螺內(nèi)酯對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡和增殖的影響

徐占穩(wěn)，李亞芹，王乾一，王至尊，趙興洲

0 引言

廣泛心肌梗死導(dǎo)致的充血性心力衰竭及心室重構(gòu)(Ventricular remodeling)，以心室擴(kuò)大和心功能降低為特征。在缺氧、缺血再灌注等病理?xiàng)l件下，可以造成心肌細(xì)胞的凋亡。研究表明，急性心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞的持續(xù)性丟失，而且，細(xì)胞凋亡在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。因此，改變細(xì)胞凋亡途徑可以減少心肌的損傷。以往對(duì)醛固酮經(jīng)典的認(rèn)識(shí)是促進(jìn)鈉離子單向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血容量和血壓。但近年來(lái)的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，心肌組織產(chǎn)生的醛固酮可能誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的凋亡，應(yīng)用醛固酮拮抗劑如螺內(nèi)酯、依普利酮，可以大大降低心力衰竭的發(fā)病率和死亡率[1-2]。

成年哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞具有增殖能力，心肌細(xì)胞增殖可作為心臟損傷后修復(fù)再生的基礎(chǔ)[3-4]。最近研究證明，螺內(nèi)酯可以抑制新生大鼠心肌細(xì)胞的增殖[5]，而急性心肌梗死后螺內(nèi)酯是否對(duì)心肌細(xì)胞增殖具有抑制作用尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯進(jìn)行干預(yù)，探討螺內(nèi)酯對(duì)急性心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量250～ 300 g，河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SD大鼠隨機(jī)分為3組：SHAM組、MI組和SPI組。模型制作：大鼠麻醉固定后，氣管插管，連接小型動(dòng)物呼吸機(jī)。于左側(cè)第4肋間開胸，剪開心包暴露心臟，在左冠狀動(dòng)脈前降支起始段下2～3 mm處用5～0絲線結(jié)扎。以結(jié)扎線下方心肌色澤變暗，室壁活動(dòng)減弱為梗死模型成功。假手術(shù)組僅穿線繞過(guò)前降支根部而不結(jié)扎。繼續(xù)喂養(yǎng)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(第7天)[6]。建立SHAM組大鼠模型14只，MI組13只，SPI組13只，SPI組術(shù)后即給予螺內(nèi)酯灌胃,100 mg/(kg·d)[2]，SHAM組和MI組分別予等量生理鹽水灌胃。處死大鼠前再次麻醉開胸，于左心室心尖部用5/0無(wú)損傷線做一直徑約5 mm的荷包，中心部插入1.5 mm的帶針芯監(jiān)測(cè)管至左心室，拔出針芯后監(jiān)測(cè)管接轉(zhuǎn)換器于Maclab多功能生理儀，檢測(cè)左心室舒張末期壓(LVEDP)、收縮末期壓(LVESP)、收縮期左心室最大收縮上升速率(+dp/dtmax)和舒張期左心室最大下降速率(-dp/dtmax)，計(jì)算左心室壓(LVDP)，LVDP= LVESP-LVEDP。處死大鼠后，留取結(jié)扎線以下與房室溝平行的心肌組織，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(4 μm厚)，粘片，烘烤。

1.2 原位細(xì)胞死亡檢測(cè) 羅氏凋亡檢測(cè)試劑盒,采用TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明及封片觀察。各標(biāo)本在10×40倍光鏡下隨機(jī)采6～10個(gè)視野，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像計(jì)數(shù)和分析，以心肌凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率。

1.3 PCNA免疫組化染色 PCNA試劑(sc-9707)購(gòu)自北京中杉金橋，1·100；SP免疫組織化學(xué)方法染色檢測(cè),DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明及封片觀察。在10×40倍光鏡下采集標(biāo)本圖像，每一標(biāo)本隨機(jī)選取并采集6～10個(gè)視野，以細(xì)胞核染成棕褐色為PCNA表達(dá)陽(yáng)性，進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析和計(jì)算陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌梗死后病理組織學(xué)變化(HE染色) HE染色光鏡下SHAM組心肌纖維排列整齊，橫紋、閏盤及細(xì)胞核染色清晰；MI組可見心肌水腫，心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂、溶解，胞漿染色不均勻，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心肌呈灶狀與片狀壞死；SPI組可見心肌水腫，部分心肌纖維斷裂，收縮帶形成，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 各組左心室功能比較 以LVDP及+dp/dtmax-dp/dtmax判斷左心室功能。MI組心功能較SHAM組明顯下降，SMI組較MI組顯著改善。見表1。

表1 各組LVDP和±dp/dtmax比較

2.3 TUNEL 凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核呈深棕色反應(yīng)，胞漿不顯色。SHAM組幾乎無(wú)表達(dá)(圖1A)，MI組有大量表達(dá)(圖1B)，SPI組表達(dá)較少(圖1C)。MI組表達(dá)明顯高于SPI組(1.37%±0.08%vs 0.65%±0.05%，P<0.01，見表2)，提示螺內(nèi)酯干預(yù)心肌梗死大鼠能明顯減少心肌細(xì)胞的凋亡。

圖1 TUNEL染色

2.4 PCNA PCNA顯色定位于心肌細(xì)胞核，呈棕色，胞漿不顯色。表達(dá)部位主要位于梗死周圍區(qū)域。SHAM組幾乎無(wú)表達(dá)(圖2A)，MI組(圖2B)與SPI組(圖2C)表達(dá)無(wú)明顯差異(0.53%±0.04%vs 0.50%±0.04%，P>0.05，見表2)。

圖2 PCNA免疫組化染色

表2各組凋亡指數(shù)、PCNA陽(yáng)性率(%)

注：與SHAM組比較，*P<0.01；與MI組比較，#P<0.01

3 討論

在臨床中，醛固酮受體拮抗劑用于控制頑固性高血壓和有癥狀的心力衰竭。在一項(xiàng)大規(guī)模、長(zhǎng)期試驗(yàn)(RALES)中，使用小劑量醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯(20 mg/d)治療當(dāng)前或近期有心功能Ⅳ級(jí)癥狀的心力衰竭患者可以降低死亡和住院的危險(xiǎn)，因而奠定了醛固酮受體拮抗劑在慢性心力衰竭治療中的地位。EPHESUS試驗(yàn)表明，在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和β受體阻滯劑治療基礎(chǔ)上，加用選擇性醛固酮受體拮抗劑，能夠使急性心肌梗死合并心力衰竭的患者進(jìn)一步獲益，猝死的危險(xiǎn)性和總死亡率下降。醛固酮受體拮抗劑在臨床中的獲益使其在心力衰竭尤其是急性心肌梗死后的心力衰竭中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。

目前研究表明，多種心臟疾病的心力衰竭演變過(guò)程中，心肌細(xì)胞、膠原網(wǎng)架和血管床發(fā)生了一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，即心室重構(gòu)。其中心肌細(xì)胞凋亡起著重要作用，抑制凋亡可延緩心力衰竭的發(fā)展[7]。與心肌梗死相關(guān)的心肌細(xì)胞凋亡與很多因素有關(guān)，包括嚴(yán)重的缺血、細(xì)胞能量水平、機(jī)械應(yīng)力以及神經(jīng)內(nèi)分泌的激活[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人類急性心肌梗死(AMI)晚期的尸解中，心肌細(xì)胞凋亡仍然非常活躍，而且遠(yuǎn)離梗死區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)(0．7%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于梗死區(qū)(25.4%)，表明細(xì)胞凋亡主要存在于梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)。也有研究發(fā)現(xiàn)，早期MI患者遠(yuǎn)離梗死區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量仍然可觀。

心肌細(xì)胞凋亡與心室重構(gòu)關(guān)系密切，抑制心肌細(xì)胞凋亡有利于改善心室功能。研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死后應(yīng)用醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯、依普利酮，可有效抑制左心室的擴(kuò)張，降低室壁張力，改善心室重構(gòu)，提高左室射血分?jǐn)?shù)，減少舒張末期和收縮末期容量，從而減少心力衰竭患者的再住院率及住院時(shí)間[9-11]。其機(jī)制目前尚無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，較早的研究認(rèn)為，心力衰竭時(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，血管緊張素Ⅱ(ATⅡ)表達(dá)增加，促進(jìn)心肌纖維化。而醛固酮有獨(dú)立于ATⅡ和相加于ATⅡ的對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的不良作用，醛固酮能夠刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原纖維，使膠原纖維增多，促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化，加重心室重構(gòu)，從而促進(jìn)心力衰竭的發(fā)展。心力衰竭患者短期應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)，可降低血醛固酮水平，但長(zhǎng)期應(yīng)用，血醛固酮水平不能保持穩(wěn)定，反而持續(xù)降低，即所謂“醛固酮逃逸現(xiàn)象”[12]。因此，心力衰竭患者在ACEI基礎(chǔ)上加用醛固酮受體拮抗劑，能進(jìn)一步抑制醛固酮的有害作用，可望有更大的益處。

近年來(lái)的研究表明，醛固酮受體拮抗劑能夠抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡，改善了心肌梗死后的心室重構(gòu)，其可能存在鹽皮質(zhì)激素依賴途徑和非依賴途徑。Mitsuo等[6]研究發(fā)現(xiàn)，螺內(nèi)酯通過(guò)抑制鹽皮質(zhì)激素受體和11β-羥類固醇脫氫酶2的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而改善心室重構(gòu)。Thi等[12-13]發(fā)現(xiàn)螺內(nèi)酯通過(guò)抑制抗凋亡蛋白ARC(Apoptosis repressor with caspase recruitment domain)的降解，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡內(nèi)源性途徑的活性，促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)蛋白Acinus和ICAD(Inhibitor of caspase-activated DNase)的降解。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)于中心壞死區(qū)域和存活心肌之間的低灌注區(qū)。MI組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于SPI組(1.37%±0.10%vs 0.65%± 0.06%，P<0.01)，MI組LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯低于SHAM組與SPI組，顯示螺內(nèi)酯抑制了心肌細(xì)胞凋亡，改善了心肌梗死后的心功能。細(xì)胞凋亡的多少?zèng)Q定缺血損傷的輕重，提示我們可以從細(xì)胞凋亡的角度對(duì)缺血后心功能的恢復(fù)及心肌保護(hù)進(jìn)行研究。

以往認(rèn)為哺乳動(dòng)物成熟的心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，因而成年心臟被看成終末分化器官，不存在心肌細(xì)胞增殖。然而近年來(lái)，一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了在正常的或者由于缺血或非缺血而引起的急性或慢性心力衰竭的心臟中發(fā)現(xiàn)了固有心肌細(xì)胞的有絲分裂，證實(shí)存在心肌細(xì)胞增殖。心肌細(xì)胞增殖可作為心臟損傷后修復(fù)再生的基礎(chǔ)[4-5，14-15]。為了明確增殖心肌細(xì)胞的類型,很多實(shí)驗(yàn)研究了心臟混合物分離過(guò)程中的心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物和非心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,以及增殖細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)記，其中PCNA就是心肌細(xì)胞增殖的標(biāo)記蛋白之一[16]。最近研究證明，螺內(nèi)酯通過(guò)抑制心肌細(xì)胞增殖阻礙了新生大鼠心臟的發(fā)育，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶家族成員P38及P53的表達(dá)[5]。而急性心肌梗死后醛固酮拮抗劑是否對(duì)心肌細(xì)胞增殖具有抑制作用尚未見相關(guān)報(bào)道。我們應(yīng)用PCNA定量心肌細(xì)胞增殖程度，結(jié)果表明，PCNA在SMI組和MI組之間表達(dá)無(wú)明顯差異。

因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織學(xué)方法初步驗(yàn)證了螺內(nèi)酯對(duì)于心肌梗死后心功能的保護(hù)主要是通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡而非心肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步闡釋了螺內(nèi)酯對(duì)于心肌梗死后心室重構(gòu)的影響，這對(duì)于螺內(nèi)酯在改善心肌梗死后心室重構(gòu)和心力衰竭的應(yīng)用中又奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Dermot PP,Thavendiranathan PC,Thomas HM.Aldosterone antagonists improve ejection fraction and functional capacity independently of functional class:a meta-analysis of randomised controlled trials[J].Heart,2012,98:1693-1700.

[2] Sanjiv JS,John FH,Nancy KS,et al.Baseline characteristics of patients in the treatment of preserved cardiac function heart failure with an aldosterone antagonist trial[J].Circulation,Heart Failure,2013,6:184-192.

[3] Sandra Erbs,Robert H?llriegel,Axel Linke,et al.Exercise training in patients with advanced chronic heart failure(NYHA IIIb)promotes restoration of peripheral vasomotor function,induction of endogenous regeneration,and improvement of left ventricular function[J].Circ Heart Fail,2010，3:486-494.

[4] Bergmann O,Bhardwaj RD,Bernard S,et al.Evidence for cardiomyocyte renewal in humans[J].Science,2009,324(5923):98-102.

[5] Hyung JS,Kee HY,Gi YJ,et al.Aldosterone modulates cell proliferation and apoptosis in the neonatal rat heart[J].J Korean Med Sci,2010,25:1296-1304.

[6] Takeda M,Tatsumi T,Matsunaga S,et al.Spironolactone modulates expressions of cardiac mineralocorticoid receptor and 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2 and prevents ventricular remodeling in post-infarct rat[J].Hearts Hypertension Research,2007,30(5):427-437.

[7] Mani K.Programmed cell death in cardiac myocytes:strategies to maximize post-ischemic salvage[J].Heart Fail Rev,2008,13:193-209.

[8] Cynthia NP,Sangyoon Han,Stacey DC,et al.Oxidative-stress mediates apoptosis in a human model of danon disease and heart failure[J].Circ Res,2013,113:A025.

[9] Ivanes F,Susen S,Mouquet F,et al.Aldosterone,mortality,and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure[J].Eur Heart J,2012,33(2):191-202.

[10]Mihailidou AS.Aldosterone in heart disease[J].Curr Hypertens Rep,2012,14(2):125-129.

[11]Bradley AM,Jane AL.Aldosterone receptor antagonists:effective but often forgotten[J].Circulation,2010,121:934-939.

[12]Thi Yen,Loan Le,Mahidi Mardini,et al.Low-dose spironolactone prevents apoptosis repressor with caspase recruitment domain degradation during myocardial infarction[J].Hypertension,2012,59:1164-1169.

[13]Zannad F,Ketelslegers JM,Bramlage P.Role of biomarkers in guiding treatment with aldosterone-blocking agents[J].Eur Heart J,2011,13(S):B31-B35.

[14]Malliaras K,Zhang YQ,Seinfeld J,et al.Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart[J].Embo Mol Med,2013,5:191-209.

[15]Den Haan MC,Grauss RW,Simits AM,et al.Attenuation of ventricular remodeling and improvement of left ventricular systolic function by injection of human fetal cardiomyocyte progenitor cells after acute myocardial infarction[J].Circulation,2009,120:S1040.

[16]Matturri L,Ottaviani G,Lavezzi AM,et al.Expression of apoptosis and proliferating cell nuclear antigen(PCNA)in the cardiac conduction system of crib death(SIDS)[J].Adv Clin Path,2001,5(3):79-86.