骨髓增生異常綜合征患者血紅素加氧酶表達(dá)水平及其臨床意義

解杰 李麗珍 黃濤 王魯群 李顥 李湘新 王玲玲 李芳鄰

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其預(yù)后呈現(xiàn)明顯異質(zhì)性。根據(jù)1997年Greenberg提出的國際預(yù)后評分系統(tǒng)(IPSS)可將MDS分為低危組、中危-1組、中危-2組和高危組。低危組患者多表現(xiàn)為難治性貧血、白細(xì)胞和血小板減少，但原始病態(tài)造血的程度較輕，因而多數(shù)患者生存時間較長。近來研究證實(shí)，低危MDS患者骨髓微環(huán)境中一些應(yīng)激性刺激可引起造血干/祖細(xì)胞過度凋亡從而導(dǎo)致骨髓無效造血和外周血細(xì)胞數(shù)減少[1]。細(xì)胞的高凋亡貫穿于疾病的各個階段，以難治性貧血(MDS-RA)及環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞性難治性貧血(MDS-RAS)為著。目前，低危MDS的治療主要是對癥支持、低甲基化治療等，但療效不理想。血紅素加氧酶-1(HO-1)參與清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，減少細(xì)胞應(yīng)激性凋亡，這種作用可能與MAPK 信號通路有關(guān)[2-3]。本研究通過檢測在不同濃度HO-1誘導(dǎo)劑Hemin干預(yù)下，低危MDS患者HO-1的表達(dá)水平的變化及HO-1基礎(chǔ)水平的變化與患者預(yù)后的關(guān)系，探討HO-1可能的作用機(jī)制和臨床靶向治療的可能。

對象與方法

一、研究對象

采集2008年9月至2012年9月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院血液科就診的60例初治低危MDS患者骨髓，其中男28例、女32例，年齡19～80歲、中位年齡55歲，病程0.5～8.3年、中位病程5.6年。病理分型包括：MDS-RA 45例、MDS-RAS 15例，MDS的診斷符合2008年WHO分型標(biāo)準(zhǔn)[4]。另外，采集同期在我院就診的缺鐵性貧血(IDA)患者20例的骨髓作為對照，男9例、女11例，年齡20～78歲、中位年齡50歲。所有標(biāo)本取材均獲得山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

二、方 法

用蛋白免疫印跡法檢測60例初診低危MDS患者骨髓單個核細(xì)胞(BMMNCs)中HO-1蛋白表達(dá)水平及JNK信號分子磷酸化水平的表達(dá)，并追蹤隨訪MDS患者無進(jìn)展生存期(PFS)。

1.主要材料

胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，Hemin(Sigma公司)，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和磷酸化JNK(p-JNK)、β-actin等一抗及二抗(Cell signaling technology公司)，HO-1一抗(Abcam公司)。

2.BMMNCs的提取與體外孵育

無菌條件下抽取患者骨髓5 mL，予乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，稀釋后加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離BMMNCs。將患者BMMNCs接種于含20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，分為4組，每組接種細(xì)胞濃度為2×106/ml。第2～4組加入不同劑量HO-1誘導(dǎo)劑Hemin，使Hemin在體系中的終濃度分別為5、10、20 μM，第1組培養(yǎng)體系中加入等量無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)。于37℃、含5% 二氧化碳飽和濕度下培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞備用。

3.采用蛋白免疫印跡法檢測BMMNCs中HO-1蛋白和磷酸化JNK信號分子的表達(dá)

用RIPA細(xì)胞裂解液處理BMMNCs，提取總蛋白質(zhì)，測定蛋白濃度。按每孔50 μg蛋白上樣，10%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用封閉液(含50 g/L脫脂牛奶的TBST緩沖液)室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)于4℃孵育過夜。第2日于室溫下洗膜后加入相應(yīng)辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜后用電化學(xué)發(fā)光法顯影。以β-actin條帶作為內(nèi)對照。目的蛋白顯色條帶灰度與內(nèi)參顯色條帶灰度比值代表目的蛋白相對表水平。

4.病例隨訪

隨訪截止日期為2013年10月。對可追蹤的60例患者進(jìn)行PFS分析。PFS是從疾病確診日開始至死亡或疾病進(jìn)展為止。低危MDS患者疾病進(jìn)展定義為粒細(xì)胞或血小板數(shù)較最佳緩解/療效時下降≥50%或血紅蛋白下降≥20 g/L或原始細(xì)胞<5%者的原始細(xì)胞數(shù)增加≥50%達(dá)到5%。將隨訪終止時仍未發(fā)生疾病進(jìn)展和死亡的患者以及失訪患者的生存期作為刪失值處理。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，單因素方差分析中用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間蛋白表達(dá)量比較。進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，并用Log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線。用COX風(fēng)險比例模型分析HO-1對無進(jìn)展生存期的影響。P<0.05為比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、低危MDS患者BMMNCs中HO-1蛋白的表達(dá)水平

60例低危MDS患者HO-1蛋白相對表達(dá)水平為0.450±0.248，與IDA患者水平0.4913±0.2377比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。用不同濃度(0、5、10、20 μM)的HO-1誘導(dǎo)劑Hemin體外孵育BMMNCs 48 h，HO-1蛋白相對表達(dá)水平分別為0.450±0.248、0.695±0.213、0.896±0.202、1.126±0.167，多組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值為18.938，P<0.01)，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t檢驗(yàn)的P值均<0.05)，提示隨著Hemin濃度的增加HO-1蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性逐漸升高，見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測低危MDS患者骨髓單個核細(xì)胞中HO-1蛋白的表達(dá)

二、 HO-1對磷酸化JNK信號分子表達(dá)水平的調(diào)控

不同濃度Hemin孵育BMMNCs 48 h，隨著HO-1蛋白表達(dá)量的逐漸增高，磷酸化JNK信號分子相對表達(dá)水平在各組分別為0.412±0.217、0.632±0.245、0.861±0.221、1.112±0.233，多組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值為17.163，P<0.01)，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t檢驗(yàn)的P均<0.05)。提示隨著HO-1表達(dá)水平的升高，磷酸化JNK信號分子表達(dá)水平也逐漸升高，見圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測低危MDS患者骨髓單個核細(xì)胞中磷酸化JNK信號分子的表達(dá)

三、HO-1表達(dá)水平與低危MDS患者預(yù)后的關(guān)系

1.HO-1表達(dá)水平的高低對低危組患者PFS的影響

以低危MDS患者HO-1蛋白表達(dá)水平的均數(shù)0.450為界，將MDS患者分為兩組，超過0.450為高表達(dá)組，共30例(50%),小于0.450為低表達(dá)組，共30例(50%)。至隨訪截止日，60例患者中25例發(fā)生血液學(xué)疾病進(jìn)展(41.7%)，7例進(jìn)展為MDS-RA伴原始細(xì)胞增多4例或白血病3例(11.7%)。18例(30.0%)疾病好轉(zhuǎn)且穩(wěn)定，至隨訪結(jié)束日未發(fā)生進(jìn)展；8例(13.3%)死亡(死亡原因?yàn)楦腥?例、嚴(yán)重出血2例、高齡1例)；2例(3.33%)失訪。總的PFS為32.8(6.4～57.6)個月，其中HO-1高表達(dá)組患者PFS為41.6(6.4～57.6)個月，低表達(dá)組為32.0(7.4～49.3)個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047)。兩組無病生存率的比較見圖3。

2.COX回歸模型分析

將HO-1蛋白表達(dá)水平納入COX回歸模型中，結(jié)果顯示HO-1表達(dá)水平是判斷低危MDS患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(HR為0.048，95%CI為0.005～0.420，P=0.006，回歸系數(shù)為-3.043)。以上結(jié)果提示HO-1蛋白表達(dá)量的增加將減小低危MDS患者病情進(jìn)展的可能性。

討 論

MDS造血細(xì)胞的高凋亡狀態(tài)貫穿于MDS從低危到高危的各個亞型。Raza于1997年提出低危MDS患者可出現(xiàn)多種凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變，其中包括MAPK通路中的p38 傳導(dǎo)通路及抗凋亡傳導(dǎo)通路ERK、JNK等的異常調(diào)節(jié)，它們多造成DNA合成期階段的造血細(xì)胞凋亡，在高危亞型患者同樣存在凋亡過度的現(xiàn)象，但因其骨髓中出現(xiàn)代償性的惡性細(xì)胞增殖而掩蓋了此現(xiàn)象。骨髓細(xì)胞凋亡的調(diào)控如何影響低危MDS患者的預(yù)后，不同研究者均有相似見解。其中，骨髓造血細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，如血紅素加氧酶/一氧化碳(HO-CO)系統(tǒng)、熱休克蛋白系統(tǒng)和集落刺激因子系統(tǒng)信號的調(diào)節(jié)可明顯抑制細(xì)胞凋亡。Navas等于2006年報道體外抑制低危MDS骨髓細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)其造血祖細(xì)胞集落形成能力顯著增強(qiáng)，說明抑制細(xì)胞凋亡可明顯改善MDS患者骨髓造血。同年，Kim等通過體內(nèi)試驗(yàn)將抗凋亡制劑(己酮可可堿、環(huán)丙沙星、地塞米松等)用于低危MDS患者，發(fā)現(xiàn)隨著骨髓造血細(xì)胞凋亡率的減低其外周血三系細(xì)胞數(shù)明顯提升，提示抑制造血細(xì)胞高凋亡可能是改善低危組MDS患者預(yù)后的一條新途徑。

HO-1 廣泛存在于機(jī)體的各個組織、器官，參與機(jī)體的氧化還原、組織修復(fù)及DNA修復(fù)等多種與細(xì)胞保護(hù)有關(guān)的反應(yīng)，可通過抗氧化、抗應(yīng)激、抗凋亡等發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[5-6]。有學(xué)者在小鼠移植模型中發(fā)現(xiàn)，HO-1單倍體基因突變導(dǎo)致其表達(dá)不足時，會使應(yīng)激狀態(tài)下小鼠骨髓和脾臟各階段紅系造血細(xì)胞數(shù)目減少、鐵代謝再循環(huán)利用受阻、巨噬細(xì)胞分泌TNF-α等造血負(fù)調(diào)控因子增多，說明應(yīng)激狀態(tài)下紅系祖細(xì)胞保持正常的增殖、代謝及分化成熟過程中HO-1起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[7]。Morita等于2009年報道，他們的研究證明HO-CO信號系統(tǒng)的上調(diào)可以抑制p38MAPK途徑信號激活，調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)中干細(xì)胞因子(SCF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，從而調(diào)控造血細(xì)胞的增殖。本研究通過隨訪低危MDS患者的狀況，觀察到HO-1高表達(dá)組患者PFS長于HO-1低表達(dá)組患者。通過COX回歸分析觀察到HO-1的表達(dá)水平是判斷低危組MDS預(yù)后的獨(dú)立因素，提示HO-1是阻止病情進(jìn)展的保護(hù)性因素。上調(diào)HO-1的表達(dá)可能會通過優(yōu)化造血細(xì)胞的增殖條件而減輕造血細(xì)胞的凋亡，從而改善MDS低?；颊叩念A(yù)后狀況。

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證明HO-1可以調(diào)控MAPK信號通路中的JNK發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。Das等于2006年報道在大鼠心肌缺血再灌注模型中，HO-1通過環(huán)鳥苷酸依賴的蛋白激酶G(PKG)可激活JNK從而抑制心肌細(xì)胞壞死和凋亡，而應(yīng)用JNK抑制劑可以阻斷HO-1對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，這說明HO-1可上調(diào)磷酸化JNK信號分子水平的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討HO-1對低危MDS患者預(yù)后的影響，我們給予不同濃度Hemin進(jìn)行體外干預(yù)，發(fā)現(xiàn)隨著HO-1蛋白分子表達(dá)量的逐漸增加，磷酸化JNK信號分子表達(dá)水平也逐漸升高，提示HO-1可能通過調(diào)控JNK信號分子活性來調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增殖與凋亡的過程。

Nagata于1998年提出JNK主要通過調(diào)節(jié)鐵代謝而影響血紅蛋白的合成。在骨髓細(xì)胞中JNK被激活后可進(jìn)一步增強(qiáng)應(yīng)激性轉(zhuǎn)錄因子c-Jun活性，后者可與鐵蛋白H基因的ARE區(qū)結(jié)合，增加鐵蛋白表達(dá)，維護(hù)細(xì)胞內(nèi)鐵平衡，促進(jìn)血紅蛋白的穩(wěn)定而有效合成并誘導(dǎo)紅系造血祖細(xì)胞的分化。JNK還能通過促進(jìn)紅系爆式集落形成單位(BFU-E)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期由G0期過渡到G1期，該過程可能與JNK激活下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1，誘導(dǎo)Cyclin D1基因的表達(dá)有關(guān)。Malcovati等[8]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)低危MDS患者血紅蛋白水平與預(yù)后密切相關(guān)，中重度貧血患者中位生存期明顯低于輕度貧血患者，通過COX回歸分析證明血紅蛋白水平的降低是影響患者預(yù)后的危險因素。HO-1表達(dá)水平上調(diào)可激活JNK信號分子活性，從而進(jìn)一步促進(jìn)紅系造血而有助于改善低危MDS的不良預(yù)后。此外，JNK不僅促進(jìn)紅系造血，在骨髓粒系造血細(xì)胞中，還可通過磷酸化激活CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)轉(zhuǎn)錄因子的活性，后者可能通過上調(diào)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)受體表達(dá)促進(jìn)粒系祖細(xì)胞分化成熟。

HO-1作為一種保護(hù)性因子，其對低危MDS患者PFS的延長作用可能與激活JNK信號分子活動而改善MDS無效造血有關(guān)。Hemin是HO-1誘導(dǎo)劑，在低危MDS中，Hemin可有效上調(diào)HO-1的表達(dá)，具有濃度梯度依賴性，Hemin能否作為新的MDS靶向治療藥物有待于進(jìn)一步探討。綜上所述，HO-1為改善低危組MDS患者預(yù)后以及延長患者生存期提供了一個新的研究方向，而且為呈高度異質(zhì)性的MDS患者個體化治療提供了有力依據(jù)。

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