豬源屎腸球菌致病力與耐藥性及生物被膜形成能力的相關(guān)性分析

盧彩景，張秀平，陳 陸，趙 軍，王新衛(wèi)，敬文憲，常洪濤，劉紅英，姚慧霞，王川慶，楊 霞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所，河南鄭州 450002）

豬源屎腸球菌致病力與耐藥性及生物被膜形成能力的相關(guān)性分析

盧彩景，張秀平，陳 陸，趙 軍，王新衛(wèi)，敬文憲，常洪濤，劉紅英，姚慧霞，王川慶，楊 霞*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所，河南鄭州 450002）

為研究豬源屎腸球菌的致病力與耐藥性及生物被膜形成能力的相關(guān)性，本研究分別對9株豬源屎腸球菌進行動物試驗、藥敏試驗和生物被膜形成能力的測定。結(jié)果顯示有66.67%的菌株引起小鼠肝臟、脾臟出血等病變，并且其中部分菌株導(dǎo)致接種小鼠急性的高死亡率；9株屎腸球菌中KF-QX-1株耐藥率最高為100%，其次 為 ZKXH01(95.24%）、NY01(90.48%）、NY-XY-4(80.95%）、SBLH(76.19%）、HUAX(71.43%）、NY-XY-1(71.43%）和ZHENGY(66.67%），耐藥率低于50%的菌株只有JY02(14.29%）；生物被膜檢測結(jié)果顯示9株菌中除NY01株外均有不同程度的的被膜形成能力，其中2株菌(JY02和NY-XY-1）生物被膜形成能力相對較強；通過對上述試驗結(jié)果綜合分析顯示，腸球菌菌株對受試動物的致病力與其耐藥性和生物被膜形成能力之間缺乏明顯的相關(guān)性，但具有生物被膜形成及耐藥兩種特性會增強豬源腸球菌的耐藥性和傳播性，給人類和動物的疾病控制造成更大的威脅。

腸球菌；致病力；耐藥性；生物被膜；相關(guān)性

腸球菌(Enterococci）是存在于人和動物胃腸道內(nèi)的常在菌群，偶爾定植于口腔和陰道，并廣泛分布于自然界中，是一種重要的機會致病菌。該菌由于自然寄生于動物的腸道，常被作為一種有益菌進行研究。目前，由于抗生素的大量使用，加上免疫抑制劑的不合理使用等因素，使得腸球菌的感染在醫(yī)學(xué)臨床中日趨嚴(yán)重[1-2]，主要表現(xiàn)為尿路感染、敗血癥、腦膜炎及肺炎等[3]。在獸醫(yī)臨床中近年來也有動物感染的報道[4-6]，腸球菌屬在獸醫(yī)臨診臨床樣品中的分離率不斷增加[7]。

豬源屎腸球菌雖然是健康豬腸道內(nèi)的正常菌群，但由于抗生素的濫用等因素導(dǎo)致該菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重、引起的感染也日益增多，給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境有利于生存的一種生命現(xiàn)象，由微生物及其分泌物積聚而形成。隨著近年來對生物被膜研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對抗生素的耐藥性不僅僅與抗生素不規(guī)范使用有關(guān)，還與致病菌在體內(nèi)形成生物被膜有一定程度相關(guān)性[8]。本研究的目的是通過對臨床豬源屎腸球菌分離株進行致病性試驗、耐藥性測定及生物被膜形成能力檢測，進一步分析豬源屎腸球菌分離株對受試動物的致病力與其耐藥性及生物被膜形成能力有無相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 菌株及實驗動物 9株豬源屎腸球菌分離株均分離自河南各地送檢的病豬，菌株編號分別為NY-XY-4、JY02、SBLH、HUAX、ZHENGY、NY01、NY-XY-1、ZKXH01、KF-QX-1，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室分離純化并于-70℃條件下保存。75只6周齡SPF級昆明實驗小鼠購自河南省實驗動物中心。

1.2 主要試劑 BactoTMTodd Hewitt Broth(THB）培養(yǎng)基購自BD公司；藥敏紙片(共21種）購自杭州天和微生物試劑有限公司；鮮血平板購自河南聯(lián)博生物科技有限公司。

1.3 致病性試驗

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)與計數(shù)將凍存的9株豬源屎腸球菌分離株分別劃線培養(yǎng)于含5%綿羊血的平板上，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于5 mL含5%胎牛血清的THB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于上述新鮮培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)14 h，經(jīng)10倍遞進稀釋在THB瓊脂平板上培養(yǎng)進行菌落計數(shù)。

1.3.2 絕對致死量及最大全不致死量的測定參照文獻[9]的方法，選取1株豬源屎腸球菌NY-XY-4株進行預(yù)實驗。取小鼠25只，隨機分為5組，每組5只，根據(jù)計數(shù)結(jié)果將1～4組分別腹腔注射劑量為：15×109cfu/0.5 mL，7.5×109cfu/0.5 mL，4.5×109cfu/0.5 mL，1.5×109cfu/0.5 mL的PBS重懸菌液各0.5 mL，空白對照組注射PBS 0.5 mL。觀察3 d，記錄發(fā)病與死亡情況。確定其絕對致死量和最大全不致死量。

1.3.3 腸球菌株對小鼠的致病性試驗取小鼠50只隨機分為10組，將9株屎腸球菌均按上述試驗結(jié)果選取絕對致死量和最大全不致死量之間的一個細(xì)菌劑量分別腹腔接種菌液各0.5 mL。對照組小鼠分別注射0.5 mL PBS。觀察3 d，記錄各組小鼠的發(fā)病和死亡情況及相關(guān)病變情況，同時采取每組受試小鼠肝臟接種于THB液體培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)16 h后，鏡檢觀察。

1.4 生物被膜檢測試驗 豬源腸球菌分離株生物被膜形成能力的定量檢測參照文獻[10-11]方法，并稍有改動。簡要步驟如下：挑取單個菌落接種到5 mL含5%胎牛血清的THB(THB-5%）液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜；次日將該培養(yǎng)物按1∶100轉(zhuǎn)接于 5 mL新鮮 THB-5%培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)14 h；將上述菌液用THB-5%培養(yǎng)基按1:40倍稀釋，取稀釋后的菌液200 μL接種到無菌的96孔聚苯乙烯微量板，對照孔加入200 μL培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，用200 μL PBS緩沖液輕緩的洗滌3次，倒置于37℃溫箱中干燥1 h取出，每孔加入 200 μL 1%結(jié)晶紫在室溫下染色15 min，然后吸出結(jié)晶紫并用PBS洗滌至空白對照孔無色或紫色很淺，再加入200 μL 4∶1的乙醇/丙酮于振蕩器上振蕩10 min溶解結(jié)晶紫，吸取溶解液各150 μL于新的孔內(nèi)用酶標(biāo)儀測其OD570nm值，以試驗測得OD570nm值作為細(xì)菌吸附于無機物表面并形成生物被膜能力大小的指標(biāo)。生物被膜形成量的判定標(biāo)準(zhǔn)：以陰性對照的平均OD570nm加標(biāo)準(zhǔn)差定義為ODc，待測菌株OD與ODc比較，將菌株生物膜形成能力分為 4類：陰性(-）：OD4ODc。每株菌做3個平行試驗，試驗共重復(fù)3次。

1.5 藥敏試驗 采用紙片擴散法，參照文獻[12]所述方法進行。

2 結(jié) 果

2.1 各菌株的致病性試驗

2.1.1 絕對致死量及最大全不致死量的測定結(jié)果預(yù)實驗結(jié)果顯示豬源屎腸球菌NY-XY-4株絕對致死量約4.5×109cfu/0.5 mL、最大全不致死量約1.5×109cfu/0.5 mL，選取介于二者之間的細(xì)菌劑量約3.0×109cfu/0.5 mL作為正式試驗的接種劑量。

2.1.2 腸球菌株對小鼠的致病性試驗結(jié)果在3×109cfu/0.5 mL的接種劑量下，有66.67%的菌株顯示出明顯的致病力，其中JY02和ZKXH01株接種12 h后逐漸衰竭死亡，并且肝臟、脾臟、腸道均嚴(yán)重充血，肺臟、胃、輸卵管及卵巢輕微充血；NY-XY-4株接種24 h后逐漸衰竭死亡，主要表現(xiàn)為肝臟、腸道均嚴(yán)重充血，脾臟、肺臟、胃、輸卵管及卵巢輕微充血；其余菌株接種后72 h均未出現(xiàn)死亡，但剖檢可見SBLH、NY01、ZHENGY及NYXY-1株接種的小鼠肝臟、脾臟均嚴(yán)重充血，其余器官輕微充血、出血或無可見變化；HUAX和KF-QX-1株致病輕微，剖檢后僅見內(nèi)部臟器輕微出血或無可見變化，具體致病率與死亡率詳見表1。

表1 各菌株致病性Table1 The pathogenicity ofEnterococcusstrains

2.1.3 菌株的回收 分別采集每組受試小鼠的肝臟接種于THB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)16 h，結(jié)果顯示除對照組外，其余各組的接種物均變輕度混濁，革蘭氏染色后，經(jīng)鏡檢均可看到革蘭氏陽性球菌，表明9株菌接種后均可從小鼠體內(nèi)重新分離到。

2.2 生物被膜形成能力 利用結(jié)晶紫染色半定量法對9株豬源腸球菌分離株進行生物被膜形成能力檢測，結(jié)果顯示：9株菌中除NY01株外均有不同程度的的被膜形成能力，其中2株菌(JY02和NY-XY-1）生物被膜形成能力相對較強，3株菌(ZHENGY、KF-QX-1、SBLH）的被膜形成能力次之，其余豬源腸球菌分離株形成能力較弱(圖1）。

圖1 各菌株生物被膜形成能力Fig.1 The capability of biofilm formation inEnterococcusstrains

2.3 各菌株耐藥特點 藥敏試驗結(jié)果表明9株豬源屎腸球菌的耐藥率為14.29%～100%，并且均對林可霉素和羅紅霉素具有抗性，對其余19種抗生素的耐藥性有一定程度的差異(圖2）。

圖2 各藥敏片的耐藥菌株比例Fig.2 The rate antibiotic-resistantEnterococciin antibiotics

3 討 論

本研究中動物試驗結(jié)果表明，9株豬源屎腸球菌臨床分離株均顯示出有致病性，其中66.67%的菌株致病力明顯，接種后均可引起小鼠內(nèi)臟器官出現(xiàn)不同程度的病變或死亡，并且從各受試組肝臟中均回收到待測菌株。藥敏試驗顯示，9株菌株中除JY02耐藥率稍低(14.29%），其余8株耐藥率均較高(66.67%～100%）。雖然從總體趨勢上絕大多數(shù)高耐藥率菌株均具有一定致病力，但個別菌株的耐藥率與致病力又不完全呈正相關(guān)性，其中耐藥率最低的菌株JY02對小鼠的致病力明顯高于100%多重耐藥菌株KF-QX-1。

生物被膜的形成被認(rèn)為是一種導(dǎo)致抗生素治療失敗的重要機制。與浮游細(xì)菌相比，這種生物膜特有表型能夠激活其耐藥機制，使生物膜細(xì)菌耐藥能力提高10倍～1 000倍[13-14]。本研究結(jié)果顯示有多株豬源屎腸球菌能形成生物被膜，但生物被膜形成能力與細(xì)菌耐藥性無明顯的相關(guān)性，究其原因可能是本研究的耐藥性檢測是在豬源屎腸球菌浮游狀態(tài)下進行的，也從而推斷細(xì)菌生物被膜耐藥與耐藥基因耐藥是相對獨立的作用機制。

另外，文獻報道細(xì)菌生物被膜不僅對抗菌藥物耐藥，而且還可逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用，是造成其在自然界持續(xù)感染的重要原因之一[14-15]。但是目前對生物被膜的研究大多局限于其耐藥性、對環(huán)境抵抗力及造成持續(xù)感染方面，未見細(xì)菌的生物被膜形成能力與致病力呈正相關(guān)的報道。本研究通過對細(xì)菌致病性及生物被膜形成能力測定表明，細(xì)菌的生物被膜形成能力的強弱與其致病力無明顯的正相關(guān)性。

本研究中9株豬源屎腸球菌的致病力與耐藥性、生物被膜形成無明顯的相關(guān)性，提示細(xì)菌的致病力是由多因素協(xié)同作用的結(jié)果。但具有生物被膜形成及多重耐藥兩種特性會增強豬源屎腸球菌的耐藥性和傳播性，給人類和動物的疾病控制造成更大的威脅。

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Correlation analysis among pathogenicity and antibiotic resistance and capability of biofilm formation of
Enterococcus faeciumisolated from swine

LU Cai-jing,ZHANG Xiu-ping,CHEN Lu,ZHAO Jun,WANG Xin-wei,JING Wen-xian,CHANG Hong-tao,LIU Hong-ying,YAO Hui-xia,WANG Chuan-qing,YANG Xia*
(Institute of Poultry Diseases,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China）

This study was conducted to determine the correlation between the biofilm formation and antibiotic resistance and pathogenicity inEnterococci faeciumisolated from swine.The 9 isolates were tested for pathogenicity through animal experiments and identified for the biofilm formation using microtiter plate method and antibiotic resistance by antimicrobial susceptibility test.The results showed that 66.67%of theEnterococciwere manifested comparatively strong virulence,showing the high short-term mortality and mainly with serious hemorrhagic lesions in liver and spleen.Multidrug resistance(≥3 antibiotics）was found in all ofE.faecium,which were KF-QX-1(100%）,ZKXH01(95.24%）,NY01(90.48%）,NY-XY-4(80.95%）,SBLH(76.19%）,HUAX(71.43%）,NY-XY-1(71.43%）,ZHENGY(66.67%）and JY02(14.29%）.Biofilm assay indicated that 8 of 9E.faeciumwere able to form biofilm in different degrees,of which JY02 and NY-XY-1 developed relatively strong biofilm.In conclusion,these results revealed that no significant correlation was found among antibiotic resistance,biofilm formation and pathogenicity to animal for theE.faeciumisolates.

Enterococci;pathogenicity;antibiotic resistance;biofilm formation;correlation

S852.61

A

1008-0589(2014）05-0350-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.05.04

*Correspondingauthor

2013-07-24

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目(30500254）

盧彩景(1990-），女，河南登封人，碩士研究生，主要研究方向為分子病原學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：yangxia66@163.com.

(本文編輯：彭永剛）