新生隱球菌通過血腦屏障的機制

李平 聶舒 朱紅梅 溫海

(上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點實驗室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

新生隱球菌是一種環(huán)境腐生菌，常引起免疫功能受損人群的感染。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是隱球菌病最主要的臨床表現(xiàn)，常表現(xiàn)為致命性的腦膜炎或腦膜腦炎(Cryptococcal meningitis/meningoencephalitis，CME)，是其高病死率的主要原因。關(guān)于隱球菌嗜中樞性機制的研究主要聚焦在血腦屏障與隱球菌作用前后某些基因表達和功能變化等方面，明確了不少促進隱球菌侵襲血腦屏障的關(guān)鍵基因，同時也建立了相對完美的體外血腦屏障模型，本文就有關(guān)問題作一闡述。

圖1 血腦屏障體外模型示意圖［6，8］Fig.1 The in vitro model of blood-brain barrier

1 血腦屏障的體外研究模型

血腦屏障主要由三種細胞組成:腦微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和周細胞，三者共同組成緊密連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，控制血液與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)交換。目前常用的體外血腦屏障模型是將單層腦微血管內(nèi)皮細胞置于Transwell小室中培養(yǎng)［1-7］，再將Transwell小室置于12孔板或6孔板中培養(yǎng)，Transwell小室相當于血管腔一側(cè)，而培養(yǎng)孔則相當于中樞神經(jīng)系統(tǒng)一側(cè)。研究時將隱球菌加于Transwell小室內(nèi)，觀察其穿過微血管內(nèi)皮細胞層及Transwell微孔膜進入下方培養(yǎng)孔的能力(見圖1)。Transwell小室底部是具有8 μm孔徑的微孔膜，模擬了血管的基膜。微孔膜輔以膠原包被，再將血管內(nèi)皮細胞種植于膜上培養(yǎng)，由于微血管內(nèi)皮細胞之間可以形成緊密連接，基本上模擬了血腦屏障的結(jié)構(gòu)。目前報道的有用原代人［1-3］、牛［4-5］內(nèi)皮細胞及永生化的人內(nèi)皮細胞系HCMEC/D3［6］和小鼠內(nèi)皮細胞系 bEnd.3［7］。該模型的缺點是忽略了星形膠質(zhì)細胞和周細胞在血腦屏障中的作用。研究表明，周細胞、星形膠質(zhì)細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用對維持血腦屏障的功能極其重要，因此，Nakagawa等人在上述模型的基礎(chǔ)上構(gòu)建了新的血腦屏障模型，該模型由大鼠原代腦內(nèi)皮細胞、周細胞及星形膠質(zhì)細胞的共培養(yǎng)體系構(gòu)成［8］。對該模型的研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞和周細胞均能明顯提高內(nèi)皮細胞的跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electrical resistance，TEER)和降低血管內(nèi)皮細胞層的通透性，并能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白的表達。在構(gòu)建的7個模型中，EPA模型(內(nèi)皮細胞接種于小室內(nèi)側(cè)、周細胞接種于小室膜的下側(cè)、星形膠質(zhì)細胞接種于培養(yǎng)孔內(nèi)，見圖1)緊密連接蛋白表達量最高，跨內(nèi)皮電阻最大，通透性最低，是最接近正常生理機構(gòu)的體外血腦屏障模型。

2 影響新生隱球菌通過血腦屏障的因素

2.1 單核細胞

有研究報道，新生隱球菌可以通過木馬機制穿越血腦屏障，單核細胞在該機制中發(fā)揮了很重要的作用［9］。研究通過預(yù)先將單核細胞與隱球菌共培養(yǎng)將隱球菌吞噬，然后將已吞噬隱球菌的單核細胞注射小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織中的真菌荷載量比接種同劑量隱球菌的小鼠要高。給小鼠注射氯磷酸，使單核吞噬細胞耗盡，小鼠大腦菌體載量也降低了40%以上，說明單核細胞在隱球菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過程中起到了載體的作用。該研究證實了隱球菌可以通過木馬機制穿過血腦屏障，但具體機制仍未闡明。

2.2 腦微血管內(nèi)皮細胞

腦微血管內(nèi)皮細胞是維持血腦屏障功能最主要的細胞，這些細胞具有非常低的胞吞能力、表達特異性離子和肽轉(zhuǎn)運蛋白，由于毗鄰的腦微血管內(nèi)皮細胞表達緊密連接蛋白，因此可以形成低透水的物理屏障［10］。利用體外血腦屏障模型，多個研究小組證實隱球菌可以通過胞吞轉(zhuǎn)運作用通過血管內(nèi)皮細胞層，這種穿透作用與宿主細胞的細胞骨架重排有密切聯(lián)系，也與新生隱球菌表面包被的宿主纖溶酶原的激活有關(guān)。

與細胞骨架有關(guān)的分子 Rho GTPases的三個主要分子RhoA、Rac1和Cdc42與肌動蛋白細胞骨架的重排有密切關(guān)系，很多病原體可以通過調(diào)節(jié)Rho GTPases的活性影響肌動蛋白的聚合從而黏附和侵襲宿主細胞［3］。研究表明，新生隱球菌可以活化人腦微血管內(nèi)皮細胞Rho GTPases三個分子RhoA、Rac1和Cdc42，這些分子的活化影響了肌動蛋白細胞骨架的重排進而影響了隱球菌通過血腦屏障。通過顯性抑制實驗發(fā)現(xiàn)，抑制RhoA、Rac1和Cdc42的活性明顯降低了隱球菌通過血腦屏障的能力［3］。Rho GTPases的活化同時激活了下游信號分子黏著斑激酶 (FAK)、埃茲蛋白及PKCα，這些信號分子同樣影響肌動蛋白骨架的重排，通過干擾RNA敲除這些分子的表達同樣明顯降低了隱球菌通過腦微血管內(nèi)皮細胞層的能力，說明新生隱球菌促進內(nèi)皮細胞Rho GTPases的活化以及其下游信號分子FAK、埃茲蛋白及PKCα的活化有助于隱球菌通過血腦屏障。Maruvada等人的研究也證實了Rac1促進新生隱球菌通過血腦屏障。研究發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌磷脂酶B1(Plb1)可以活化腦微血管內(nèi)皮細胞Rac1，活化的Rac1結(jié)合STAT3增加，從而促進隱球菌穿越血腦屏障［1］。Plb1突變的菌株不能活化Rac1，并且通過血腦屏障的能力降低，抑制Rac1的活性同樣降低了隱球菌通過血腦屏障的能力［1］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，另一個可以調(diào)節(jié)肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的蛋白S100A10在內(nèi)皮細胞吞噬隱球菌的過程中具有重要作用，抑制S100A10的表達明顯降低了內(nèi)皮細胞吞噬隱球菌的能力，并且被吞噬的隱球菌出芽率降低、莢膜變厚［11］，說明S100A10的敲除降低了細胞內(nèi)隱球菌的生長能力。有關(guān)S100A10影響內(nèi)皮細胞的吞噬能力是否進一步影響隱球菌通過血腦屏障的能力還需進一步研究。

尿激酶-纖溶酶 (原)系統(tǒng) 尿激酶是一種纖溶酶原激活劑，能激活體內(nèi)的纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶，纖溶酶是一種廣譜蛋白酶，可以降解纖維蛋白富集的細胞外基質(zhì)和基膜，并可以活化其他的酶原-蛋白酶系統(tǒng)，影響血管的通透性，從而增強病原體的侵襲能力。研究表明，新生隱球菌表面的受體可以結(jié)合宿主來源的纖溶酶原，這種結(jié)合能力隨著莢膜的增厚而降低［12］，結(jié)合纖溶酶原的隱球菌在組織纖溶酶原激活劑 (tPA)的存在下明顯增強隱球菌的侵襲細胞外基質(zhì)的能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合纖溶酶原的隱球菌與微血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后不需要加入tPA即可促進纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，并且侵襲血管外基質(zhì)的能力明顯增強［5］，說明血管內(nèi)皮細胞可能具有纖溶酶原激活的能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞與活的隱球菌共培養(yǎng)后可以被誘導(dǎo)表達尿激酶，尿激酶可以活化隱球菌表面結(jié)合的宿主纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，從而增強隱球菌的侵襲血腦屏障的能力。干擾尿激酶的表達或使用尿激酶特異性抑制劑均阻斷了纖溶酶原-纖溶酶的活化，從而降低隱球菌的穿透血腦屏障的能力［4］，說明隱球菌可以利用宿主的尿激酶-纖溶酶(原)系統(tǒng)增強其侵襲血腦屏障的能力。

CD44分子 新生隱球菌CPS1基因可以編碼透明質(zhì)酸合酶，該酶可以合成隱球菌莢膜透明質(zhì)酸［13］，而透明質(zhì)酸被認為與隱球菌侵襲血管內(nèi)皮細胞的能力有關(guān)［14］。Jong等研究發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌透明質(zhì)酸可以結(jié)合人腦微血管內(nèi)皮細胞的CD44分子，使用CD44中和抗體明顯降低了隱球菌黏附人腦微血管內(nèi)皮細胞的能力，敲除CD44分子或使用透明質(zhì)酸缺陷的菌株也觀察到了類似的結(jié)果，說明透明質(zhì)酸與CD44分子的作用在新生隱球菌入侵腦微血管內(nèi)皮細胞的過程中發(fā)揮了重要的作用［14］。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，過表達CD44分子可以增強新生隱球菌對內(nèi)皮細胞的黏附，并且通過共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，CD44分子富集在隱球菌黏附血管內(nèi)皮細胞的部位或周圍。CD44胞質(zhì)尾區(qū)還能與骨架結(jié)合蛋白結(jié)合，促進了骨架重組，說明透明質(zhì)酸與CD44的作用也可能與內(nèi)皮細胞的骨架重組有關(guān)系。

2.3 隱球菌毒力因子

隱球菌入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，除了宿主因素，還與隱球菌本身的毒力因子有著密切關(guān)系。目前的研究表明，隱球菌的莢膜、尿素酶和CPS1基因有關(guān)的透明質(zhì)酸都與隱球菌的侵襲能力有關(guān)。

莢膜 莢膜是公認的隱球菌的毒力因子，Chen SH等人研究發(fā)現(xiàn)野生株黏附腦微血管內(nèi)皮細胞的能力比莢膜突變株強，進一步研究發(fā)現(xiàn)，莢膜株B4776(CAP59)和 TYCC38-602(CAP64)在3 h后即能夠通過體外腦微血管內(nèi)皮細胞血腦屏障模型，而對應(yīng)的莢膜突變株則在6 h后才能通過。研究也觀察到了B3501菌株在24 h才能通過體外血腦屏障模型，作者認為這可能是過厚的莢膜降低了其穿過內(nèi)皮細胞層的能力［15］。也有研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌通過血腦屏障后其莢膜的結(jié)構(gòu)也相應(yīng)的發(fā)生了改變［16］。有關(guān)莢膜影響隱球菌通過血腦屏障的機制還不是很清楚，但莢膜能影響隱球菌穿透血腦屏障是毋庸置疑的。

尿素酶 尿素酶是胃腸道和泌尿道感染的病原菌的主要的毒力因子之一，可以促使這些病原菌在低PH環(huán)境下存活，也是某些氮源性腐敗物轉(zhuǎn)化所需要的酶。尿素酶也被認為是隱球菌的毒力因子［17］。將H99來源的尿素酶缺陷株 (ure1)與野生株分別接種小鼠，ure1的死亡率明顯降低。所有接種H99的小鼠死后其腦組織的真菌荷載很高，而ure1組6只小鼠僅有2只小鼠腦組織中可以檢測到隱球菌，進一步研究證實尿素酶不是隱球菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中生存必需的酶。通過與脾臟及其他器官的真菌荷載比較，尿素酶的缺陷只影響隱球菌侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力［18］，說明隱球菌可以利用自身的尿素酶穿透血腦屏障。

CPS1-透明質(zhì)酸 新生隱球菌CPS1基因與莢膜透明質(zhì)酸的合成密切相關(guān)，CPS1缺陷菌株透明質(zhì)酸的合成受阻，菌的毒力明顯降低。采用4-甲基傘形酮(4-MU)或透明質(zhì)酸酶處理隱球菌，抑制或破壞其莢膜透明質(zhì)酸，發(fā)現(xiàn)隱球菌黏附人腦微血管內(nèi)皮細胞的能力明顯降低，說明CPS1控制合成的透明質(zhì)酸影響隱球菌侵襲血腦屏障的能力［13］。在隱球菌侵入腦血管內(nèi)皮細胞過程中，CPS1-CD44-PKcα-actin細絲的信號通路發(fā)揮了重要作用［19］。

2.4 其他因素

HIV-1 gp41是一種HIV-1跨膜蛋白，通過介導(dǎo)HIV病毒與靶細胞膜的融合促進病毒侵人宿主。研究表明，HIV-1 gp41蛋白可以增強新生隱球菌入侵腦微血管內(nèi)皮細胞［20］，其功能域位于579-611氨基酸。重組 gp41-I90(氨基酸550-639)蛋白也可提高隱球菌黏附內(nèi)皮細胞的能力，表明HIV-gp41胞外域和新生隱球菌可能以類似的機制侵襲內(nèi)皮細胞，即actin重組和 (或)膜活化。進一步的研究表明，新生隱球菌和gp41-I90都能上調(diào)腦微血管內(nèi)皮細胞ICAM-1的表達，并能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞膜的邊緣波動。HIV-1 gp41還能誘導(dǎo)CD44和β-actin再分布至膜的脂筏，但與新生隱球菌不同的是，HIV-1 gp41不能誘導(dǎo)PKCα的活化［21］，揭示了在艾滋病患者中，新生隱球菌侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在新的機制。

3 展 望

新生隱球菌具有嗜中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特性，一方面與隱球菌穿過血腦屏障的能力有關(guān)，另一方面肯定與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的環(huán)境適合隱球菌生長有關(guān)。目前的研究重點主要集中在血腦屏障與新生隱球菌作用后功能的改變，明確了尿激酶-纖溶酶原系統(tǒng)、Rho GTPases以及透明質(zhì)酸-CD44的重要作用，后兩者均與actin骨架重排有關(guān)。有關(guān)actin骨架結(jié)構(gòu)的改變?nèi)绾斡绊懶律[球菌通過血腦屏障的機制尚未明確，有研究表明，CD44的側(cè)向遷移的能力與actin的骨架結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，破壞actin細胞骨架明顯降低了CD44的側(cè)向遷移能力［14］，而腦微血管內(nèi)皮細胞與新生隱球菌作用后CD44的極向轉(zhuǎn)移在識別新生隱球菌表面的透明質(zhì)酸中發(fā)揮了重要的作用，那么 Rac1、RohA、Cdc42以及S100A10是否通過影響actin骨架進而影響CD44的極化，從而影響內(nèi)皮細胞對隱球菌的黏附、吞噬?闡明這些問題將有助于中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病的防治，其具體機制仍需我們進一步研究。

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