中國(guó)部分重點(diǎn)地區(qū)牛結(jié)核病的γ-干擾素試驗(yàn)流行病學(xué)調(diào)查

張喜悅，曹 瑞，杜鵬飛，許 芳，束鴻鵬，呼西旦，范偉興*

(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

中國(guó)部分重點(diǎn)地區(qū)牛結(jié)核病的γ-干擾素試驗(yàn)流行病學(xué)調(diào)查

張喜悅1，曹 瑞1，杜鵬飛1，許 芳1，束鴻鵬1，呼西旦2，范偉興1*

(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

為調(diào)查部分省份牛結(jié)核病(bTB）的流行情況，我們?cè)谏綎|等14個(gè)省份34個(gè)歷史上疫情較重的縣共129個(gè)場(chǎng)戶(hù)采集牛全血2 201份，采用CO2培養(yǎng)箱或蠟罐方法進(jìn)行bTB γ-干擾素檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品的個(gè)體陽(yáng)性率為6.4%，群陽(yáng)性率為42.6%。飼養(yǎng)模式對(duì)bTB感染影響的統(tǒng)計(jì)顯示較大規(guī)模場(chǎng)的個(gè)體陽(yáng)性率(6.9%）和群陽(yáng)性率(60%）均高于散養(yǎng)戶(hù)(分別為5.7%和35.6%）。而牦牛樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。5個(gè)牛群的禽型PPD陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示牛型PPD陽(yáng)性率越高，則禽型PPD陽(yáng)性牛在牛型PPD陽(yáng)性牛中的所占比率越低。在所有陽(yáng)性牛群中，陽(yáng)性率≥10%的牛群所占比例高達(dá)81.8%(45/55），bTB感染呈現(xiàn)出一個(gè)“群發(fā)性”的特征。

牛結(jié)核??；γ-干擾素試驗(yàn)；流行病學(xué)調(diào)查

牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis，bTB）主要是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis）引起的一種牛的慢性消耗性傳染病，該病可以感染人[1]。目前bTB的檢疫主要是由縣級(jí)動(dòng)物疫病控制機(jī)構(gòu)進(jìn)行，缺乏國(guó)家層面上流行病學(xué)調(diào)查的直接數(shù)據(jù)。我國(guó)bTB的法定檢疫方法是頸部牛型結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，該方法需要在牛場(chǎng)進(jìn)行臨床檢測(cè)，而且72 h后必須再次返回牛場(chǎng)測(cè)定皮厚，耗時(shí)耗力。牛全血γ-干擾素(INF-γ）試驗(yàn)是bTB診斷的一種新方法，該方法在歐盟和美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)得到了承認(rèn)[2-3]，成為繼變態(tài)反應(yīng)之外的唯一的法定活畜診斷試驗(yàn)。為了解國(guó)內(nèi)部分地區(qū)bTB的感染狀況，我們嘗試在部分歷史上bTB感染嚴(yán)重的地區(qū)，利用INF-γ試驗(yàn)進(jìn)行了bTB流行病學(xué)調(diào)查，為該病的防制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源及檢測(cè)試劑盒 在國(guó)內(nèi)的14個(gè)省份，歷史上牛結(jié)核菌感染嚴(yán)重的34個(gè)縣129個(gè)場(chǎng)(戶(hù)）采集全血樣品共計(jì) 2 201份(含牦牛血樣 179份）。BOVIGAMTM牛結(jié)核分枝桿菌INF-γ檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Prionics公司。

1.2 抗原刺激 每頭牛采集5 mL血液肝素抗凝血液，室溫下于24 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。將采集的每份抗凝全血各取1.5 mL加入細(xì)胞培養(yǎng)板的3個(gè)不同孔中，取100 μL INF-γ檢測(cè)試劑盒中的牛型PPD、禽型PPD和陰性對(duì)照PBS，分別加入至抗凝全血中，混勻后于5%CO237℃培養(yǎng)16 h。收集上清液(即為刺激產(chǎn)生的INF-γ上清液）。將其進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。

1.3 單純牛型P P D刺激上清I N F-γ方法與國(guó)標(biāo)方法的比對(duì)試驗(yàn) 對(duì)106頭牛血液樣品的刺激上清利用牛INF-γ ELISA按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行檢測(cè)。在單克隆抗體包被板中加入樣品，作用后加入酶標(biāo)檢測(cè)抗體，再次作用后加入底物顯色、終止并判定結(jié)果。當(dāng)牛型PPD刺激上清的OD450nm值-PBS刺激上清的OD450nm值≥0.1為陽(yáng)性，反之為陰性。同時(shí)應(yīng)用現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)方法即牛型PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)106頭牛進(jìn)行檢測(cè)，比較2種方法的符合率。

1.4 C O2培養(yǎng)箱方法與蠟罐方法進(jìn)行I N F-γ E L I S A的比對(duì)試驗(yàn) 采集已知的21頭INF-γ陽(yáng)性反應(yīng)牛和30頭INF-γ陰性反應(yīng)牛的全血，加入牛型PPD等試劑進(jìn)行刺激，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)，即為CO2培養(yǎng)箱方法；將細(xì)胞培養(yǎng)板置于密封培養(yǎng)罐，罐內(nèi)點(diǎn)燃蠟燭產(chǎn)生CO2后于37℃培養(yǎng)，然后獲取INF-γ刺激上清，即為蠟罐方法，比較2種方法的符合性。

1.5 部分重點(diǎn)地區(qū)b T BP P D刺激上清的檢測(cè) 對(duì)采集的2 201份全血分別應(yīng)用牛型PPD、禽型PPD和PBS進(jìn)行刺激，16 h后收獲刺激上清。收獲的刺激上清保存于-20℃，采用BOVIGAMTMELISA試劑盒進(jìn)行INF-γ檢測(cè)。

1.6 部分牛群禽型P P D陽(yáng)性樣品與牛型P P D陽(yáng)性樣品的比對(duì)試驗(yàn) 選取牛型PPD陽(yáng)性率不同的5個(gè)牛群的陽(yáng)性樣品，應(yīng)用BOVIGAMTM試劑盒同時(shí)檢測(cè)牛型PPD、禽型PPD和PBS刺激上清。當(dāng)禽型PPD刺激上清OD450nm值-PBS刺激上清OD450nm值>0.1，并且牛型PPD刺激上清OD450nm值-禽型PPD刺激上清OD450nm值<0.1時(shí)，判定為禽型PPD陽(yáng)性。計(jì)算其禽型PPD陽(yáng)性牛在牛型PPD陽(yáng)性牛中所占的比例，統(tǒng)計(jì)不同牛群禽分枝桿菌等引發(fā)的非特異性反應(yīng)比例。

1.7 結(jié)核陽(yáng)性牛群群內(nèi)陽(yáng)性情況的統(tǒng)計(jì) 在監(jiān)測(cè)的所有牛群中，分別計(jì)算結(jié)核陽(yáng)性牛群中牛型PPD陽(yáng)性率<10%的牛群和≥10%的牛群數(shù)量，統(tǒng)計(jì)牛型PPD陽(yáng)性率≥10%的牛群在所有結(jié)核陽(yáng)性牛群中所占的比例，調(diào)查結(jié)核陽(yáng)性牛群的群內(nèi)陽(yáng)性情況。

2 結(jié) 果

2.1 單純牛型P P D刺激上清I N F-γ檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)方法的比對(duì)試驗(yàn) 106頭牛的INF-γ試驗(yàn)僅統(tǒng)計(jì)其牛型PPD刺激上清減去PBS刺激上清的結(jié)果，與國(guó)標(biāo)方法牛型PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果單純牛型PPD刺激上清INF-γ檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)方法檢出的雙陽(yáng)性牛為78頭，雙陰性牛為21頭，兩者之間的符合率為93.4%(99/106）(表1）。2.2 C O2培養(yǎng)箱方法與蠟罐方法進(jìn)行I N F-γ檢測(cè)的比對(duì)試驗(yàn) 采集已知的21頭INF-γ陽(yáng)性反應(yīng)牛和30頭INF-γ陰性反應(yīng)牛的全血，分別應(yīng)用CO2培養(yǎng)箱和蠟罐方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果21頭陽(yáng)性牛在CO2培養(yǎng)箱和蠟罐方法的檢測(cè)中均為陽(yáng)性，30頭陰性牛在CO2培養(yǎng)箱和蠟罐方法的檢測(cè)中均為陰性。兩組數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異(p>0.05）(表2）。

表1 INF-γ檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)方法的比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果Table1 Comparison of IFN-γ test and single cervical test(SCT）

表2 CO2培養(yǎng)箱方法和蠟罐方法進(jìn)行INF-γ檢測(cè)的比對(duì)試驗(yàn)Table 2 Comparison fermenter and CO2incubator for IFN-γ test

2.3 部分地區(qū)b T BP P D刺激上清的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果

2.3.1 樣品的總陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果在山東等14個(gè)省份的34個(gè)歷史上疫情較重的縣共129個(gè)場(chǎng)戶(hù)采集牛全血2 201份，分別采用牛型PPD、禽型PPD和PBS刺激后收獲上清，使用BOVIGAMTMELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)結(jié)果2.1的結(jié)論，僅檢測(cè)牛型PPD與PBS刺激上清。陽(yáng)性樣品為194份，樣品的表面陽(yáng)性率為8.81%。參考BOVIGAM試劑盒在美國(guó)、澳大利亞等11個(gè)國(guó)家的應(yīng)用數(shù)據(jù)，其平均敏感性和特異性分別為88.3%和96.6%[4]。應(yīng)用Win Episcope2.0軟件分析，將陽(yáng)性率、試劑盒的敏感性和特異性數(shù)據(jù)代入，經(jīng)計(jì)算這些地區(qū)的真實(shí)陽(yáng)性率為6.37%。同樣應(yīng)用軟件對(duì)每個(gè)群進(jìn)行分析，結(jié)果共檢測(cè)129個(gè)群，其中55個(gè)為真實(shí)陽(yáng)性群，群陽(yáng)性率為42.6%。

2.3.2 陽(yáng)性樣品的地域分布除本次流行病學(xué)調(diào)查并未涉及的東南地區(qū)外，東北、西北、西南和華中地區(qū)均有陽(yáng)性樣品，應(yīng)用Win Episcope2.0軟件分析，樣品的真實(shí)陽(yáng)性率從0.8%～10.4%不等，群陽(yáng)性率從9.1%～52.6%不等(表3）。地域分布顯示，東北、華北、西北及華中均有bTB的感染。

2.3.3 不同飼養(yǎng)模式之間的陽(yáng)性率對(duì)比將牛場(chǎng)和采集樣品30頭及以上的養(yǎng)殖戶(hù)作為較大規(guī)模場(chǎng)，其他的個(gè)體養(yǎng)殖戶(hù)作為散養(yǎng)戶(hù)，對(duì)比較大規(guī)模場(chǎng)和散養(yǎng)戶(hù)的群間差異。經(jīng)軟件分析后的結(jié)果表明，較大規(guī)模場(chǎng)的個(gè)體陽(yáng)性率(6.9%）和群感染率(60%）均高于散養(yǎng)戶(hù)(分別為5.7%和35.6%）(表4）。

表3 不同地區(qū)檢測(cè)bTB陽(yáng)性率Table 3 Positive rates of bovine TB in difference regions

表4 不同調(diào)查飼養(yǎng)模式之間的陽(yáng)性率對(duì)比Table 4 Comparison of prevalence in differente feeding scale

2.4 局部地區(qū)牦牛樣品的流行病學(xué)調(diào)查 在西藏、甘肅的4個(gè)縣，采集牦牛全血樣品179份，利用蠟罐方法在當(dāng)?shù)剡M(jìn)行牛型PPD、PBS刺激后，收獲全血刺激上清帶回青島進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)軟件分析，結(jié)果樣品的真實(shí)陽(yáng)性率和群陽(yáng)性率均為0%(表5）。

表5 我國(guó)局部地區(qū)牦牛的bTB感染狀況Table 5 IFN-γ test for yak in 5 herds of Southwest China

2.5 部分牛群禽型P P D陽(yáng)性樣品與牛型P P D陽(yáng)性樣品的比對(duì)試驗(yàn) 選取牛型PPD陽(yáng)性率分別為3.30%(1/30）、6.70%(2/30）、17.90%(5/28）、26.10%(6/23）和40%(10/25）的5個(gè)牛群的陽(yáng)性樣品，應(yīng)用BOVIGAMTM試劑盒同時(shí)檢測(cè)牛型PPD、禽型PPD和PBS刺激上清。結(jié)果禽型PPD陽(yáng)性牛在牛型PPD陽(yáng)性牛中所占的百分比分別為100%(1/1）、50%(1/2）、20%(1/5）、16%(1/6）和 0。這5個(gè)牛群的牛型PPD感染率越高，禽型PPD陽(yáng)性牛在牛型PPD陽(yáng)性牛中的比率越低。

2.6 結(jié)核陽(yáng)性牛群內(nèi)個(gè)體陽(yáng)性率的統(tǒng)計(jì) 監(jiān)測(cè)的所有149個(gè)牛群中，有55個(gè)牛群為結(jié)核陽(yáng)性牛群。在這55個(gè)牛群當(dāng)中，陽(yáng)性率<10%的有10個(gè)牛群，陽(yáng)性率≥10%的有45個(gè)牛群。陽(yáng)性率≥10%的牛群占所有陽(yáng)性牛群的比率為81.8%(45/55）。表明，在所有陽(yáng)性牛群中，感染嚴(yán)重牛群所占的比例很高，即每當(dāng)發(fā)現(xiàn)一個(gè)bTB陽(yáng)性牛群，其陽(yáng)性率往往比較高，bTB感染呈現(xiàn)一個(gè)“群發(fā)性”的特征。

3 討 論

目前國(guó)際上認(rèn)可的活體檢測(cè)方法主要有變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(SCT的敏感性為80%～91%、特異性為75.5%～96.8%，比較變態(tài)反應(yīng)的敏感性為55.1%～93.5%、特異性為88.8%～100%）和bTB INF-γ試驗(yàn)(敏感性和特異性分別為80.9%～100%、87.7%～99.2%）等方法[5-10]。雖然我國(guó)中西部地區(qū)的部分縣級(jí)動(dòng)物疫病控制機(jī)構(gòu)沒(méi)有配備CO2培養(yǎng)箱，不能進(jìn)行INF-γ檢測(cè)，但試驗(yàn)表明蠟罐方法可以替代CO2培養(yǎng)箱方法，最終我們選擇bTB INF-γ試驗(yàn)進(jìn)行該病的流行病學(xué)調(diào)查。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的部分陽(yáng)性樣品，牛型PPD刺激上清OD值減去禽型PPD刺激上清OD值之后小于0.1，應(yīng)判為陰性結(jié)果，但牛型PPD刺激上清的OD值為強(qiáng)陽(yáng)性。這種情況下應(yīng)參考群的感染狀況判定結(jié)果，如果有證據(jù)認(rèn)為該群為感染牛群，仍將該樣本判為陽(yáng)性牛。

實(shí)驗(yàn)表明較大規(guī)模場(chǎng)的個(gè)體陽(yáng)性率和群陽(yáng)性率均略高于散養(yǎng)戶(hù)，該結(jié)果出乎我們的意料，但與Tschopp等的結(jié)果相符，他們也發(fā)現(xiàn)城市和城市周邊大型奶牛場(chǎng)的陽(yáng)性率要高于農(nóng)戶(hù)的陽(yáng)性率[11]。分析本次調(diào)查所涉及的規(guī)模場(chǎng)，多是一些小型規(guī)模場(chǎng)或較大規(guī)模的養(yǎng)殖戶(hù)，如果不能持續(xù)檢疫，群內(nèi)傳播將會(huì)非?？?，導(dǎo)致bTB的感染呈現(xiàn)出“群發(fā)性”的特征。bTB INF-γ試驗(yàn)檢測(cè)牦牛的結(jié)果均為陰性，這可能是由于在高原地區(qū)缺氧，應(yīng)用蠟罐方法導(dǎo)致CO2的產(chǎn)生不足引起的，但該推斷需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

[1]World Organisation for Animal Health(OIE）.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[EB/OL].http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.04.07_BOVINE_TB.pdf,2013-03-01.

[2]United States Department of Agriculture.Bovine tuberculosis eradication uniform methods and rules[M].New York:Law Press,2005,14-19.

[3]Rhodes S G,Gruffydd J T,Gunn M D,et al.Adaptation of IFN-gamma ELISA and ELISPOT tests for feline tuberculosis[J].Vet Immunopathol,2008,124(4）:379-383.

[4]Veterinary Laboratory Agency.Specificity Trial of the BOVIGAMIFN-Gamma Test in GB Cattle[EB/OL].http://archive.defra.gov.uk/foodfarm/farmanimal/diseases/atoz/tb/documents/gifn_specificityreport.pdf,2013-03-01.

[5]Antognoli M C,Remmenga M D,Bengtson S D,et al.Analysis of the diagnostic accuracy of the gamma interferon assay for detection of bovine tuberculosis in U.S.herds[J].Prev Vet Med,2011,101(1-2）:35-41.

[6]Denis M,Wedlock D N,McCarthy A R,et al.Enhancement of the sensitivity of the whole-blood gamma interferon assay for diagnosis of Mycobacterium bovis infections in cattle[J].Clin Vaccine Immunol,2007,(11）:1483-1489.

[7]Schiller I,Vordermeier H M,Waters W R,et al.Bovine tuberculosis:effect of the tuberculin skin test on in vitro interferon gamma responses[J].Vet Immunol Immunopathol,2010,136(1-2）:1-11.

[8]Casal C,Bezos J,Díez-Guerrier A,et al.Evaluation of two cocktails containing ESAT-6,CFP-10 and Rv-3615c in the intradermal test and the interferon-γ assay for diagnosis of bovine tuberculosis[J].Prev Vet Med,2012,105(1-2）:149-154.

[9]Faye S,Moyen J L,Gares H,et al.Determination of decisional cut-off values for the optimal diagnosis of bovine tuberculosis with a modified IFNg assay(Bovigam1）in a low prevalence area in France[J].Vet Microbiol,2011,151(1-2）:60-67.

[10]Ryan T J,Buddle B M,De Lisle G W.An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing[J].Res Vet Sci,2000,69(1）:57-61.

[11]Tschopp R,Abera B,Sourou S Y,et al.Bovine tuberculosis and brucellosis prevalence in cattle from selected milk cooperatives in Arsizone,Oromia region,Ethiopia[J].BMC Vet Res,2013,9:163-169.

Survey of bovine tuberculosis in several area of China by gamma interferon assay

ZHANG Xi-yue1,CAO Rui1,DU Peng-fei1,XU Fang1,SHU Hong-peng1,HU Xi-dan2,FAN Wei-xing1*

(1.China Animal Health＆Epidemiology Center,Qingdao 266032,China;2.Veterinary Research Institute,Animal Science Academy of Xinjiang,Wulumuqi 830000,China）

To investigate the prevalence of bovine tuberculosis(bTB）in some provinces,a total of 2,201 samples of bovine blood were collected from 129 herds with bTB epidemic history in 34 counties of 14 provinces and the plasmas stimulated by bovine PPD,avian PPD and PBS for detection of bovine TB by interferon-γ (INF-γ）test.The results shown that the positives of bovine TB for individual cattle and herds were 6.4%and 42.6%,respectively,detecting the plasma stimulated by bovine PPD in fermenter or CO2incubator.In addition,the positives of bovine TB for individual cattle and herds were 6.9%and 60%in the larger scale farmers which were both higher than in the rural farmers(5.7%and 35.6%respectively）.However,no positive sample was detected in yak.While,by detecting the 5 herds,it was shown that the percentage of avian PPD positive to bovine PPD positive increased when bovine PPD positive rate decreased.The character of"group infection"was disclosed as the 81.8%of serious infected herds(≥10%）to all infected herds.

bovine tuberculosis;IFN-γ test;surveillance

S852.61

A

1008-0589(2014）05-0359-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.05.06

*Correspondingauthor

2013-11-28

科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)(2012FY111000）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS37）

張喜悅(1974-），男，河南?？h人，博士研究生，副研究員，主要從事人畜共患病流行病學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：fwxsjl@126.com

(本文編輯：趙曉巖）