新生隱球菌感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與疾病病程相關(guān)性研究

雷文知 桑軍軍 潘煒華 廖萬清

(上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

新生隱球菌是臨床上重要的致病真菌之一，它具有顯著的嗜神經(jīng)性，能導(dǎo)致嚴(yán)重的隱球菌性腦膜炎，癥狀重、死亡率高。其感染途徑主要經(jīng)呼吸道吸入氣化擔(dān)孢子(有性繁殖體)或干燥的酵母細(xì)胞而侵入肺部，肺組織是新生隱球菌感染人體后最先受影響的器官，而肺泡巨噬細(xì)胞是機(jī)體對(duì)抗隱球菌感染的第一道防線的重要組成部分。隱球菌被吸入后，首先被吞噬效應(yīng)因子 (包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等)識(shí)別并吞噬［1］，其中單核/巨噬細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞之一，巨噬細(xì)胞和隱球菌的相互作用將決定感染的程度。巨噬細(xì)胞一方面通過內(nèi)吞和氧化殺傷以及分泌胞外抗菌酶等非特異殺傷隱球菌［2］，另一方面通過釋放細(xì)胞因子調(diào)節(jié)自身及其他免疫細(xì)胞的抗真菌作用。巨噬細(xì)胞在受到外界病原刺激時(shí)，可以向肺組織遷移并釋放多種細(xì)胞因子 IL-6、IL-8、TGF-β、TNF-α 等，而這些細(xì)胞因子也可以反過來趨化中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等向感染部位遷移，并對(duì)巨噬細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。為進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞源性細(xì)胞因子在隱球菌致病中所起的作用，本文建立了新生隱球菌吸入感染小鼠模型，并對(duì)感染后不同時(shí)期小鼠肺泡巨噬細(xì)胞上相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平與小鼠肺組織變化進(jìn)行相關(guān)性分析。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立

①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:近交型雌性BALB/c小鼠購于中國科學(xué)院，一共144只，體重在16～22 g，隨機(jī)分為8組，每組18只，對(duì)照組為未感染新生隱球菌小鼠，其余7組均為感染組，感染后處死時(shí)間分別是1 d、4 d、7 d、11 d、14 d、18 d 和 21 d。②菌種及菌懸液制備:菌種來源于上海長征醫(yī)院皮膚真菌保藏實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)型H99新生隱球菌菌株，菌株20 mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和態(tài)，PBS清洗，1 200 r/min離心3 min，反復(fù)3次，無菌雙蒸水重懸，菌體計(jì)數(shù)調(diào)定終濃度為5×106CFU/mL，配好的菌懸液僅限當(dāng)天使用。③小鼠吸入感染新生隱球菌模型:感染組小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，迅速以移液器移出20 μL菌懸液經(jīng)小鼠單側(cè)鼻孔接種感染 (1×105CFU/鼠)(見圖1A)。

1.2 肺泡巨噬細(xì)胞的分離和純化

①CO2窒息法處死BALB/c小鼠，酒精消毒后將小鼠置于操作臺(tái)上仰臥固定，無菌條件下消毒頸部，剪開頸部皮膚，仔細(xì)分離氣管。②取1 mL注射器抽取37℃ PBS 1.0 mL(含1%EDTA)，緩慢推入(約1 min)氣管，輕揉肺部，停留1 min后再緩慢回抽，得回收液約0.8 mL(首次肺內(nèi)殘留約0.2 mL，以后各次注入量與回收量相等，即為1.0 mL)，重復(fù)灌洗10次(見圖1B)。③離心肺泡灌洗液收集細(xì)胞，用 PBS洗滌3次，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液8 mL重懸后至25 mL培養(yǎng)瓶中，充分混勻后在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，使巨噬細(xì)胞貼壁。④搖晃培養(yǎng)瓶，懸浮未黏附細(xì)胞，吸出細(xì)胞懸液。PBS反復(fù)沖洗，除去未貼壁細(xì)胞，加入10 mL 1%EDTA，以使貼壁細(xì)胞脫落。30 min后回收貼壁細(xì)胞。⑤DMEM培養(yǎng)液洗滌巨噬細(xì)胞3次，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，即得純化后的肺泡巨噬細(xì)胞。

1.3 組織病理學(xué)檢查

經(jīng)灌洗后的肺組織常規(guī)PAS染色，光鏡下觀察肺組織病理變化、新生隱球菌生長和巨噬細(xì)胞吞噬隱球菌狀態(tài)、炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.4 RT-PCR 檢測(cè)

常規(guī)提取肺泡巨噬細(xì)胞RNA后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞源性細(xì)胞因子 (IL-6、IL-8、TGF-β、TNF-α)的 mRNA 表達(dá)，PCR引物信息詳見表1(引物由上海生工有限生物公司合成)。

表1 RT-PCR引物信息表Tab.1 Primer information of RT-PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0。各組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 新生隱球菌吸入感染小鼠模型肺組織病理學(xué)變化

新生隱球菌吸入感染小鼠模型肺部組織病理學(xué)變化見圖2。對(duì)照組(未感染)小鼠肺組織病理(見圖2a，2b);感染后第1天，肺組織病理未見明顯感染灶 (見圖2c，2d);感染后第4天，可見散在分布的隱球菌 (見圖2e，2f);感染后第7天，可見肉芽腫形成(見圖2g，2h);為感染后第11天，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，壞死灶 (見圖2i，2j);感染后第14天，可見完整的肉芽腫，肉芽腫內(nèi)見大量隱球菌 (見圖2k，2l);感染后第18天，隱球菌分布至全肺(見圖2m，2n);感染后第21天，可見肺組織大量壞死，隱球菌彌漫至全肺 (見圖2o，2p)。

2.2小鼠肺泡巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

小鼠肺泡巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA在不同感染時(shí)期的表達(dá)見表2、圖3。TGF-β在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量在感染隱球菌后第4天開始升高，與未感染小鼠相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;隨著感染時(shí)間推移，TGF-β的表達(dá)量進(jìn)一步升高，至第14天出現(xiàn)峰值，至最后一次觀察時(shí)間，TGF-β的表達(dá)量逐漸下降。IL-6在感染后第14天升高與對(duì)照組相比有顯著差異，之后逐漸下降。IL-8一直處于穩(wěn)定高表達(dá)狀態(tài)，但與未感染小鼠相比無顯著性差異。TNF-α波動(dòng)較大，在第7天和第14天表達(dá)水平降低，第11天、18天和21天表達(dá)升高。

表2 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA在不同感染時(shí)期的表達(dá)Tab.2 The mRNA expression of mice alveolar macrophage related cytokines at different infection time points

3 討 論

現(xiàn)今較為成熟的隱球菌感染模型采用的動(dòng)物有豚鼠、兔、小鼠和大鼠，其中小鼠的近交系特性好，飼養(yǎng)方便，無需免疫抑制處理，所以本實(shí)驗(yàn)選擇了小鼠建立隱球菌感染模型。根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道小鼠感染隱球菌毒性測(cè)定，選用感染菌量1×105CFU/鼠，在該菌量侵入條件下，雌性BALB/c小鼠表現(xiàn)出較好的菌株耐受性，未出現(xiàn)急性中毒死亡現(xiàn)象。同時(shí)，為了更好的還原人體感染隱球菌的途徑，本實(shí)驗(yàn)采用氣管吸入新生隱球菌的方法建立模型。感染新生隱球菌后小鼠的死亡時(shí)間通常為3～4周，本實(shí)驗(yàn)選擇的觀察病程時(shí)間點(diǎn)為感染后第1、4、7、11、18、21 天。巨噬細(xì)胞是機(jī)體抵御隱球菌感染的重要非特異性免疫機(jī)制，補(bǔ)體系統(tǒng)以及細(xì)胞免疫都可以刺激增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用起到抗隱球菌感染的作用［3］，但隱球菌也同樣具備多種毒力因子包括莢膜、黑色素、尿素酶、磷脂酶等能抵御或逃避宿主的免疫，比如巨噬細(xì)胞對(duì)隱球菌的吞噬作用與隱球菌的莢膜大小呈負(fù)相關(guān)［4］。研究如何提高巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷作用，對(duì)有效抵御隱球菌的感染，避免隱球菌向中樞神經(jīng)系統(tǒng)擴(kuò)散具有重要意義。

巨噬細(xì)胞與新生隱球菌相互作用產(chǎn)生細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)宿主免疫的重要方面。IL-6、IL-8、TGF-β、TNF-α等細(xì)胞因子是巨噬細(xì)胞生產(chǎn)的重要免疫調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在感染后第1天，肺部病理未見明顯損害，肺泡灌洗液內(nèi)可見散在體積較小新生隱球菌，此時(shí)RT-PCR檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞上IL-6、IL-8、TGF-β、TNF-α 的表達(dá)與未感染小鼠相比均未產(chǎn)生明顯變化。感染后第4天，在小鼠肺組織病理中發(fā)現(xiàn)有散在分布的隱球菌，肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)隱球菌體積增大，出芽增多，此時(shí)TGF-β的表達(dá)水平出現(xiàn)上升。至第7天可見肉芽腫形成，肉芽腫形成是因?yàn)殡S著新生隱球菌菌體的增大，單個(gè)巨噬細(xì)胞已不能完成對(duì)其的吞噬，需要多個(gè)巨噬細(xì)胞聯(lián)合發(fā)揮抗隱球菌效應(yīng)，此時(shí)TGF-β的水平明顯上升，推測(cè)其在巨噬細(xì)胞早期殺傷隱球菌效應(yīng)中起促進(jìn)作用。至感染第11天，肺組織病理可見大量炎性細(xì)胞浸潤，此時(shí)TGF-β的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，TGF-β有很強(qiáng)的趨化單核細(xì)胞的能力，我們推測(cè)炎性細(xì)胞的大量浸潤與TGF-β的升高有關(guān)。到感染第14天，肺組織病理發(fā)現(xiàn)許多完整的肉芽腫，肉芽腫內(nèi)有大量新生隱球菌，此時(shí)TGF-β的表達(dá)量也達(dá)到峰值，之后緩慢下降，考慮TGF-β的下降與此時(shí)巨噬細(xì)胞形成的肉芽腫不能完全殺滅新生隱球菌，反而為新生隱球菌的生長和繁殖提供更為有利的胞內(nèi)生長環(huán)境有關(guān)，更多的隱球菌菌體在巨噬細(xì)胞中增殖后逃逸出來，逐步分布至全肺，導(dǎo)致肺組織大量壞死，小鼠瀕臨死亡。

圖1 a.小鼠吸入感染新生隱球菌模型，b.肺泡灌洗提取巨噬細(xì)胞 圖2 小鼠吸入感染H99后，肺組織隱球菌感染病理學(xué)變化 (a，c，e，g，i，k，m，o.PAS 染色，×100;b，d，f，h，j，l，n，p.PAS 染色，×400) 圖3 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞上不同感染時(shí)期相關(guān)細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá)折線圖Fig.1 a.Mouse model of Cryptococcus neoformans inhalation infection，b.Extraction macrophages by alveolar lavage Fig.2 Lung tissue pathology of mouse after Cryptococcus neoformans infection(a，c，e，g，i，k，m，o.× 100，PAS;b，d，f，h，j，l，n，p.× 400，PAS)Fig.3 Broken line graph of mRNA expression of mouse alveolar macrophage related cytokines at different infection time points

IL-6的表達(dá)在感染前期呈緩慢上升趨勢(shì)，到感染后第14天也達(dá)到峰值，然后緩慢下降，IL-6是Th17細(xì)胞的分化共刺激因子，在隱球菌肺部感染模型中發(fā)現(xiàn)其可以通過刺激Th17的分化及分泌發(fā)揮保護(hù)性抵抗隱球菌感染的作用［5］，本實(shí)驗(yàn)中IL-6的緩慢升高可能與感染后期刺激細(xì)胞免疫逐漸發(fā)揮作用有關(guān)，但當(dāng)疾病病程發(fā)展到無法控制的狀態(tài)，肺部滿布隱球菌的時(shí)候，無論是天然免疫還是細(xì)胞免疫的功能都受到了隱球菌毒力效應(yīng)的抑制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α在巨噬細(xì)胞上的表達(dá)波動(dòng)很大，在感染后第7天出現(xiàn)表達(dá)明顯下降，之后又迅速上升，到第14天又出現(xiàn)下降，再繼以上升，盡管有報(bào)道稱在隱球菌腦膜炎患者中持續(xù)升高的TNF-α對(duì)生存率有明顯促進(jìn)作用［6］，但在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)TNF-α與疾病病程有顯著相關(guān)性，另一項(xiàng)隱球菌感染小鼠模型也沒有發(fā)現(xiàn)TNF-α 的保護(hù)作用［7］。

綜上所述，巨噬細(xì)胞中TGF-β參與了機(jī)體對(duì)抗新生隱球菌感染的天然免疫過程并與疾病病程呈相關(guān)性，當(dāng)TGF-β表達(dá)量下調(diào)時(shí)機(jī)體的感染狀態(tài)已無法控制，對(duì)于TGF-β的具體功能還需進(jìn)一步研究，這也為疾病的治療靶點(diǎn)選擇提供了新的方向。

［1］Shao X，Mednick A，Alvarez M，et al.An innate immune system cell is a major determinant of species-related susceptibility differences to fungal pneumonia［J］.J Immunol，2005，175(5):3244-3251.

［2］Ie S，Quiniones B，Kovitz K.Cryptococcus neoformans［J］.J La State Med Soc，1998，150(12):640-641.

［3］Voelz K，May RC.Cryptococcal interactions with the host immune system［J］.Eukaryot Cell，2010，9(6):835-846.

［4］BolanosB， MitchellTG. PhagocytosisofCryptococcusneoformansby rat alveolar macrophages［J］.J Med Vet Mycol，1989，27(4):203-217.

［5］Wozniak KL，Kolls JK，Wormley FL Jr.Depletion of neutrophils in a protective model of pulmonary cryptococcosis results in increased IL-17A production by gammadelta T cells［J］.BMC Immunol，2012，13:65.

［6］Jarvis JN，Casazza JP，Stone HH，et al.The phenotype of the Cryptococcus-specific CD4+memory T-cell response is associated with disease severity and outcome in HIV-associated cryptococcal meningitis［J］.J Infect Dis，2013，207(12):1817-1828.

［7］Wozniak KL，Ravi S，Macias S，et al.Insights into the mechanisms of protective immunity againstCryptococcus neoformansinfection using a mouse model of pulmonary cryptococcosis［J］.PLoS One，2009，4(9):e6854.