鷹嘴豆愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件的初步探索

付國(guó)勇　蘇豫梅　劉超等

摘要：為了研究鷹嘴豆愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件，確定了種子消毒方法為75%乙醇處理3 min，5%次氯酸鈉溶液處理8 min，無(wú)菌水清洗后播種；鷹嘴豆萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS；成苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IBA；外植體莖段長(zhǎng)度為0.8 cm較為合適；2，4-D和6-BA激素濃度比例為1 ∶1時(shí)對(duì)愈傷組織形成有利，添加過(guò)多有抑制作用，誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為B5+1 mg/L 2，4-D+2 mg/L 6-BA。

關(guān)鍵詞：鷹嘴豆；愈傷組織；培養(yǎng)條件；外植體莖段

中圖分類號(hào)： S529.043；Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0063-03

收稿日期：2013-11-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31160306）；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)校前期課題（編號(hào)：XJAU201202）；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：XJAU2014036）。

作者簡(jiǎn)介：付國(guó)勇（1989—），男，甘肅武威人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：fgyong1212@163.com。

通信作者：蘇豫梅，女，碩士，講師，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)。 E-mail：suema1292005@163.com。鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）是世界上栽培面積較大的食用豆類作物之一，主要分布在世界40多個(gè)國(guó)家，在我國(guó)主要種植于新疆、甘肅等省區(qū)[1]。鷹嘴豆是豆科鷹嘴豆屬植物，起源于亞洲西部和近東地區(qū)，全球栽培面積超過(guò)千萬(wàn)公頃，大多分布在印度、巴基斯坦和土耳其等干旱或半干旱地區(qū)，是世界第三大豆科作物[2-4]。鷹嘴豆是我國(guó)維吾爾族人民喜愛(ài)的一種副食品，在新疆已有2 500年的歷史，種植面積在2萬(wàn)hm2左右[5]。由于鷹嘴豆具有豐產(chǎn)耐旱、直立抗倒伏和較耐高溫的特點(diǎn)，因此十分適合在新疆等干旱和半干旱地區(qū)種植。就其產(chǎn)量而言，目前鷹嘴豆的實(shí)際產(chǎn)量小于 1 t/hm2，遠(yuǎn)低于其5 t/hm2的理論產(chǎn)量，導(dǎo)致其產(chǎn)量過(guò)低的主要因素有干旱、低效落后的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式和病蟲(chóng)害破壞。此外，鷹嘴豆作為一種大規(guī)模種植的豆科作物，其對(duì)于維持地球生物圈氮循環(huán)具有重要意義[6-7]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)鷹嘴豆的研究還處在起步階段，關(guān)于鷹嘴豆的遺傳轉(zhuǎn)化體系在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)擁有地理和資源的優(yōu)勢(shì)，有利于開(kāi)展對(duì)鷹嘴豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究工作。本研究以期為后續(xù)的鷹嘴豆轉(zhuǎn)基因、分子育種、離體組織培養(yǎng)等研究提供技術(shù)支持和理論依據(jù)，為鷹嘴豆經(jīng)濟(jì)效益的提高和鷹嘴豆的高產(chǎn)提供一定的推動(dòng)作用，對(duì)鷹嘴豆品種的改良和推廣具有積極的作用。

1材料與方法

1.1材料

供試鷹嘴豆種子為迪西型鷹嘴豆，由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2種子消毒方法的選擇

選取成熟度好、大小均一的鷹嘴豆種子，分別以100粒種子為1份，進(jìn)行3種消毒試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。方法1：75%乙醇處理8 min后，無(wú)菌水清洗5～6次，無(wú)菌水浸泡 1 d，次日在超凈工作臺(tái)中，播種于1/2MS培養(yǎng)基中；方法2：75%乙醇處理3 min后，用5%次氯酸鈉溶液處理8 min，然后用無(wú)菌水清洗5～6次，無(wú)菌水浸泡1 d，次日于超凈工作臺(tái)中接種于1/2MS培養(yǎng)基中；方法3：0.1%氯化汞處理10 min，無(wú)菌水清洗5～6次，無(wú)菌水浸泡1 d，接種于1/2MS培養(yǎng)基中。用以上3種方法對(duì)鷹嘴豆種子進(jìn)行消毒處理，過(guò)程均在超凈工作臺(tái)中完成。成苗基本培養(yǎng)基配方為1/2MS+30 g/L 蔗糖+Gelzan（一種植物凝膠） 2 g/L+1.97 g/L 氯化鎂+0.4 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。接種3 d后，統(tǒng)計(jì)污染率，計(jì)算公式為：

污染率=污染種子數(shù)/接種總數(shù)×100%。

1.3鷹嘴豆萌發(fā)培養(yǎng)基選擇

選擇最佳消毒方法對(duì)鷹嘴豆進(jìn)行消毒后，于超凈工作臺(tái)中將其分別播種到MS、1/2MS、B5和1/2B5 4種不同的萌發(fā)培養(yǎng)基上，以無(wú)菌水作對(duì)照。每種培養(yǎng)基30瓶，每瓶接種3粒種子，于（26±2） ℃溫度、光照強(qiáng)度為2 000 lx、16-8 h光暗交替培養(yǎng)，接種7 d后觀察種子萌發(fā)及生長(zhǎng)狀況。

1.4不同濃度IBA對(duì)成苗的影響

將IBA設(shè)置為5個(gè)濃度梯度（0、0.5、1、1.5、2 mg/L），分別加入到萌發(fā)培養(yǎng)基中，15 d后觀察其對(duì)鷹嘴豆成苗的影響，每個(gè)濃度梯度10瓶，每瓶播種3粒鷹嘴豆種子，于（26±2） ℃ 溫度、光照強(qiáng)度2 000 lx下16-8 h光暗交替培養(yǎng)，接種 15 d 后觀察種子萌發(fā)及生長(zhǎng)狀況。

1.5外植體大小對(duì)愈傷組織形成的影響

采用鷹嘴豆的莖段為外植體，對(duì)其進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。將生長(zhǎng)15 d的鷹嘴豆無(wú)菌苗分別切取成0.5、0.8、1.5 cm 3個(gè)長(zhǎng)度的外植體，每種長(zhǎng)度接種10瓶，每瓶接種6塊外植體。于（26±2） ℃溫度下，先暗培養(yǎng)2 d，再在光照強(qiáng)度為 2 000 lx、16-8 h光暗交替培養(yǎng)，接種25 d后觀察莖段的出愈情況及生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.6激素對(duì)愈傷組織形成的影響

將生長(zhǎng)15 d的鷹嘴豆無(wú)菌苗切成相同大小的莖段，放置于以B5為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度2，4-D和6-BA的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度接種10瓶，每瓶放置6塊莖段外植體，于（26±2） ℃溫度、光照強(qiáng)度2 000 lx、16-8 h光暗交替培養(yǎng)，接種25 d后觀察莖段的出愈情況及生長(zhǎng)狀態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方法的選擇

分別用3種消毒方法處理后，將鷹嘴豆接種于1/2MS培養(yǎng)基中，觀察鷹嘴豆種子生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)：用方法1消毒處理后的種子在3 d后大部分污染，無(wú)法利用其形成的鷹嘴豆苗；方法2消毒處理后的種子無(wú)污染，且長(zhǎng)勢(shì)較好；方法3消毒處理后的鷹嘴豆種子在第3天開(kāi)始出現(xiàn)褐變的現(xiàn)象，不久后死亡。通過(guò)對(duì)上述結(jié)果的觀察統(tǒng)計(jì)，可以確立鷹嘴豆種子的最佳消毒的方法是方法2，即75%乙醇處理3min，用5%次氯酸鈉溶液處理8 min，然后用無(wú)菌水清洗5～6次并浸泡1 d，次日于超凈工作臺(tái)中接種于成苗培養(yǎng)基中。不同消毒方法對(duì)鷹嘴豆出芽率的影響如圖1所示。

2.2鷹嘴豆種子萌發(fā)培養(yǎng)基的選擇

由圖2可知，5種不同的培養(yǎng)基都可使鷹嘴豆種子發(fā)芽，其中萌發(fā)率最高的是1/2MS。MS、B5、1/2B5 培養(yǎng)基中鷹嘴豆種子萌發(fā)率相差不大，但都不及1/2MS培養(yǎng)基，而鷹嘴豆種子在水中的萌發(fā)率最低。因此，使用1/2MS培養(yǎng)基作為鷹嘴豆種子萌發(fā)培養(yǎng)基。

2.3不同濃度IBA對(duì)成苗的影響

通過(guò)對(duì)添加不同濃度的IBA對(duì)鷹嘴豆成苗的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)：0.5、1 mg/L的IBA對(duì)鷹嘴豆的成苗有促進(jìn)作用，且鷹嘴豆幼苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛，相對(duì)不添加IBA的培養(yǎng)基成苗周期縮短2～3 d，以0.5 mg/L IBA效果最佳；而1.5 mg/L的IBA對(duì)鷹嘴豆的成苗有抑制作用，鷹嘴豆種子在該濃度的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，成苗周期延長(zhǎng)（圖3）。

2.4外植體大小對(duì)愈傷組織形成的影響

通過(guò)對(duì)接種不同大小的外植體對(duì)鷹嘴豆愈傷組織形成結(jié)果的觀察，發(fā)現(xiàn)0.5、0.8 cm的外植體在相同時(shí)間內(nèi)都可形成愈傷組織，但是0.5 cm的莖段形成的愈傷組織過(guò)小，不利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行；0.8 cm的莖段形成的愈傷組織大小合適，愈傷組織的狀態(tài)良好；1.5 cm的莖段形成的愈傷組織兩頭大中間小，且有栓質(zhì)化的情況出現(xiàn)。從圖4可以看出，鷹嘴豆莖段形成愈傷組織的大小以0.8 cm左右較為適宜。

2.5激素對(duì)鷹嘴豆愈傷組織形成的影響

通過(guò)對(duì)不同激素組合的出愈結(jié)果的統(tǒng)計(jì)（表1），發(fā)現(xiàn)2，4-D對(duì)愈傷組織的形成有重要影響，6-BA對(duì)愈傷組織的形成效果不明顯，但是對(duì)愈傷組織的分化有一定作用。因此，誘導(dǎo)鷹嘴豆愈傷組織形成的最適培養(yǎng)基組合為B5+1 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA。

3結(jié)論與討論

3.1種子消毒劑的選擇

3.2硝酸銀對(duì)鷹嘴豆愈傷組織分化及誘導(dǎo)不定芽的影響

在鷹嘴豆不定芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，一定濃度的硝酸銀溶液對(duì)鷹嘴豆愈傷組織的分化有較好效果，但可能會(huì)導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)畸形分化的現(xiàn)象，分析可能與銀離子的毒害作用有關(guān)，可以嘗試在繼代培養(yǎng)時(shí)采用隔代添加的方式來(lái)防止這種毒害作用，但添加適宜濃度的硝酸銀對(duì)不定芽的誘導(dǎo)有利[9]；由于不同激素濃度對(duì)愈傷組織分化有比較大的影響，也可能與培養(yǎng)基中2，4-D和6-BA濃度不合適有關(guān)。

3.3防止外植體褐化的方法

植物離體培養(yǎng)所面臨的一個(gè)主要的問(wèn)題是外植體褐化，外植體的褐化受多種因素影響。目前認(rèn)為造成外植體褐化的原因主要有2個(gè)方面，分別是生物體內(nèi)的多酚氧化酶的氧化作用引起的褐變和非酶促的褐變[10]。植物組織離體培養(yǎng)過(guò)程中使用防止外植體褐化的添加物種類繁多，為減少外植體的褐化和壞死，通常需要在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的抗氧化劑如二硫蘇糖醇（DTT）、PVP、L-半胱氨酸、維生素C、活性炭、2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）等，但是效果有較大的差異，且存在物種的差異[11-12]。在繼代過(guò)程中也可通過(guò)添加活性炭來(lái)防止愈傷組織的褐化，活性炭是一種較強(qiáng)的吸附劑，它可以吸附培養(yǎng)物分泌到培養(yǎng)基中的酚、醌等有害物質(zhì)，從而有效減輕褐變。需要注意的是，活性炭在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，而使其失去作用，影響外植體的正常發(fā)育。因此，在加入活性炭的培養(yǎng)基中應(yīng)適當(dāng)改變激素配比，使得在防止褐變的同時(shí)，外植體能夠正常的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑PVP可以有效抑制鷹嘴豆外植體的褐變。

參考文獻(xiàn)：

[1]寇思榮，王思慧. 幾個(gè)鷹嘴豆品種資源抗旱性的直接鑒定[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，1997，15（3）：120-123.

[2]姚正良，劉秦. 鷹嘴豆種質(zhì)資源鑒定及開(kāi)發(fā)利用前景[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2001（8）：17-18.

[3]海力前木·卡地爾.艾拜都拉·阿布都.新疆迪西型鷹嘴豆中脂肪和蛋白質(zhì)組分的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（17）：10241-10243.

[4]阿米娜·阿布力米提，祖麗哈婭提·那思爾丁，劉 成，等. 諾胡提（鷹嘴豆）的開(kāi)發(fā)利用研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，39（1）：45-47.

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[7]解繼紅，云錦鳳，楊斌，等. 2，4-D和BAP對(duì)蒙古冰草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)草地，2006，28（2）：44-47.

[8]金寶燕，蘇華，任華中. 硝酸銀等因素對(duì)黃瓜直接不定芽誘導(dǎo)的影響[J]. 中國(guó)蔬菜，2006（6）：21-22.

[9]Asmus B，Hanne H. Enzymatic browning of vegetables calibration and analysis of variance by mutiway methods[J]. Chemometrics Intelligent Laboratory Systems，1996，34（1）：85-102.

[10]劉蘭英.‘薄殼香核桃組培中的褐化及防止措施研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2002，29（2）：171-172.

[11]鄭穎，秦紅玫，黎云祥.臺(tái)灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117.

[12]宋欽虎，郭新梅，裴玉賀，等. 抑制玉米幼胚愈傷組織褐化的研究[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，2（5）：24-28.

2.2鷹嘴豆種子萌發(fā)培養(yǎng)基的選擇

由圖2可知，5種不同的培養(yǎng)基都可使鷹嘴豆種子發(fā)芽，其中萌發(fā)率最高的是1/2MS。MS、B5、1/2B5 培養(yǎng)基中鷹嘴豆種子萌發(fā)率相差不大，但都不及1/2MS培養(yǎng)基，而鷹嘴豆種子在水中的萌發(fā)率最低。因此，使用1/2MS培養(yǎng)基作為鷹嘴豆種子萌發(fā)培養(yǎng)基。

2.3不同濃度IBA對(duì)成苗的影響

通過(guò)對(duì)添加不同濃度的IBA對(duì)鷹嘴豆成苗的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)：0.5、1 mg/L的IBA對(duì)鷹嘴豆的成苗有促進(jìn)作用，且鷹嘴豆幼苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛，相對(duì)不添加IBA的培養(yǎng)基成苗周期縮短2～3 d，以0.5 mg/L IBA效果最佳；而1.5 mg/L的IBA對(duì)鷹嘴豆的成苗有抑制作用，鷹嘴豆種子在該濃度的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，成苗周期延長(zhǎng)（圖3）。

2.4外植體大小對(duì)愈傷組織形成的影響

通過(guò)對(duì)接種不同大小的外植體對(duì)鷹嘴豆愈傷組織形成結(jié)果的觀察，發(fā)現(xiàn)0.5、0.8 cm的外植體在相同時(shí)間內(nèi)都可形成愈傷組織，但是0.5 cm的莖段形成的愈傷組織過(guò)小，不利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行；0.8 cm的莖段形成的愈傷組織大小合適，愈傷組織的狀態(tài)良好；1.5 cm的莖段形成的愈傷組織兩頭大中間小，且有栓質(zhì)化的情況出現(xiàn)。從圖4可以看出，鷹嘴豆莖段形成愈傷組織的大小以0.8 cm左右較為適宜。

2.5激素對(duì)鷹嘴豆愈傷組織形成的影響

通過(guò)對(duì)不同激素組合的出愈結(jié)果的統(tǒng)計(jì)（表1），發(fā)現(xiàn)2，4-D對(duì)愈傷組織的形成有重要影響，6-BA對(duì)愈傷組織的形成效果不明顯，但是對(duì)愈傷組織的分化有一定作用。因此，誘導(dǎo)鷹嘴豆愈傷組織形成的最適培養(yǎng)基組合為B5+1 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA。

3結(jié)論與討論

3.1種子消毒劑的選擇

3.2硝酸銀對(duì)鷹嘴豆愈傷組織分化及誘導(dǎo)不定芽的影響

在鷹嘴豆不定芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，一定濃度的硝酸銀溶液對(duì)鷹嘴豆愈傷組織的分化有較好效果，但可能會(huì)導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)畸形分化的現(xiàn)象，分析可能與銀離子的毒害作用有關(guān)，可以嘗試在繼代培養(yǎng)時(shí)采用隔代添加的方式來(lái)防止這種毒害作用，但添加適宜濃度的硝酸銀對(duì)不定芽的誘導(dǎo)有利[9]；由于不同激素濃度對(duì)愈傷組織分化有比較大的影響，也可能與培養(yǎng)基中2，4-D和6-BA濃度不合適有關(guān)。

3.3防止外植體褐化的方法

植物離體培養(yǎng)所面臨的一個(gè)主要的問(wèn)題是外植體褐化，外植體的褐化受多種因素影響。目前認(rèn)為造成外植體褐化的原因主要有2個(gè)方面，分別是生物體內(nèi)的多酚氧化酶的氧化作用引起的褐變和非酶促的褐變[10]。植物組織離體培養(yǎng)過(guò)程中使用防止外植體褐化的添加物種類繁多，為減少外植體的褐化和壞死，通常需要在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的抗氧化劑如二硫蘇糖醇（DTT）、PVP、L-半胱氨酸、維生素C、活性炭、2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）等，但是效果有較大的差異，且存在物種的差異[11-12]。在繼代過(guò)程中也可通過(guò)添加活性炭來(lái)防止愈傷組織的褐化，活性炭是一種較強(qiáng)的吸附劑，它可以吸附培養(yǎng)物分泌到培養(yǎng)基中的酚、醌等有害物質(zhì)，從而有效減輕褐變。需要注意的是，活性炭在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，而使其失去作用，影響外植體的正常發(fā)育。因此，在加入活性炭的培養(yǎng)基中應(yīng)適當(dāng)改變激素配比，使得在防止褐變的同時(shí)，外植體能夠正常的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑PVP可以有效抑制鷹嘴豆外植體的褐變。

參考文獻(xiàn)：

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[4]阿米娜·阿布力米提，祖麗哈婭提·那思爾丁，劉 成，等. 諾胡提（鷹嘴豆）的開(kāi)發(fā)利用研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，39（1）：45-47.

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[8]金寶燕，蘇華，任華中. 硝酸銀等因素對(duì)黃瓜直接不定芽誘導(dǎo)的影響[J]. 中國(guó)蔬菜，2006（6）：21-22.

[9]Asmus B，Hanne H. Enzymatic browning of vegetables calibration and analysis of variance by mutiway methods[J]. Chemometrics Intelligent Laboratory Systems，1996，34（1）：85-102.

[10]劉蘭英.‘薄殼香核桃組培中的褐化及防止措施研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2002，29（2）：171-172.

[11]鄭穎，秦紅玫，黎云祥.臺(tái)灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117.

[12]宋欽虎，郭新梅，裴玉賀，等. 抑制玉米幼胚愈傷組織褐化的研究[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，2（5）：24-28.

2.2鷹嘴豆種子萌發(fā)培養(yǎng)基的選擇

由圖2可知，5種不同的培養(yǎng)基都可使鷹嘴豆種子發(fā)芽，其中萌發(fā)率最高的是1/2MS。MS、B5、1/2B5 培養(yǎng)基中鷹嘴豆種子萌發(fā)率相差不大，但都不及1/2MS培養(yǎng)基，而鷹嘴豆種子在水中的萌發(fā)率最低。因此，使用1/2MS培養(yǎng)基作為鷹嘴豆種子萌發(fā)培養(yǎng)基。

2.3不同濃度IBA對(duì)成苗的影響

通過(guò)對(duì)添加不同濃度的IBA對(duì)鷹嘴豆成苗的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)：0.5、1 mg/L的IBA對(duì)鷹嘴豆的成苗有促進(jìn)作用，且鷹嘴豆幼苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛，相對(duì)不添加IBA的培養(yǎng)基成苗周期縮短2～3 d，以0.5 mg/L IBA效果最佳；而1.5 mg/L的IBA對(duì)鷹嘴豆的成苗有抑制作用，鷹嘴豆種子在該濃度的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，成苗周期延長(zhǎng)（圖3）。

2.4外植體大小對(duì)愈傷組織形成的影響

通過(guò)對(duì)接種不同大小的外植體對(duì)鷹嘴豆愈傷組織形成結(jié)果的觀察，發(fā)現(xiàn)0.5、0.8 cm的外植體在相同時(shí)間內(nèi)都可形成愈傷組織，但是0.5 cm的莖段形成的愈傷組織過(guò)小，不利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行；0.8 cm的莖段形成的愈傷組織大小合適，愈傷組織的狀態(tài)良好；1.5 cm的莖段形成的愈傷組織兩頭大中間小，且有栓質(zhì)化的情況出現(xiàn)。從圖4可以看出，鷹嘴豆莖段形成愈傷組織的大小以0.8 cm左右較為適宜。

2.5激素對(duì)鷹嘴豆愈傷組織形成的影響

通過(guò)對(duì)不同激素組合的出愈結(jié)果的統(tǒng)計(jì)（表1），發(fā)現(xiàn)2，4-D對(duì)愈傷組織的形成有重要影響，6-BA對(duì)愈傷組織的形成效果不明顯，但是對(duì)愈傷組織的分化有一定作用。因此，誘導(dǎo)鷹嘴豆愈傷組織形成的最適培養(yǎng)基組合為B5+1 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA。

3結(jié)論與討論

3.1種子消毒劑的選擇

3.2硝酸銀對(duì)鷹嘴豆愈傷組織分化及誘導(dǎo)不定芽的影響

在鷹嘴豆不定芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，一定濃度的硝酸銀溶液對(duì)鷹嘴豆愈傷組織的分化有較好效果，但可能會(huì)導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)畸形分化的現(xiàn)象，分析可能與銀離子的毒害作用有關(guān)，可以嘗試在繼代培養(yǎng)時(shí)采用隔代添加的方式來(lái)防止這種毒害作用，但添加適宜濃度的硝酸銀對(duì)不定芽的誘導(dǎo)有利[9]；由于不同激素濃度對(duì)愈傷組織分化有比較大的影響，也可能與培養(yǎng)基中2，4-D和6-BA濃度不合適有關(guān)。

3.3防止外植體褐化的方法

植物離體培養(yǎng)所面臨的一個(gè)主要的問(wèn)題是外植體褐化，外植體的褐化受多種因素影響。目前認(rèn)為造成外植體褐化的原因主要有2個(gè)方面，分別是生物體內(nèi)的多酚氧化酶的氧化作用引起的褐變和非酶促的褐變[10]。植物組織離體培養(yǎng)過(guò)程中使用防止外植體褐化的添加物種類繁多，為減少外植體的褐化和壞死，通常需要在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的抗氧化劑如二硫蘇糖醇（DTT）、PVP、L-半胱氨酸、維生素C、活性炭、2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）等，但是效果有較大的差異，且存在物種的差異[11-12]。在繼代過(guò)程中也可通過(guò)添加活性炭來(lái)防止愈傷組織的褐化，活性炭是一種較強(qiáng)的吸附劑，它可以吸附培養(yǎng)物分泌到培養(yǎng)基中的酚、醌等有害物質(zhì)，從而有效減輕褐變。需要注意的是，活性炭在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，而使其失去作用，影響外植體的正常發(fā)育。因此，在加入活性炭的培養(yǎng)基中應(yīng)適當(dāng)改變激素配比，使得在防止褐變的同時(shí)，外植體能夠正常的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑PVP可以有效抑制鷹嘴豆外植體的褐變。

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