H7N9亞型禽流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及其疫苗候選株的構(gòu)建

李媛媛，郭 晶，李旭勇，王金良，范 俊，梁立濱，鄧國華，施建忠，陳化蘭

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒所引起的一種禽源性疾病，根據(jù)HA和NA的抗原差異可將禽流感病毒(AIV)分為17個H亞型和10個N亞型[1]。雖然家禽中感染H7N9亞型AIV已有報道，但2013年以前，并未發(fā)現(xiàn)其感染人的情況[2]。2013年3月，在上海、安徽兩地出現(xiàn)急性呼吸道感染患者，后被證實為新型H7N9 AIV感染[3]，截止10月25日，出現(xiàn)人感染H7N9亞型AIV 137例，死亡45例，死亡率高達33%。這種新型流感病毒的遺傳背景十分復(fù)雜，是一種多元重組病毒，其HA基因與H7N3具有很高的同源性，NA基因與H4N9、H7N9、H11N9均具有很高的同源性，其內(nèi)部基因來源于H9N2[4-5]。這種對家禽呈現(xiàn)低致病力的病毒很容易在禽類中存在卻因無癥狀而不被注意，但其對人卻具有很高的致病力甚至死亡率[6]，因此建立H7N9亞型AIV反向遺傳操作系統(tǒng)對該病毒致病機理和跨宿主傳播機制的研究以及研制重組疫苗候選株至關(guān)重要。

本研究以H7N9亞型AIV CK/53為親本病毒株，通過建立反向遺傳操作系統(tǒng)，為今后對病毒表型的核酸水平因素的研究提供技術(shù)平臺。構(gòu)建的H7N9亞型AIV疫苗候選株CK53/PR8，為進一步的免疫保護試驗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要實驗材料 A/chicken/Shanghai/S1053/2013(CK/53)由本實驗室分離和保存；PR8反向遺傳操作系統(tǒng)由本實驗室構(gòu)建[7]；雙向表達載體pBD、293T、MDCK、A549細胞由本實驗室保存；10日齡SPF雞胚由本研究所實驗動物中心提供。病毒操作均在動物生物安全三級實驗室完成。

1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV、RNaseOUT、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司；BSPQI酶、Klenow大片段酶、Phusion高保真DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T4 DNA連接酶均購自NEB公司；小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒、膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)mega公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自Qiagen公司。引物由上海英竣生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 病毒基因的擴增 提取CK/53株病毒總RNA，按M-MLV試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物序列為：5'-AGCAAAAGCAGG-3'。根據(jù)CK/53的各片段序列設(shè)計引物，每對引物在上游5'端增加2個堿基CC，在下游3'端增加2個堿基TT。以病毒反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行8個基因片段的擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA膠回收試劑盒純化回收。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 參照文獻[7]中的方法將病毒各節(jié)段基因擴增的PCR產(chǎn)物克隆于pBD載體中，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)中提后用于轉(zhuǎn)染。

1.5 病毒和疫苗候選株的救獲以及序列鑒定 按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將CK/53的8個重組質(zhì)粒0.5 μg混合，共轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后將細胞液接種10日齡SPF雞胚，0.4 mL/枚，37℃培養(yǎng)，48 h后取尿囊液進行血凝(HA)試驗，收集HA結(jié)果呈陽性的雞胚尿囊液分裝后于-70℃保存?zhèn)溆?。同時，提取救獲病毒的RNA，擴增病毒基因組的8個節(jié)段，膠回收后測序，利用DNAStar軟件比較救獲病毒與親本病毒核苷酸序列是否一致。

按上述方法，將來自CK/53的表面基因(pBDHA和pBD-NA)與來源PR8的6個內(nèi)部基因共轉(zhuǎn)染，救獲重組疫苗株。

1.6 拯救病毒與疫苗候選株生長曲線測定 將拯救病毒以MOI=0.001感染MDCK和A549細胞，分別于12 h、24 h、48 h、72 h收取細胞上清液，并繪制病毒生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 CK/53基因8重組質(zhì)粒構(gòu)建和病毒拯救及鑒定用針對CK/53的引物對病毒8節(jié)段基因進行擴增(圖1)，并將CK/53的8個片段處理后分別與處理好的pBD載體連接，構(gòu)建成8質(zhì)粒雙向表達重組質(zhì)粒，對擴增產(chǎn)物進行測序鑒定與親本病毒株一致。利用反向遺傳操作技術(shù)拯救出rCK/53，在雞胚繁殖一代后，血凝價達到28，提取RNA、反轉(zhuǎn)錄，擴增病毒的全基因組片段進行測序，測序結(jié)果與擴增產(chǎn)物無任何缺失或突變。

2.2 疫苗候選株的拯救及全基因組序列測定 用CK/53的含有HA、NA基因的重組質(zhì)粒和來源于PR8的6個內(nèi)部基因的重組質(zhì)粒，8個片段拯救出候選疫苗株，擴增病毒的全基因組片段，測序結(jié)果與親本病毒完全一致。

2.3 拯救病毒與疫苗候選株在MD CK和A 549細胞中的生長曲線 拯救病毒與候選疫苗株在MDCK中，48 h和72 h病毒復(fù)制差異明顯；在A549中的復(fù)制速度基本相同(圖2)。

2013年暴發(fā)的H7N9 AI對人類和家禽的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，本研究采用反向遺傳操作系統(tǒng)，以CK/53為親本病毒，救獲了rCK/53，為進一步開展H7N9流感病毒跨宿主傳播機制和致病機理的研究奠定了基礎(chǔ)；并且以PR8的內(nèi)部基因為骨架，以CK/53的表面基因為供體，構(gòu)建了H7N9亞型AIV疫苗候選株CK53/PR8，為進一步的疫苗評估試驗奠定了基礎(chǔ)。

圖1 AIV CK/538節(jié)段PCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplifications of eight gene segments from AIV of CK/53 by PCR

圖2 拯救病毒與疫苗候選株在MDCK和A549細胞中的生長曲線Fig.2 The cell growth curve in MDCK and A549 of the rCK53 and CK53/PR8

[1]Zhu Xue-yong,Yu Wen-li,McBride R,et al.Hemagglutinin homologue from H17N10 bat influenza virus exhibits divergent receptor-binding and pH-dependent fusion activities[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(4):1458-1463.

[2]朱聞斐，高榮保，王大燕，等.H7亞型禽流感病毒概述[J].病毒學(xué)報，2013，29(003)：245-249.

[3]Gao Rong-bao,Cao Bin,Hu Yun-wen et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus[J].N Engl J Med,2013,368(20):1888-1897.

[4]Shi Jian-zhong,Deng Guo-hua,Liu Pei-hong,et al.Isolation and characterization of H7N9 viruses from live poultry markets-Implication of the source of current H7N9 infection in humans[J].Chin Sci Bull,2013,58(16):1-7.

[5]Zhang Qian-yi,Shi Jian-zhong,Deng Guo-hua,et al.H7N9 influenza viruses are transmissible in ferrets by respiratory droplet[J].Science,2013,341(6144):410-414.

[6]Wen Yu-Mei,Klenk H D.H7N9 avian influenza virus-search and re-search[J].Emerg Microbes Infect,2013,2(5):e26.

[7]范俊，李旭勇，王金良，等.7.2分支H5N1亞型禽流感病毒反向遺傳疫苗候選株的構(gòu)建[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013，35(9)：764-766.