豬腦心肌炎病毒2B蛋白與RACK1蛋白相互作用的鑒定

王 巖，黃 麗, 崔尚金，李江南，楊春梅，于會(huì)彬，郭東偉，張?jiān)澹难┥剑涕L(zhǎng)江*

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物病原監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱 150001）

豬腦心肌炎病毒2B蛋白與RACK1蛋白相互作用的鑒定

王 巖1,2，黃 麗2, 崔尚金2，李江南2，楊春梅2，于會(huì)彬2，郭東偉2，張?jiān)?，夏雪山1*，翁長(zhǎng)江2*

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物病原監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱 150001）

為篩選與豬腦心肌炎病毒(EMCV）2B蛋白相互作用的宿主蛋白，本實(shí)驗(yàn)利用酵母雙雜交方法篩選BHK-21細(xì)胞表達(dá)文庫(kù)制備與EMCV 2B蛋白相互作用的宿主蛋白R(shí)ACK1蛋白。酵母共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和免疫共沉淀試驗(yàn)表明兩者可以特異性結(jié)合，激光共聚焦試驗(yàn)表明兩者共定位于細(xì)胞質(zhì)中。為定位RACK1與2B蛋白相互作用區(qū)域，本研究構(gòu)建了RACK1截短表達(dá)重組質(zhì)粒，并將其與pCAGGS-Flag-2B共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證其相互作用區(qū)域。結(jié)果顯示2B蛋白與宿主細(xì)胞RACK1蛋白存在相互作用，并且證明相互作用區(qū)域位于RACK1蛋白的N端。

豬腦心肌炎病毒；酵母雙雜交；2B蛋白；RACK1蛋白；相互作用

豬腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV）屬于小RNA病毒科，心病毒屬，無囊膜單股正鏈RNA。該病毒主要引起多種哺乳動(dòng)物發(fā)生心肌炎和腦炎等疾病。1958年首次在巴拿馬證明EMCV為豬的一種致死性疾病的病原[1]。EMCV基因組長(zhǎng)7.8 kb，含有一個(gè)大的開放性閱讀框(ORF），編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）[2-3]。其中2B蛋白由326個(gè)氨基酸組成，編碼產(chǎn)物的分子量為17 ku[4]，含有一個(gè)或多個(gè)疏水區(qū)。2B蛋白可以增加細(xì)胞膜的滲透性，這可能對(duì)病毒感染晚期病毒粒子的釋放具有重要的作用[5]。

本研究以EMCV編碼的2B蛋白為“誘餌”，利用酵母雙雜交方法篩選BHK-21細(xì)胞cDNA的酵母表達(dá)文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C1受體(Receptor of activated protein kinase C1，RACK1）與 EMCV 2B 蛋白能夠相互作用。并通過酵母共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、免疫共沉淀(Co-IP）試驗(yàn)和表達(dá)蛋白的共定位試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了2B和RACK1之間的相互作用，本研究為進(jìn)一步研究RACK1在EMCV復(fù)制和致病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞和酵母表達(dá)文庫(kù)E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、重組質(zhì)粒 pCAGGS-Flag-2B、pCMV-HA-RACK1、 pGBKT7、 pGADT7、 pGBKT7-2B、酵母菌 Y2H、HEK293細(xì)胞、BHK細(xì)胞，BHK-21細(xì)胞酵母表達(dá)文庫(kù)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；抗Flag單克隆抗體(MAb）、抗HA MAb、4',6'-二脒基 -2-苯基吲哚(DAPI）、Flag-Beads、羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；抗Flag和抗HA多克隆抗體購(gòu)自艾比馬特公司；羊抗鼠IgG-FITC、羊抗兔IgG-TRITC均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo公司。

1.3 誘餌蛋白的自激活試驗(yàn) 將pGBKT7-2B與pGADT7空載體共轉(zhuǎn)化感受態(tài)Y2H酵母菌，分別在SD/-Ade-Trp(SD/-2）、 SD/-Ade-Trp-Leu-His(SD/-4）及SD/-Ade-Trp-Leu-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A）平 板 上驗(yàn)證pGBKT7-2B是否有自激活作用。陽性對(duì)照質(zhì)粒為pGBKT7-p53+pGADT7-T，陰性對(duì)照質(zhì)粒為pGBKT7-Lam+pGADT7-T。

1.4 酵母雙雜交試驗(yàn) 將pGBKT7-2B轉(zhuǎn)化Y2H酵母菌，涂布于SD/-Trp瓊脂培養(yǎng)基平板上，挑取形態(tài)規(guī)則的單菌落接種至SD/-Trp液體培養(yǎng)基，將菌液用SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸，加入BHK-21酵母表達(dá)文庫(kù)雜交；涂布在SD/-4平板上，并將平板上生長(zhǎng)的陽性克隆轉(zhuǎn)移至SD/-4/X/A平板上做進(jìn)一步篩選；得到的陽性克隆進(jìn)行菌落PCR后測(cè)序并比對(duì)序列，以確定捕獲的宿主蛋白；從陽性酵母菌落中提取捕獲蛋白的酵母表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，以提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酵母共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)驗(yàn)證相互作用。

1.5 共轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 將pGBKT7-2B與pGADT7-RACK1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)Y2H酵母菌，驗(yàn)證兩者間的相互作用，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照pGBKT7+pGADT7，陰性對(duì)照 pGBKT7+pGADT7-T，陽性對(duì)照pGBKT7-p53+pGADT7-T和自激活對(duì)照pGBKT7+pGADT7-RACK1。

1.6 真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以全長(zhǎng)pCMVHA-RACK1為模板擴(kuò)增RACK1截短質(zhì)粒，引物序列見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物與pCAGGS-HA載體分別EcoRⅠ/KpnⅠ酶切后連接，分別構(gòu)建重組RACK1截短表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HA-RACK1-WD1-7、pCAGGSHA-RACK1-WD1-5、 pCAGGS-HA-RACK1-WD1-3、pCAGGS-HA-RACK1-WD2-7、pCAGGS-HA-RACK1-WD6-7。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.7C o-I P試驗(yàn) 將質(zhì)粒pCAGGS-Flag、pCMVHA-RACK1、pCAGGS-Flag-2B和pCMV-HA分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，收集細(xì)胞樣品后裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞裂解液，取出部分加入Flag-beads，剩余部分作對(duì)照。Flag-Beads與蛋白孵育后進(jìn)行western blot檢測(cè)。

1.8 We s t e r nb l o t檢測(cè) Co-IP樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂乳室溫封閉，分別以兔抗HA或抗Flag MAb(1∶1 000）為一抗，以羊抗兔IgG-HRP或羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000）作為二抗，通過ECL發(fā)光檢測(cè)。

1.9 激光共聚焦檢測(cè) 將pCAGGS-Flag-1B和pCMV-HA-RACK1共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，4%甲醛固定、0.3%Triton X-100透膜、10%的FBS血清封閉；以抗Flag MAb和兔抗HA多抗(1∶100）為一抗，羊抗鼠 IgG-TRITC(1∶100）和羊抗兔 IgG-FITC(1∶100）作為二抗；最后用終濃度為1 mM DAPI孵育，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 酵母雙雜交篩選與E MC V2 B蛋白相互作用的宿主蛋白 將pGBKT7-2B誘餌質(zhì)粒與pGADT7空載體共轉(zhuǎn)化Y2H酵母菌，結(jié)果表明pGBKT7-2B無自激活活性。將pGBKT7-2B誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2H酵母菌，再用Trp缺陷型固體培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆與BHK-21酵母表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行雜交，利用SD/-4、SD/-4/X/A培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，將陽性克隆進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)，其中一部分克隆為RACK1編碼序列。

2.2 2 B蛋白與R A C K 1蛋白在酵母體系中的相互作用鑒定 將pGBKT7-2B和pGBKT7空載體與pGADT7-RACK1共轉(zhuǎn)化至Y2H酵母菌，在SD/-4和SD/-4/X/A均能夠生長(zhǎng)出陽性克隆并且無自激活活性，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立，表明2B和RACK1存在相互作用關(guān)系(圖1）。

圖1 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證2B蛋白與RACK1蛋白的相互作用Fig.1 Identification of the interaction between 2B and RACK1 by yeast two-hybrid assay

2.3 E MC V2 B蛋白和R A C K 1蛋白在H E K 2 9 3細(xì)胞中相互作用鑒定 將pCAGGS-Flag-2B、pCMVHA-RACK1、pCAGGS-Flag和pCMV-HA空載體分別轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞；加入Flag beads與細(xì)胞裂解液共孵育。Co-IP樣品經(jīng)western blot分析。結(jié)果顯示，只有在2B與RACK1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，2B和RACK1存在特異性的相互作用(圖2）。

圖2 免疫共沉淀驗(yàn)證2B與RACK1的相互作用Fig.2 Interaction of 2B and RACK1 confirmed by Co-IP

2.4 E MC V2 B蛋白與R A C K 1蛋白共定位 利用激光共聚焦方法檢測(cè)過表達(dá)2B和RACK1的細(xì)胞共定位。將pCAGGS-Flag-2B和pCMV-HA-RACK1共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，24 h后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用一抗和熒光標(biāo)記的二抗孵育后，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)2B和RACK1的共定位。結(jié)果顯示，2B表達(dá)在細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核中，RACK1表達(dá)在細(xì)胞胞質(zhì)中，圖像經(jīng)合并后呈現(xiàn)橙黃色，表明2B和RACK1在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)共定位(圖3）。

圖3 激光共聚焦試驗(yàn)檢測(cè)2B與RACK1的共定位Fig.3 Co-localization of 2B and RACK1 in the cytoplasma of transfected HEK293 cells under confocal microscopy

2.5 E MC V2 B蛋白和R A C K 1蛋白的相互作用區(qū)域鑒定 構(gòu)建5個(gè)pCAGGS-HA-RACK1的截短重組表達(dá)質(zhì)粒(圖4），將其分別與pCAGGS-Flag-2B共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后進(jìn)行Co-IP處理樣品。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，2B蛋白除了和RACK1全長(zhǎng)相互作用外還與RACK1的截短區(qū)域WD1-5、WD1-3相互結(jié)合(圖4），表明2B蛋白與RACK1蛋白的N端相互作用。

圖4 免疫共沉淀驗(yàn)證2B與RACK1的相互作用區(qū)域Fig.4 The minimal domain for the interaction of 2B and RACK1 detected by Co-IP

3 討 論

酵母雙雜交是研究蛋白間相互作用最常用的方法之一，可以高通量地篩選與目的蛋白相互作用的蛋白。Co-IP是一種建立在抗原和抗體親和作用的基礎(chǔ)上，研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。本研究以EMCV 2B蛋白作為“誘餌”，從BHK-21 cDNA細(xì)胞文庫(kù)中篩選到與之相互作用的宿主蛋白R(shí)ACK1，并通過酵母共轉(zhuǎn)化、Co-IP和共定位檢測(cè)證明兩者之間存在相互作用。構(gòu)建RACK1截短重組質(zhì)粒：RACK1-WD1-7、 RACK1-WD1-5、 RACK1-WD1-4、RACK1-WD2-7、RACK1-WD6-7。通過 Co-IP驗(yàn)證RACK1與EMCV 2B相互作用區(qū)域，WD1-7、WD1-5、WD1-3區(qū)域都與2B存在相互作用，通過Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相互作用區(qū)域在N端。

RACK1屬于WD40蛋白家族成員，分子量為36 ku[6]，含有7個(gè)WD(色氨酸和天冬氨酸）重復(fù)基序。這些區(qū)域是在異源三聚體G蛋白的β亞基中被第一次鑒定，而異源三聚體G蛋白在蛋白與蛋白相互作用中起到重要作用[7]。1991年，RACK1首次被鑒定為蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC）受體的結(jié)合蛋白，RACK1作為一種穿梭蛋白，協(xié)同PKC正確定位并發(fā)揮生物學(xué)功能[8-9]。RACK1能夠增強(qiáng)PKC對(duì)腦和肌肉組織芳香羥受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白-1(BMAL1）的磷酸化作用并抑制BMAL1-CLOCK異源二聚體的轉(zhuǎn)錄活性[10]，流感病毒的基質(zhì)蛋白1能夠與RACK1相互作用，被PKC磷酸化。本研究表明EMCV 2B蛋白與RACK1蛋白存在相互作用，為進(jìn)一步研究RACK1在EMCV感染和復(fù)制過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Maurice H.The occurrence ofencephalomyocarditisvirus(EMCV）in European pigs from 1990 to 2001[J].Epidemiol Infect,2005,133(3）:547-557.

[2]Helwig F C,Schmidt C H,A Filter-passing agent producing interstitial myocarditis in anthropoid apes and small animals[J].Science,1945,102(2637）:31-35.

[3]蓋新娜.豬腦心肌炎病毒VP1基因的原核表達(dá)、血清學(xué)調(diào)查及分離毒株的鑒定[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[4]DickG W,BestA,Mengo encephalomyelitis;ahitherto unknown virus affecting man[J].Lancet,1948.2(6521）:286-289.

[5]Carocci M,Bakkali-Kassimi L.The encephalomyocarditis virus[J].Virulence,2012,3(4）:351-367.

[6]Ron D,Chen Che-hong,Caldwell J,et al.Cloning of an intracellular receptor for protein kinase C:A homolog of the b subunit of G proteins[J].PNAS USA,1994,91:839-843.

[7]Fong H K W,Amatruda T T,Birren B W,et al.Distinct forms of the{beta}subunit of G TP-binding regulatory proteins identified by molecular cloning[J].PNAS USA,1987,84(11）:3792-3796.

[8]Brahic M,Bureau J F,Michiels T.The genetics of the persistent infection and demyelinating disease caused by Theiler's virus[J].Annu Rev Microbiol,2005,59:279-298.

[9]RonD,CoordinatedmovementofRACK1withactivated betaIIPKC[J].J Biol Chem,1999.274(38）:p.27039-27046.

[10]Chang B Y,Harte R A,Cartwright C A.RACK1:a novel substrate for the Src protein-tyrosine kinase[J].Oncogene,2002,21(50）:7619-7629.

Identification of the interaction between 2B protein of encephalomyocarditis virus and RACK1

WANG Yan1,2,HUANG Li2, CUI Shang-jin2,LI Jiang-nan2,YANG Chun-mei2,YU Hui-bin2,GUO Dong-wei2,ZHANG Yuan-feng2,XIA Xue-shan1*,WENG Chang-jiang2*
(1.College of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

To screen the host proteins interacted with the 2B protein of encephalomyocarditis virus(EMCV）,we scanned the BHK-21 expression library using EMCV 2B protein as bait protein by yeast-two-hybrid,and found a potential interacting partner protein of RACK1.The interaction of the 2B and RACK1 proteins was further confirmed by co-transformation in the yeast and Co-IP assay in co-transfected HEK293 cells.In addition,they were co-localized in the cytoplasma of co-transfected HEK293 cells examined by laser confocal assays.To map the interacting domain of RACK1,a series of RACK1 truncated eukaryotic expression recombinant plasmids were construct and co-transfected with pCAGGS-Flag-2B into HEK293 cells,respectively,which were subjected to Co-IP and detected by western blot.The results suggested that EMCV 2B interacted with N terminal of RACK1.

encephalomyocarditis virus;yeast-two-hybrid;2B protein;RACK1 protein;interaction

S852.65

A

1008-0589(2014）05-0339-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.05.01

*Correspondingauthor

2013-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(31300139）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)預(yù)算增量項(xiàng)目(2013ZL034）

王 巖(1988-），女，遼寧撫順人，碩士研究生，主要從事豬腦心肌炎病毒與宿主蛋白相互作用研究.

*通信作者：E-mail：oliverxia2000@yahoo.com.cn；wengchji@163.com

(本文編輯：趙曉巖）