黃芩素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌生物被膜作用研究

趙柳婭 蔣京辰 姚響文 曹穎瑛 姜遠英

(1.第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433;2.中國藥科大學藥理學教研室，南京 210009)

近年來，隨著臨床廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素以及免疫抑制劑等藥物的大量使用，各種介入治療、器官移植等技術(shù)的廣泛開展，真菌感染的患者不斷增多［1］。真菌感染中以白念珠菌 (Candida albicans)比較最高，患者在機體免疫力低下時容易感染，可導致念珠菌陰道炎、念珠菌血癥、鵝口瘡等疾病。白念珠菌對環(huán)境有很強的適應(yīng)能力，可以在體內(nèi)植入的人工器官或?qū)Ч艿壬锊牧媳砻嫘纬缮锉荒?biofilm)，這是一種由基底芽生孢子層、菌絲成分和細胞外多聚基質(zhì)三部分構(gòu)成的白念珠菌結(jié)構(gòu)群體。白念珠菌生物被膜的形成是導致臨床致病真菌反復感染的重要原因［2］。目前臨床對白念珠菌的生物被膜尚無理想對策，一旦發(fā)生，通常不得不取出人工的醫(yī)療裝置［2］。氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LC)等唑類抗真菌藥物是治療念珠菌病的一線藥物，但FLC僅對浮游型白念珠菌有很好的抑制作用，生物被膜型白念珠菌對FLC具有很強的耐藥性，已成為困擾臨床治療的一個重要問題。

黃芩素 (黃芩苷元，Baicalein，BE)是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的有效成份之一。黃芩是常用中藥，其味苦、性寒，歸肺、心、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。黃芩素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等藥理活性，且對血液細胞及肝臟細胞等正常細胞無毒性［3-9］。雖然有研究報道黃芩素具有抗真菌活性，但由于其活性較弱，一直未應(yīng)用于臨床。目前，也尚未有BE與唑類抗真菌藥物協(xié)同抗白念珠菌生物被膜作用的報道。本實驗構(gòu)建白念珠菌生物被膜，應(yīng)用XTT法測定生長動力學，研究BE與FLC協(xié)同抗白念珠菌生物被膜的作用，為臨床治療白念珠菌生物被膜提供了新的安全、有效的聯(lián)合用藥方案。

1 材料和方法

1.1 菌株

白念珠菌國際標準株SC5314由William A.Fonzi(Department of Microbiology and Immunology，Georgetown University，Washington，D.C.)惠贈。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基 RPMI 1640培養(yǎng)液:RPMI 1640(Gibco BRL 公司)10 g，NaHCO32 g，嗎啡啉丙磺酸(morpholine propanesulfonic acid，MOPS，Sigma 公司)34.5 g，加去離子水900 mL溶解，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，去離子水加至1 000 mL，濾過消毒，4℃保存。YPD培養(yǎng)液:酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加去離子水900 mL溶解，蒸餾水加至1 000 mL，高壓滅菌后4℃保存。PBS緩沖液:NaCl 8.0 g，KCl 0.4 g，Na2HPO40.133 g，KH2PO40.06 g，NaHCO30.35 g，加去離子水定容至 1 000 mL，高壓滅菌后4℃保存。

試劑 氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LC)注射液由上海信誼金朱藥業(yè)有限公司提供，黃芩素(Baicalein，BE)和XTT購自Sigma公司，F(xiàn)UN-1和ConA購自Molecular Probe公司，2×SYBR Premix ExTaq購自Takara公司。

1.3 實驗儀器與裝置

Eppendorf 5417R高速冷凍離心機 (Eppendorf)，SW-CT-IF型超凈化工作臺 (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠)，96孔細胞培養(yǎng)板 (Nunclon)，激光共聚焦顯微鏡 (Leica TCS sp)，light Cycler System實時定量Real Time RT-PCR儀，Gene Quant II核酸定量分析儀。

1.4 白念珠菌生物被膜的形成

按照文獻方法進行白念珠菌生物被摸的培養(yǎng)［10］。自含有新鮮生長白念珠菌的YPD瓊脂平板上挑取單克隆接種于YPD培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)過夜 (約16 h)。次日離心收集細胞，PBS洗滌3次，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基，以血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1.0×106cells/mL，加入塑料組織培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)，37℃靜置1 h，棄上清，重新加入 RPMI 1640(含或不含 BE和 FLC)，37℃孵育24 h。

1.5 XTT法測定生物被膜的生長動力學

白念珠菌生物被膜的生長動力學檢測采用XTT法［10］。XXT是一種MTT類似的四唑氮衍生物，該化合物是線粒體脫氫酶的作用底物，可被活細胞線粒體脫氫酶還原成水溶性的棕色甲肷產(chǎn)物，甲肷產(chǎn)物的吸光度與活細胞的數(shù)量成正比。取出上述藥物處理并培養(yǎng)的白念珠菌生物被膜，PBS洗去未黏附細胞，加入XTT-甲萘醌溶液，于37℃黑暗中放置2 h，用酶標儀492 nm處測定吸收度值。

1.6 激光共聚焦顯微鏡 (CSLM)觀察生物被膜

將白念珠菌在塑料培養(yǎng)板中按照生物被膜形成條件培養(yǎng)48 h后，加入含有10 μM FUN-1和25 μg/mL ConA的PBS，37℃孵育45 min，以激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜形成狀況。

1.7 細胞表面疏水性 (Cell Surface hydrophobicity，CSH)測定

白念珠菌細胞表面疏水性采用水-烴兩相測定實驗［11］。刮取細胞以YPD制備成懸液 (OD600=1.0)，每組取1.2 mL懸液置于一潔凈玻璃管內(nèi)，加入0.3 mL正辛烷。旋渦混勻3 min，靜置待兩相分離。兩相分離后立即測定水相的OD600值。以不加正辛烷的YPD培養(yǎng)基的OD600值作為陰性對照。CSH計算方法為:相對疏水性=(OD600對照-OD600實驗)/OD600對照。

1.8 總 RNA的提取及實時定量 Real Time RTPCR實驗

采用一步法抽提白念珠菌總 RNA［12］，檢測OD260和OD280值，考察所提RNA的質(zhì)量，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時定量Real Time RT-PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃ 10 s(變性)，60℃ 20 s(退火)，72℃ 15 s(延伸)，重復40個循環(huán)。熔解曲線 (melting curve program)使用 60 ～95℃，加熱速率 0.1℃ /s。以18S rRNA做為內(nèi)參標準，結(jié)果應(yīng)用軟件Light Cycler system software version 3.5(Roche Diagnostics)進行分析?；虮磉_水平用倍數(shù)變化來表示(2-ΔΔCt法)。實驗中所用引物序列見表 1。

表1 實驗中引物序列Tab.1 Primers sequence used for Real Time RT-PCR in this study

1.9 統(tǒng)計學處理

所有實驗結(jié)果均來自至少3組平行或3次重復實驗，實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0分析軟件進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤 (Mean±S.E.M)表示。

2 結(jié) 果

2.1 白念珠菌生物被膜的形態(tài)觀察

為了比較經(jīng)BE單獨及聯(lián)合FLC處理的白念珠菌生物被膜形態(tài)的差異，將含有BE或FLC及兩者聯(lián)用的白念珠菌在生物被膜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，以FUN-1(可被具代謝活性的細胞轉(zhuǎn)變成橙紅色，染胞漿)和ConA(可結(jié)合白念珠菌細胞壁多糖上的葡萄糖和甘露糖殘基發(fā)出綠色熒光，染胞壁)染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示:正常白念珠菌生物被膜中含有大量菌絲，經(jīng)16 g/mL FLC單獨處理的白念珠菌生物被膜與正常組無顯著差異，4 g/mL BE單獨處理的白念珠菌生物被膜受到一定程度的抑制作用，菌絲減少，而當16 g/mL FLC聯(lián)合4 g/mL BE處理時白念珠菌生物被膜明顯受到抑制，結(jié)構(gòu)疏松，菌絲成分明顯減少，極易從附著物上脫落 (見圖2)。

2.2 BE與FLC協(xié)同抑制白念珠菌生物被膜形成的作用

白念珠菌生物被膜黏附1 h后，用4 g/mL BE、16 g/mL FLC單獨及兩者聯(lián)合處理白念珠菌，24 h后XTT法測定生物被膜的生長動力學，結(jié)果表明，BE與FLC聯(lián)用對白念珠菌生物被膜形成抑制能力增強，16 g/mL的FLC對白念珠菌生物被膜的抑制率為27%，4 g/mL的BE對白念珠菌生物被膜的抑制率為43%，16 g/mL的FLC聯(lián)合4 g/mL BE可對白念珠菌生物被膜的抑制率達91%(見圖3a)。白念珠菌生物被膜培養(yǎng)24 h后，用4 g/mL BE、16 g/mL FLC單獨及兩者聯(lián)合處理白念珠菌，再經(jīng)24 h后XTT法測定生物被膜的生長動力學，結(jié)果表明，BE與FLC聯(lián)用對白念珠菌生物被膜形成抑制能力增強，16 g/mL的FLC對白念珠菌生物被膜的抑制率僅為4%，4 g/mL的BE對白念珠菌生物被膜的抑制率為15%，16 g/mL的FLC聯(lián)合4 g/mL BE可對白念珠菌生物被膜的抑制率可達55%(見圖3b)。

2.3 BE與FLC聯(lián)用對白念珠菌生物細胞表面疏水性及相關(guān)基因表達的影響

刮取經(jīng)BE、FLC單獨及兩者聯(lián)合處理的白念珠菌生物被膜，測定CSH值，結(jié)果可見，在FLC濃度為16 g/mL時，白念珠菌的 CSH值為0.92，BE濃度為4 g/mL時，白念珠菌的CSH值為0.65，經(jīng)16 g/mL FLC與4 g/mL BE聯(lián)合處理的白念珠菌CSH值僅為0.08(見圖3)。采用實時定量 RTPCR法測定白念珠菌CSH相關(guān)基因CSH1、菌絲形成調(diào)控基因EFG1、黏附相關(guān)基因HWP1、ALS1的mRNA表達水平，結(jié)果表明，與單用組相比，經(jīng)BE與FLC聯(lián)合處理的白念珠菌 CSH1、EFG1、HWP1基因表達水平明顯下調(diào)，ALS1基因表達水平上調(diào)(見圖4)。

3 討 論

白念珠菌生物被膜形成的一個重要后果是對一些臨床常用抗真菌藥物產(chǎn)生高度耐藥性。有研究報道，白念珠菌形成生物被膜后對氟康唑、兩性霉素B的敏感性下降幾百倍、幾十倍［13-16］。目前，尚無有效的抗真菌藥物可對抗白念珠菌生物膜產(chǎn)生的耐藥性。篩選出一些自身無抗真菌生物被膜活性或者活性較弱、但能對抗真菌藥物有協(xié)同作用的藥物并與之聯(lián)合使用將顯然是一個捷徑，將有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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黃芩素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗病毒等藥理活性，但有關(guān)其抗真菌作用的報道很少。而黃芩素作為天然活性成分，其植物資源豐富，不良反應(yīng)少見，所以黃芩素與唑類抗真菌藥物氟康唑的協(xié)同作用為抗真菌治療提供了安全有效的用藥新思路。

白念珠菌生物被膜形成主要包括三步:黏附、生物被膜生長及成熟，其中細胞的起始黏附對生物被膜的形成非常重要。CSH是白念珠菌重要的毒力因子之一，已有實驗表明，CSH在白念珠菌生物被膜形成中起重要作用，CSH值越大，生物被膜形成能力越強［17-18］。CSH1編碼一種細胞表面疏水性相關(guān)蛋白，是第一個被發(fā)現(xiàn)的可影響白念珠菌CSH表型的候選基因，敲除該基因后白念珠菌的細胞表面疏水性下降［19］。EFG1能夠增強菌絲生長能力，在酵母向菌絲轉(zhuǎn)化的調(diào)控中起著重要作用，是調(diào)節(jié)酵母向菌絲轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控基因。EFG1基因突變時，在誘導菌絲形成的培養(yǎng)基中，菌絲形成均減少，菌絲特異基因表達下降，菌株致病力降低［20］。ALS1、HWP1 基因是白念珠菌黏附素家族的成員，在白念珠菌黏附中起重要作用。白念的黏附是定居和侵襲的先決條件，所以對白念黏附的研究是至關(guān)重要的［21］。本實驗中我們測定了經(jīng)BE單用、FLC單用及兩者聯(lián)合處理的白念珠菌生物被膜的CSH及白念珠菌黏附、細胞表面疏水性、菌絲生長相關(guān)基因表達水平，結(jié)果表明，白念珠菌生物被膜經(jīng)BE聯(lián)合FLC處理后，CSH值降低，CSH1、EFG1、HWP1基因表達水平下調(diào)，而ALS1基因表達水平上調(diào)，提示上述基因表達水平改變而導致的細胞表面疏水性降低、菌絲形成減少、黏附能力降低是BE與FLC協(xié)同抑制白念珠菌生物被膜形成的重要分子機制。

綜上所述，黃芩素與氟康唑聯(lián)用對白念珠菌生物被膜的形成具有抑制作用，其抑制機制涉及改變白念珠菌細胞表面疏水性、菌絲形成及黏附相關(guān)基因mRNA的表達水平，從而降低其細胞表面疏水性、減少菌絲形成，降低細胞黏附能力。黃芩素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌生物被膜作用為臨床治療白念珠菌生物被膜提供了新的安全、有效的聯(lián)合用藥方案。

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