Mycoplas mamy coidessubsp.mycoidesBen-1株一個新的膜蛋白的特性研究

周玉梅，汪 洋，李 媛，鄒曉輝，劉素麗，白 帆，吳金迪，辛九慶*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/國家牛傳染性胸膜肺炎指定檢測實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，黑龍江哈爾濱 150001；3.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118）

Mycoplas mamy coidessubsp.mycoidesBen-1株一個新的膜蛋白的特性研究

周玉梅1，汪 洋1，李 媛1，鄒曉輝1，劉素麗1，白 帆3，吳金迪2，辛九慶1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/國家牛傳染性胸膜肺炎指定檢測實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，黑龍江哈爾濱 150001；3.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118）

為研究Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides(Mmm）Ben-1弱毒疫苗傳代致弱的機制，本研究通過比較Mmm Ben-1株和其兔體內(nèi)傳代致弱毒株Ben-470的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)在Ben-470株中缺失了一個編碼165個氨基酸(分子量約19 ku）的495 bp的假定蛋白基因，命名為p588，擴增該基因，并表達重組P588(rP588）蛋白，制備兔抗血清。經(jīng)細菌膜蛋白不同組份的提取及western blot鑒定，結(jié)果顯示P588是一種膜蛋白，并且rP588與CBPP國際標準血清呈陽性反應。通過激光共聚焦顯微鏡觀察到rP588對牛肺細胞(EBL）具有明顯的粘附作用，并且ELISA試驗也證明該蛋白的這種粘附為特異性粘附。上述結(jié)果表明P588蛋白是Mmm Ben-1的一個粘附蛋白。

牛傳染性胸膜肺炎；基因P 588；粘附

Mycoplasmamycoidessubsp.MycoidesSmall Colony(Mmm SC），根據(jù)最新的命名法改名為Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides(Mmm）[1]，是牛傳染性胸膜肺炎(CBPP）的病原。CBPP被OIE列為必須通報的傳染病，該疾病可引起牛呼吸道的一系列病理變化，能夠引起很高的病死率，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟損失。目前，由于經(jīng)濟落后等因素，CBPP在非洲許多國家還大范圍流行[2]。20世紀50年代，中國從感染CBPP的牛體內(nèi)分離到Mmm強毒株Ben-1，將該菌株在兔體內(nèi)連續(xù)傳代470次后，對牛的毒力明顯降低[3]。Ben-1同其兔體傳代致弱株Ben-470在毒力和免疫保護力之間存在明顯的差異，但其致弱機理尚不清楚。

支原體是一種能自我復制的最小的微生物，對宿主細胞的粘附是致病性支原體感染過程的先決條件[4]。雖然粘附因子在許多支原體中已經(jīng)鑒定到[5-7]，但對Mmm的特異性粘附因子的研究鮮有報道。本研究比較了強毒株Mmm Ben-1同其異體動物傳代致弱株Ben-470株全基因組序列，發(fā)現(xiàn)一個假定蛋白編碼基因p588在Mmm Ben-1株中存在而在Ben-470株中缺失。通過原核表達重組P588蛋白，并證明制備的重組P588蛋白可以特異性粘附胎牛肺細胞(EBL），該研究為Mmm Ben-1致病機制及其致弱機理的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、細胞及載體 Mmm Ben-1、Ben-470基因組DNA及cDNA、EBL細胞及pET-30a載體均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 rTaqDNA聚合酶、dNTP、PCR Buffer購自Fermentas公司；CBPP國際標準陽性血清及陰性血清由葡萄牙CBPP國際參考實驗室提供；辣根過氧化酶標記的鼠抗兔IgG(HRP-IgG）、DyLight700羊抗兔 IgG、FITC-鼠抗兔 IgG(FITCIgG）購自Sigma公司；細胞核熒光染料DAPI購自Merk公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自Omega公司；Ni-NTA樹脂購自Novagen公司；激光共聚焦平皿購自Nest公司。

1.3 目的基因的擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以Mmm Ben-1基因組提取物為模板，根據(jù)p588基因序列(KF439701）設計引物，5'-CCCGGATCCATGAAACA CAAAAACAAAC-3'為上游引物，5'-CCCAAGCTTT TAACCTCTAGTTAAAACTTTAG-3'為下游引物，擴增得到全長約為495 bp的目的基因全長片段。同時以Ben-1總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA、Ben-470的基因組DNA、cDNA為模板，以上述引物擴增p588。將PCR產(chǎn)物進行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，克隆于pET-30a載體中。

1.4 重組蛋白的表達與純化 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21中，重組菌經(jīng)IPTG誘導，離心收集菌體超聲破碎，離心后，上清液通過Ni-NTA樹脂，按照Novagen說明書進行重組蛋白純化，純化的蛋白經(jīng)超濾去除咪唑后通過BCA定量試劑盒定量。

1.5 抗重組蛋白兔血清的制備 將500 μL(2 mg/mL）純化后蛋白通過SDS-PAGE電泳后，用250 mM的KCl染色，將目的條帶切下碾碎加入500 μL PBS混勻后直接免疫新西蘭大白兔，每間隔2周免疫1次，共3次。心臟采血制備抗血清，并利用ELISA測定血清效價，免疫前的兔血清為陰性對照。

1.6 重組蛋白的鑒定 將rP588與CBPP國際標準陽性血清(1∶200）反應，上述步驟中制備的抗rP588多克隆抗體(1∶200）和CBPP國際標準陰性血清(1∶200）分別作為陽性對照和陰性對照。鼠抗兔HRP-IgG(1∶8 000）為二抗，通過HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色。

1.7r P 5 8 8在Mmm中的細胞定位 將提取的Mmm Ben-1的細胞膜蛋白和胞漿蛋白進行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜，與抗rP588多克隆抗體(1∶50）反應，rP588蛋白作為陽性對照，Ben-470總蛋白和BSA作為陰性對照。羊抗兔DyLight700-IgG(1∶5 000）為二抗，用紅外熒光掃描儀掃描。

1.8 重組蛋白粘附細胞及粘附抑制試驗 本試驗操作步驟按改進的文獻[8]方法進行。其中每個共聚焦平皿中加入rP588蛋白的量為20 μg，PBST洗去未粘附的蛋白后，以制備的抗重組蛋白多克隆抗體(1:400）為一抗，以鼠抗兔FITC-IgG(1:200）為二抗標記重組蛋白，以1 mL 5 μg/mL的Dii和DAPI分別進行細胞膜和細胞核染色。利用Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡(CLSM）觀察重組蛋白粘附情況。BSA同EBL細胞孵育作為陰性對照組。抑制試驗中，20 μg蛋白先與20 μL的抗rP588多抗37℃孵育30 min，加入固定后的鋪有80%EBL細胞的共聚焦平皿中，其后操作步驟同上。

1.9 重組蛋白的特異性粘附試驗 本試驗操作步驟按文獻[8]的方法加以改進。其中重組蛋白用PBST從100 μg/mL開始進行倍比稀釋至128倍，取每個稀釋度的蛋白溶液100 μL包被ELISA板，37℃孵育 1 h，加入100 μL 1∶200倍稀釋的兔抗重組蛋白血清，37℃孵育1 h后加入鼠抗兔HRP-IgG，37℃孵育1 h，顯色并測其OD450nm值。以上操作均重復3次。另用PBST將兔抗重組蛋白血清依次以5、10、40…倍比稀釋至640倍，取各個稀釋度的血清50 μL與 50 μL 含有 0.5 μg 重組蛋白的 PBST 混合，使蛋白血清混合物中血清稀釋倍數(shù)依次為10、20、40…至1 280，將各個稀釋度的100 μL血清及重組蛋白混合液加入已包被的ELISA板中，依上述方式加一抗二抗標記，并測各個稀釋度的OD450nm值。以上每個操作重復3次。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴增分析及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以Mmm Ben-1全基因組及其總RNA反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到了約500 bp的PCR產(chǎn)物，測序結(jié)果表明目的基因與參考基因完全一致(圖1）。以Ben-470全基因組及其cDNA為模板，未得到相應的PCR產(chǎn)物。

圖1 Mmm Ben-1和Ben-470中p588的克隆和分析Fig.1 Amplification of p588 gene from Mmm Ben-1 and Ben-470

2.2 重組蛋白的原核表達與純化及多克隆抗體的制備 將重組質(zhì)粒p588-pET-30a轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3）感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導表達目的蛋白，經(jīng)Ni-NTA樹脂純化該蛋白，SDS-PAGE電泳顯示該重組蛋白大小約為25 ku(圖 2）。根據(jù)重組蛋白在SDS-PAGE上的大小將其命名為rP588。

2.3 重組蛋白的鑒定 二抗孵育后的NC膜顯色結(jié)果顯示，rP588與CBPP國際標準陽性血清反應在25 ku處出現(xiàn)條帶，與CBPP國際標準陰性血清反應在相應位置未出現(xiàn)條帶。結(jié)果表明，Mmm感染的牛含有抗P588的抗體(圖3）。

圖2 rP588蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE analysis of rP588 protein expression

圖3 rP588蛋白的western blot分析Fig.3 Identification of rP588 by western blot

2.4 r P 5 8 8在Mmm中的細胞定位 將Mmm Ben-1的細胞膜蛋白、胞漿蛋白、總蛋白與兔抗rP588血清反應，在約25 ku處出現(xiàn)條帶，表明P588是Mmm的一個膜蛋白(圖4）。

圖4 rP588蛋白在Mmm中的細胞定位Fig.4 Location of rP588 in Mmm

2.5 r P 5 8 8粘附細胞試驗結(jié)果 通過rP588蛋白直接與多聚甲醛固定的細胞作用，經(jīng)過熒光二抗及DAPI染色，結(jié)果顯示，紅色的細胞膜上及胞漿中存在比較強烈的綠色熒光，其分布輪廓與EBL細胞形態(tài)相似(圖5A），表明rP588蛋白粘附到EBL細胞上。抑制組中，綠色熒光強度明顯變?nèi)?圖5B），表明rP588的抗體能夠抑制該蛋白對EBL細胞的粘附。陰性對照組中，綠色熒光幾乎不可見(圖5C）。

圖5 rP588蛋白對EBL細胞粘附試驗Fig.5 Detection of rP588 adhesion to EBL cells by IFA

圖6 兔抗rP588抗體對rP588蛋白粘附和粘附的抑制Fig.6 Adhesion and adhesion inhibition of rP588 by anti-rP588 serum

2.6 r P 5 8 8對細胞膜蛋白的吸附及吸附抑制試驗結(jié)果 進行ELISA試驗，OD450nm值測定顯示，隨著rP588蛋白濃度的依次降低，膜蛋白所吸附的rP588蛋白量呈明顯的遞減趨勢，表明rP588重組蛋白對膜蛋白具有粘附作用(圖6A）。當?shù)攘縭P588與不同濃度的抗體預先孵育時，高濃度的抗體能與絕大部分蛋白結(jié)合產(chǎn)生抗原抗體復合物，封閉了可能的參與粘附的表位，進而使參入粘附的蛋白大量減少；而當抗體稀釋到1 280倍時，抗體對rP588的結(jié)合減少，參入粘附的重組蛋白也隨之增多(圖6B）。各實驗中空白對照及陰性對照BSA對重組蛋白吸附均處于低水平。以上實驗均重復3次。抑制試驗表明，rP588抗體能夠顯著的抑制該蛋白對EBL細胞膜的粘附。

3 討 論

Mmm是一種最小的擁有完整生物合成系統(tǒng)的病原菌，該病原通過在宿主細胞表面的粘附，繼而激發(fā)宿主細胞的一系列病理反應[9]。Mmm毒力機制的研究，對研發(fā)有效的Mmm弱毒疫苗具有重要意義。Mmm Ben-1弱毒疫苗在異體動物體內(nèi)連續(xù)傳代致弱的機制尚不明確。

在本研究中，選取Ben-1，Ben-470分別代表Mmm中國分離株的強弱毒株，利用PCR和RT-PCR試驗證明了一個假定蛋白基因p588在Ben-470代中缺失。這種通過在體內(nèi)或體外連續(xù)傳代使致病性支原體毒力減弱的方法在支原體中很常見。例如，Mycoplasma bovis2610株在人工改造后的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代以后，對EBL的粘附能力明顯降低，經(jīng)鑒定，一個24 ku的粘附蛋白在高代次菌株中表達量比低代次中低[10-11]；強毒力的低代次Mycoplasma gallisepticumR株在肉湯培養(yǎng)基中連續(xù)傳代數(shù)次后能致弱，并且一個粘附相關(guān)蛋白GapA在致弱菌株中缺失[12]。雖然目前還不能確定Mmm Ben-470中p588的缺失與Mmm的毒力減弱是否有直接聯(lián)系，但P588蛋白的體外粘附試驗表明其在強毒力Mmm Ben-1粘附宿主細胞過程中起著重要作用。

在支原體中，許多粘附相關(guān)蛋白都定位在菌體的細胞膜上。在本研究中，制備了rP588蛋白，利用western blot方法檢測rP588蛋白與CBPP國際標準血清之間的交叉反應陽性，證明了P588蛋白確實在Mmm強毒株中存在，并且具有免疫原性。雖然經(jīng)生物信息學方法預測，P588蛋白缺乏典型的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，但通過支原體蛋白細胞定位試驗證明，P588同時存在Mmm Ben-1的胞膜和胞漿內(nèi)。通過激光共聚焦和間接ELISA方法，證明了rP588對宿主細胞的粘附能力。雖然目前尚無研究證明Mmm在侵染宿主過程中能夠進入宿主細胞內(nèi)，但其他表面寄生的支原體，例如M.pneumonia，M.genitalium和M.gallisepticum，在特殊情況下，能夠寄生在非吞噬細胞內(nèi)[13-14]。最近的一個研究顯示，Mmm的一些分泌型組分能夠侵入牛血液白細胞內(nèi)而引起細胞程序性死亡[15]。巧合的是，本研究表明，rP588能除了能粘附EBL的細胞膜組分，也能與其胞漿組分發(fā)生相互作用。本研究鑒定了一個Mmm的一個差異蛋白的粘附功能，該蛋白的鑒定對Mmm致病機制以及Mmm Ben-1致弱機理的研究有著重要意義。

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Identification of a novel membrane protein in theMycoplasma mycoidessubsp.mycoidessmallcolony Ben-1 strain

ZHOU Yu-mei1,WANG Yang1,LI Yuan1,ZOU Xiao-hui1,LIU Su-li1,BAI Fan3,WU Jin-di2,XIN Jiu-qing1*
(1.National Contagious Bovine Pleuropneumonia Designated Detection Laboratory,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China;2.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150001,China;3.College of Animal Science and Technology,Jilin Agriculture University,Changchun 130118,China）

Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides(Mmm）is the causative agent of contagious bovine pleuropneumonia(CBPP）which had been eliminated by vaccination of attenuated vaccine of the Ben-1 strain since early 1950's in China.To investigate the mechanism of the Mmm attenuation,we compared the entire genomes of the Ben-1 strain and the attenuated Ben-470 strain and revealed that an open reading frame of 495 bp(designed p588 gene）coding for a putative protein of 165 amino acids(about 19 ku）was absent from the Ben-470 strain.Then the p588 gene was cloned from virulent strain of Ben-1 and the recombinant P588(rP588）was expressed inE.coli.In addition,western blot analysis demonstrated that the P588 protein was a membrane-associated protein and reacted positively with the international standard serum against CBPP.Furthermore,the rP588 was able to adhere to embryonic bovine lung cells detected by immunostaining visualised via confocal laser scanning microscopy,and this was also confirmed by a sandwich ELISA.In conclusion,the P588 protein,which exists in Ben-1 strain but deleted from the Ben-470 strain during the attenuated process,is an adhesion protein in Mmm.

Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides;P588 gene;adhesion

S852.61

A

1008-0589(2014）05-0354-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.05.05

*Correspondingauthor

2013-11-09

國家自然科學基金(31072131）

周玉梅(1988-），女，江蘇鹽城人，碩士研究生，主要從事動物支原體表面膜蛋白研究.

*通信作者：E-mail：xinjiuqing2001@sohu.com

(本文編輯：彭永剛）