豬白細(xì)胞介素-2，4作為豬圓環(huán)病毒滅活疫苗免疫增強劑對仔豬免疫效果的研究

章紅兵

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江金華 321007）

豬白細(xì)胞介素-2，4作為豬圓環(huán)病毒滅活疫苗免疫增強劑對仔豬免疫效果的研究

章紅兵

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江金華 321007）

為評價豬白細(xì)胞介素-2，4(PoIL-2，4）與豬圓環(huán)病毒滅活疫苗(PCV2滅活疫苗）聯(lián)合免疫對仔豬免疫增強作用，本研究將60頭三元雜交仔豬隨機平均分成3組，試驗組于14日齡和28日齡注射PCV2滅活疫苗0.5頭份+“PoIL-2，4”0.1 mL，對照組接種PCV2滅活疫苗0.5頭份，空白組注射等體積生理鹽水。結(jié)果顯示：試驗組仔豬各免疫器官指數(shù)均比對照組有所提高，不同日齡淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均顯著高于對照組，外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加，PCV2 ELISA抗體及中和抗體均極顯著高于對照組，攻毒后其臨床癥狀和病理變化未受到影響，抗體水平經(jīng)歷短暫下降后顯著升高，血清和組織中均未檢出PCV2。表明PCV2滅活疫苗與PoIL-2，4聯(lián)合免疫可以提高仔豬對PCV2的細(xì)胞和體液免疫水平，有效阻止病毒在機體內(nèi)的復(fù)制，改善仔豬的生長性能。

IL-2， 4；PCV2滅活疫苗；仔豬；免疫增強；細(xì)胞免疫

多年來，豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus diseases，PCVD）對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，研究結(jié)果顯示豬圓環(huán)病毒滅活疫苗(PCV2滅活疫苗）具有較好的安全性和免疫保護(hù)效力[1-3]。但臨床應(yīng)用表明，PCV2滅活疫苗免疫后存在空白期比較長、免疫保護(hù)期比較短等缺點。

白細(xì)胞介素-2(IL-2）又稱為T細(xì)胞生長因子，可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖與分化，誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒樣活力的殺傷細(xì)胞，誘導(dǎo)及增強殺傷性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活力等。白細(xì)胞介素-4(IL-4）是由活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)活化B細(xì)胞增殖、分化、免疫球蛋白產(chǎn)生，促進(jìn)T細(xì)胞生長、Th2細(xì)胞分化和肥大細(xì)胞增殖。

本實驗將豬白細(xì)胞介素-2，4(PoIL-2，4）與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫，研究其提高仔豬免疫的效果。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料與儀器 PoIL-2，4購自河南納瑞森生物藥業(yè)有限公司(20120622）；PCV2滅活疫苗(SH株）購自洛陽普萊柯生物工程有限公司(120516）；PCV酶聯(lián)免疫診斷試劑盒購自農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心世紀(jì)元亨公司；PCV2-SH株由洛陽普萊柯生物工程有限公司惠贈；Uritest-3000型全自動血細(xì)胞分析儀購自優(yōu)利特集團(tuán)有限公司。

1.2 實驗豬的選擇與分組試驗 選用金華市金淳農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供的遺傳背景相近、ELISA檢測仔豬PCV2抗體一致(p>0.05）的14日齡“杜洛克×(長白×大約克）”三元雜交健康仔豬60頭，隨機分為3組。常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由采食和飲水。試驗組于14日齡和28日齡注射PCV2滅活疫苗0.5頭份+PoIL-2，4 0.1 mL，對照組于14日齡和28日齡注射PCV2滅活疫苗0.5頭份，空白組注射等體積生理鹽水。

1.3 樣品的采集

1.3.1 血液樣品免疫后第21 d、35 d及49 d分別于各組隨機選取4頭仔豬(公母各半）采集靜脈血液4份。其中，1份2 mL肝素鈉抗凝，用于血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗；1份EDTA-K2抗凝血1 mL，用于血細(xì)胞分類計數(shù)；2份制備血清用于抗體檢測。

1.3.2 組織樣品在免疫后第28 d和42 d各組隨機選取4頭仔豬(公母各半），自由飲水條件下禁食24h，稱重后迫殺，采集腹股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和胸腺，并剔除結(jié)締組織，用于檢測免疫器官指數(shù)。

1.4 攻毒試驗 首免后28 d各組隨機選取4頭仔豬(公母各半），經(jīng)口、鼻接種PCV2-SH株2 mL，頸部肌肉注射接種3 mL。

1.5 檢測指標(biāo)及方法 免疫器官指數(shù)測定公式為:免疫器官指數(shù)=免疫器官重量(g）/體質(zhì)量(kg）；血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定參照文獻(xiàn)[4]，采用MTT法；外周血細(xì)胞分類計數(shù)的測定采用全自動血細(xì)胞分析儀測定。

各組分別于首免后第21 d、35 d和49 d前腔靜脈采血，進(jìn)行PCV2抗體檢測。血清樣品中的PCV2抗體檢測按PCV2抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

中和抗體檢測參照文獻(xiàn)[5]方法檢測PCV2中和抗體。

攻毒后每天記錄各組試驗豬采食量、每周每頭試驗豬體質(zhì)量，計算平均每頭仔豬日采食量、平均每頭仔豬日增重以及飼料增重比。觀察各組試驗豬的臨床表現(xiàn)，并于每天早上測量體溫，繪制體溫變化曲線。于攻毒后21 d各組分別迫殺2頭仔豬，觀察病理變化。

ELISA方法測定各組攻毒后第14 d、21 d、28 d和35 d仔豬血清PCV-2抗體水平，并繪制抗體水平動態(tài)消長曲線。將各組攻毒仔豬血清、淋巴結(jié)、肺臟、脾臟及腎臟等組織參照文獻(xiàn)[6]方法檢測PCV2。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理，利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和LDS多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 P o I L-2，4對仔豬免疫器官指數(shù)的影響 迫殺實驗豬、采取并稱重免疫器官，各組免疫器官指數(shù)見表1。結(jié)果顯示，首免后28 d，試驗組仔豬脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著高于對照組(p<0.05）、極顯著高于空白組(p<0.01），試驗組仔豬腹股溝淋巴結(jié)指數(shù)、頜下淋巴結(jié)指數(shù)和肝臟指數(shù)顯著高于空白組(p<0.05），對照組仔豬各免疫器官指數(shù)均顯著高于空白組(p<0.05）；初次免疫后42 d，試驗組仔豬各免疫器官指數(shù)(除肝臟指數(shù)）均顯著高于對照組(p<0.05），試驗組與對照組仔豬各免疫器官指數(shù)均顯著高于空白組(p<0.05），表明PoIL-2，4與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫能夠顯著提高仔豬的免疫力。對照組和試驗組仔豬56日齡時各免疫器官指數(shù)均比42日齡要高，表明PCV2滅活疫苗免疫后仔豬第42 d的免疫力比第28 d更強。

表1 免疫器官指數(shù)Table 1 Immune organ indices(g/kg）

2.2 P o I L-2，4對仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響 測定血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示，試驗組不同日齡淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均顯著高于對照組和空白組(p<0.05），對照組不同日齡淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均顯著高于空白組(p<0.05）。表明PoIL-2，4與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫能夠顯著增強細(xì)胞免疫活性(表2）。

表2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率Table 2 Lymphocyte proliferation(%）

2.3 P o I L-2，4對仔豬外周血細(xì)胞分類計數(shù)的影響外周血細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果顯示，首免后21 d和35 d試驗組外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量比對照組和空白組顯著增加(p<0.05），首免后35 d對照組外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量比空白組顯著增加(p<0.05），紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量有上升的趨勢，但差異不顯著(p>0.05）(圖1）。表明PoIL-2，4與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫比單獨使用PCV2滅活疫苗免疫能夠增加外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強細(xì)胞免疫功能。

圖1 白細(xì)胞介素對仔豬外周血細(xì)胞分類計數(shù)的影響Fig.1 Effects of dietary IL on peripheral blood cell differential counts of piglets

2.4 仔豬P C V 2抗體檢測結(jié)果 免疫后仔豬PCV2抗體檢測，結(jié)果顯示，各組首免后21 d，血清PCV2抗體水平開始上升，試驗組PCV2抗體水平均極顯著高于對照組(p<0.01），表明 PoIL-2，4與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫能夠提高仔豬PCV2抗體水平(圖2）?？瞻捉M21 d后抗體水平快速上升，可能是因為野毒感染所致。

圖2 仔豬PCV2抗體(S/P值）Fig.2 The antibody of PCV2 in piglets(S/P）

2.5 仔豬P C V 2中和抗體檢測結(jié)果 檢測仔豬PCV2中和抗體結(jié)果顯示，在首免后21 d各組仔豬均產(chǎn)生PCV2中和抗體，之后抗PCV2血清中和抗體逐漸升高。首免后試驗組各日齡中和抗體水平均極顯著高于對照組和空白組(p<0.01）(圖3），表明在PCV2滅活疫苗免疫時聯(lián)合PoIL-2，4可以發(fā)揮協(xié)同作用，增強免疫效果。

圖3 仔豬PCV2中和抗體(TCID50值）Fig.3 Neutralizing antibody of PCV2 in piglets(TCID50）

2.6 攻毒對仔豬生長性能的影響 試驗豬首免后28 d攻毒，攻毒后21 d內(nèi)各組仔豬生產(chǎn)性能觀測結(jié)果表明，攻毒后試驗組各個階段平均日增重稍高于對照組，料重比稍低于對照組，但差異不顯著(p>0.05）。試驗組和對照組各階段平均日增重和料重比與空白組對照均有顯著差異(p<0.05）(表3）。表明在PCV2滅活疫苗與PoIL-2，4聯(lián)合免疫能更有效地抵抗野毒感染，保護(hù)仔豬不受野毒侵襲。

2.7 攻毒后仔豬臨床癥狀和病理變化 攻毒后觀察各組試驗豬的臨床表現(xiàn)和病理變化，結(jié)果顯示攻毒后試驗組與對照組仔豬均未出現(xiàn)典型的PMWS臨床癥狀，平均體溫變化見圖4，其中2號仔豬體溫在攻毒后第7 d達(dá)到40.6℃，食欲及精神狀態(tài)欠佳，偶見咳嗽，但3 d后開始逐漸恢復(fù)正常。攻毒后21 d 3組各迫殺2頭仔豬，試驗組與對照組仔豬組織(淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟及肝臟等）均未見明顯病理變化；空白組仔豬淋巴結(jié)腫大，肺呈現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，腎臟水腫、蒼白，脾臟輕度腫大，肝臟發(fā)暗、萎縮。

表3 攻毒后仔豬生長增重情況(kg）Table 3 Weight gain of piglets after challenge(kg）

圖4 攻毒后仔豬平均體溫變化曲線Fig.4 Temperature curve of piglets post challenge

2.8 攻毒后仔豬血清P C V 2抗體水平檢測 ELISA試劑盒檢測攻毒試驗仔豬56日齡、63日齡、70日齡和77日齡血清PCV2抗體水平，結(jié)果顯示攻毒后試驗組和對照組PCV2抗體水平均出現(xiàn)短暫下降，之后開始上升，表明PCV2滅活疫苗免疫或與PoIL-2，4聯(lián)合免疫均能夠抵抗野毒感染；而空白組PCV2抗體水平出現(xiàn)上升，持續(xù)至試驗結(jié)束(圖5）。

2.9 攻毒后仔豬血清和組織中P C V 2檢測 分別對攻毒后7 d、14 d和21 d血清和淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟等組織進(jìn)行PCR檢測，顯示試驗組和對照組仔豬在攻毒后均未檢測到PCV2 DNA，空白組仔豬血清、淋巴結(jié)和肺臟中檢測到PCV2 DNA。表明PCV2滅活疫苗免疫或與PoIL-2，4聯(lián)合免疫均能夠有效阻止病毒在機體內(nèi)的復(fù)制。

圖5 攻毒后仔豬PCV2抗體(S/P值）Fig.5 PCV2 antibody of piglets after challenge(S/P）

3 討 論

IL-1、IL-2、IL-4和IL-12等是機體細(xì)胞免疫中重要的多功能細(xì)胞因子，可作用機體活性免疫細(xì)胞，促進(jìn)其增殖與分化，加強其活性和功能，影響細(xì)胞內(nèi)活性分子的表達(dá)，改善免疫功能，對多種抗原均有增強作用，但大多數(shù)均是以小鼠為實驗動物，證明這些細(xì)胞因子在小鼠中起到了顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[7-9]，關(guān)于PoIL-2，4在對PCV2免疫保護(hù)方面尚未見報道。本實驗表明，PCV2滅活疫苗加入外源性PoIL-2，4淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)上升，明顯提高血液中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，有效促進(jìn)仔豬的細(xì)胞免疫功能。檢測抗體結(jié)果首免后各日齡試驗組ELISA抗體和中和抗體極顯著高于對照組，表明在PCV2滅活疫苗免疫時聯(lián)合PoIL-2，4可以發(fā)揮協(xié)同作用，增強免疫效果。

研究表明，IL-2對機體腹股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、脾臟和胸腺等免疫器官生長發(fā)育有顯著影響，但對肝臟影響不顯著[10-11]。本實驗結(jié)果表明，PoIL-2，4與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫對仔豬免疫器官指數(shù)較對照組均有不同程度的提高。

本實驗中，試驗組比對照組仔豬外周血紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量有所上升，外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加，這在一定程度上表明PoIL-2，4對仔豬的血紅蛋白合成、造血功能的提高有促進(jìn)作用，有利于提高機體非特異性免疫力和清除體內(nèi)的病原微生物，增強細(xì)胞免疫功能。

攻毒保護(hù)試驗表明，試驗組與對照組均能較好地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，免疫仔豬在受到PCV-2攻擊后其臨床癥狀和病理變化未受到影響，抗體水平經(jīng)歷短暫下降后即顯著升高，同時各組織中也未檢測到PCV2的存在。而空白組仔豬攻毒后體溫升高，剖檢可見明顯病理變化，在血清、肺臟和淋巴結(jié)組織中檢測到PCV2。這些結(jié)果與許多學(xué)者的研究結(jié)果基本一致，表明PCV2滅活疫苗或PCV2滅活疫苗與PoIL-2，4聯(lián)合免疫均可以對仔豬起到良好的保護(hù)作用。

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The effect of porcine interleukin-2,4 as immunopotentiator for PCV inactivated vaccine to enhanceimmune responses in piglets

ZHANG Hong-bing

(Jinhua Polytechnic,Jinhua 321007,China）

To investigate the combined immune of porcine circovirus 2(PCV2）inactivated vaccine with PoIL-2,4,a total of 60 crossbred piglets were randomly divided into 3 groups,including the test group inoculation of 0.5 dose PCV2 inactivated vaccine with 0.1 mL PoIL-2,4 at 14 and 28 day-old,the positive control group inoculation of 0.5 dose PCV2 inactivated vaccine and the blank control group.The results indicated that the immune organ index,the lymphocyte proliferation rate under different age and the number of leukocyte and lymphocyte in peripheral blood were significantly increased in the test group,compared to control group.In addition,the antibody and neutralizing antibody were also significantly higher in the test group than that in control group.Moreover,the clinical symptoms and pathological changes were not found,and the PCV2 was not detected in serum and tissue post challenge in the test group,which indicated that the PCV2 inactivated vaccine with PoIL-2,4 was able to significantly improve abilities of lymphocyte proliferation and antibody production to provided effectively protection to the piglets against PCV2.

IL-2,4;PCV2 inactivated vaccine;piglets;immune enhancement;celluar immune

S852.65

A

1008-0589(2014）05-0395-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.05.15

2013-02-06

浙江省科學(xué)技術(shù)項目(2011C22093）

章紅兵(1966-），男，浙江蘭溪人，教授，主要從事豬場管理與豬病防治研究.E-mail：zlrui@126.com

(本文編輯：彭永剛）