超聲心動圖及心導(dǎo)管等方法檢測大鼠心臟舒張功能指標(biāo)，確立造模成功[4]。將大鼠手術(shù)組隨機(jī)分為DHF組，雷米普利大、中、小劑量組。大、中、小劑量組分別給雷米普利1.25、2.50、5.00 mg/（kg·d）灌胃，DHF組和對照組等量生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。

1.2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄ICa-L

膠原酶解法分離大鼠心房肌細(xì)胞[5-6]。取得適合細(xì)胞，放入顯微鏡的細(xì)胞池中，貼壁。玻璃電極灌入電極液，電極與細(xì)胞表面形成高電阻，完成封接破膜補償快慢電容。MODE置向VC后進(jìn)行ICa-L記錄。

1.2.3 RT-PCR檢測Cav1.2 mRNA的表達(dá)

1.2.3.1 提取RNA剪取大鼠心房組織，稱取75 mg，放入Trizol勻漿，離心，取上清液，氯仿充分混勻，離心20 min，取上清液移，異丙醇沉淀，再離心棄上清，后將RNA用1 ml 75%乙醇洗滌，離心，除乙醇后加0.01%焦碳酸二乙酯，溫浴15 min，后在A260/A280下定量RNA。

1.2.3.2 RT-PCR反應(yīng)混合好RT反應(yīng)及PCR反應(yīng)體系，加水至10 μl混勻，置于PCR儀上，94℃變性5 min，后擴(kuò)增30個循環(huán)，72℃延伸5 min。凝膠電泳，染色。

1.2.4 Western blot檢測LTCC的表達(dá)

提取心房肌細(xì)胞膜蛋白，取大鼠左心房組織120 mg，剪碎。后加入裂解液和蛋白酶抑制劑。于勻漿器中打碎，后4℃，離心5 min。取上清液置于EP管，4℃離心。測定膜蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上，過夜。脫脂牛奶封閉1 h，1抗孵育及漂洗，2抗孵育及漂洗，加入DAB顯影液顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷米普利對DHF大鼠血流動力學(xué)的影響

與對照組比較，DHF組心率（HR）、左室內(nèi)壓上升下降最大速率（±dp/dt）及左室收縮壓（LVSP）無顯著變化（P>0.05），左室舒張末壓（LVEDP）顯著升高（P<0.05），左室松弛時間常數(shù)（T）顯著延長（P<0.05）。與DHF組比較，雷米普利組HR、±dp/dt、LVSP無明顯變化（P>0.05），LVEDP及T明顯縮短（P<0.05），且中高劑量組較低劑量組變化更明顯（P<0.05）（表1）。

表1 雷米普利對DHF大鼠血流動力學(xué)的影響（x±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DHF組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

2.2 雷米普利對ICa-L的影響

與對照組比較，DHF組大鼠心房肌細(xì)胞ICa-L峰值電流密度明顯降低（P<0.05）；與DHF組比較，雷米普利組心房肌細(xì)胞ICa-L峰值電流密度顯著上升（P<0.05），且中、高劑量組較低劑量組上升更明顯（P<0.05）（圖1、表2）。

圖1 雷米普利對ICa-L的影響

表2 雷米普利對ICa-L的影響（x±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DHF組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

2.3 雷米普利對L型鈣通道上Cav1.2 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，DHF組大鼠心房肌細(xì)胞Cav1.2 mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與DHF組比較，雷米普利組大鼠心房肌細(xì)胞Cav1.2 mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且劑量越大增加越明顯（圖2）。

圖2 雷米普利對L型鈣通道上Cav1.2 mRNA表達(dá)的影響

2.4 雷米普利對鈣調(diào)控蛋白LTCC表達(dá)的影響

與對照組比較，DHF組大鼠心房肌細(xì)胞蛋白表達(dá)水平較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與DHF組比較，雷米普利組大鼠蛋白表達(dá)水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且劑量越大上升越明顯（圖3）。

圖3 雷米普利對鈣調(diào)控蛋白LTCC表達(dá)的影響

3 討論

心房肌細(xì)胞的L型鈣通道在電壓依賴性鈣離子通道中占主導(dǎo)作用，是形成慢反應(yīng)及興奮功能的主要成分[9]。Bosch等[10-11]研究認(rèn)為，DHF常伴有心房顫動的發(fā)生，心房肌細(xì)胞ICa-L出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。ICa-L的減少導(dǎo)致動作電位不應(yīng)期（action potential duration，APD）縮短及APD對頻率的適應(yīng)性下降，導(dǎo)致心房顫動的發(fā)生并有利于心房顫動的維持。本研究結(jié)果顯示，DHF組大鼠心房肌細(xì)胞ICa-L峰值電流密度下降，提示ICa-L峰值電流密度的下降，可能是L型鈣通道功能改變，導(dǎo)致心房顫動持續(xù)發(fā)生，并且可能是DHF大鼠發(fā)生房性心律失常和電生理重構(gòu)的離子基礎(chǔ)。另本研究中，DHF大鼠的Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)蛋白LTCC的表達(dá)顯著降低，提示ICa-L降低可能由基因水平和蛋白表白水平的改變所介導(dǎo)。

雷米普利是ACEI類經(jīng)常使用的藥物之一[12]?，F(xiàn)在研究證實，ACEI可以通過抑制血管緊張素Ⅱ預(yù)防心律失常。在DHF中，腎素血管緊張素系統(tǒng)過度激活和血管緊張素Ⅱ增加，血管緊張素Ⅱ通過激活L型鈣通道，增加攝取細(xì)胞外的Ca2+并促進(jìn)肌漿網(wǎng)Ca2+釋放，使心房肌鈣超載加重[13-14]。雷米普利拮抗血管緊張素Ⅱ的作用是其調(diào)節(jié)DHF心肌ICa-L電重構(gòu)的重要機(jī)制。不同劑量雷米普利灌胃處理后，能逆轉(zhuǎn)DHF組大鼠心房肌細(xì)胞ICa-L下調(diào)，并上調(diào)Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)蛋白LTCC的表達(dá)。雷米普利抑制ICa-L的降低，使鈣通道失活減慢，增加細(xì)胞外鈣攝取和肌漿網(wǎng)鈣釋放，從而減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，延長心房APD，抑制心房顫動的發(fā)生。

心房電重構(gòu)分為真假兩種電性重構(gòu)，其中真性重構(gòu)出現(xiàn)在心房顫動開始后的數(shù)小時或數(shù)天。真性重構(gòu)中，離子通道蛋白基因表達(dá)改變，隨之出現(xiàn)持續(xù)時間甚久的通道蛋白數(shù)量及功能變化[15-16]。本實驗中，雷米普利上調(diào)了Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)蛋白LTCC的表達(dá)水平，顯示雷米普利對L型鈣通道的作用與基因水平和蛋白水平的改變都有關(guān)。因此，雷米普利通過對L型鈣通道的影響，抑制心房肌細(xì)胞的真性電重構(gòu)，對防治心房顫動有重要而持久的作用。

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（收稿日期：2014-03-05本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期：2014-03-05本文編輯：郭靜娟）