脂多糖和石墨粉誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷病理形態(tài)學(xué)比較

崔雯雯，張彥芬，秘堯，金鑫，劉克劍，王宏濤,3

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150042；2.河北以嶺醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡(luò)病)，石家莊 050035；3.河北省絡(luò)病重點實驗室，石家莊 050035)

隨著工業(yè)的發(fā)展與生活水平的提高，可吸入顆粒物已經(jīng)嚴(yán)重危害人的身體健康，使呼吸道疾病和心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率大大提高。PM2.5或稱細(xì)顆粒物，指環(huán)境空氣中空氣動力學(xué)當(dāng)量直徑小于等于2.5 μm的顆粒物。它包含土壤揚塵、植物花粉、細(xì)菌等自然源顆粒物等[1-2]，又包含燃煤燃油等人為源排放顆粒物，因而存在微生物源成分對直接誘發(fā)肺部損傷的風(fēng)險，也存在細(xì)顆粒物向呼吸道沉積導(dǎo)致?lián)p傷的可能[3]。作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分的內(nèi)毒素脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)可導(dǎo)致機體肺部損傷[4-6]，石墨粉(graphite powder)作為顆粒直徑2.6 μm的顆?？稍诜尾砍练e，兩種不同成分，導(dǎo)致的肺部病理損傷，有何異同，目前尚未見報道。因此，本實驗采用氣管灌注LPS和石墨粉后不同時間點取材的方法，觀察不同來源顆粒物成分對動物肺部病理損傷差異，為更深入研究細(xì)顆粒物的肺損傷機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

3K15型低溫高速離心機(德國Sigma)；Leica RM2015切片機(德國Leica公司)；Olympus IX71熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)； ABI 7300 Real-Time PCR System(美國ABI公司)；UVP凝膠掃描系統(tǒng)(美國UVP 公司)；DYZ-22A型雙恒定時電泳儀(北京市六一儀器廠)；DYY-Ⅲ橋式電泳槽(北京市六一儀器廠)。

1.2 藥物和試劑

LPS (Sigma公司，102M4017V，德國)；2.6 μm石墨粉(青島晨陽石墨有限公司)；Western印跡檢測抗體：中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)兔抗小鼠多克隆抗體(Abcam公司，英國)；RNA提取試劑Trizol Reagent (Invitrogen公司，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司，美國)；瓊脂糖(Promega 公司，美國)；熒光定量PCR試劑盒(BBI公司，加拿大)。

1.3 動物飼養(yǎng)與分組實驗

SPF級雄性KM小鼠140只，6周齡，體重18～20 g，由中國食品藥品檢定研究所提供【SCXK(京)2009-0017】。實驗在河北省絡(luò)病重點實驗室進(jìn)行【SYXK(冀)2009-0033】。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，隨機分成3組：正常對照組(N組，n=20)、LPS組(L組，n=60)、石墨粉組(G組，n=60)；其中LPS組和石墨粉組又根據(jù)造模時間各分為三個亞組：LPS(L-6 h)、LPS(L-24 h)、LPS(L-72 h)，石墨粉(G-6 h)、石墨粉(G-24 h)、石墨粉(G-72h)，每組各20只。

1.4 造模方法

用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉后，將小鼠固定在手術(shù)板上，頸部消毒，縱向切開頸部皮膚，剝離皮下組織，暴露氣管，用1mL注射器吸取LPS溶液(5 mg/kg)、石墨粉混懸液(40 mg/kg)，以生理鹽水作為溶劑2 mL/kg，從氣管兩氣管環(huán)間快速刺入注射，滴入后立即直立小鼠，輕度晃動數(shù)次后縫合傷口，小鼠自然清醒。

1.5 取材及指標(biāo)檢測

1.5.1 肺組織病理學(xué)檢測

每組隨機取三只小鼠，于各時間點將小鼠采用眼球取血的方式處死，開胸取肺。取左肺上葉組織塊，放入4%甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)，于切片中任意抽取其中一張片子，HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變；去左肺下葉組織塊(2 mm × 2 mm × 2 mm)，放入2.5%戊二醛溶液中固定48 h，二甲砷酸緩沖液沖洗兩遍，四氧化鋨固定再經(jīng)緩沖液沖洗，逐級丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色， 透射電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.2 Western blot法檢測肺組織中NE的蛋白表達(dá)

稱取小鼠肺組織加入組織裂解液，勻漿后4℃離心分離上清，進(jìn)行蛋白定量。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜后封閉，與一抗結(jié)合后洗膜，二抗結(jié)合，洗膜后采用增強型ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，掃描灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH比值表示。

1.5.3 實時定量PCR法檢測MCP-2的mRNA表達(dá)水平

用Trizol試劑提取心臟組織總RNA，進(jìn)行cDNA的合成。實時熒光定量PCR檢測肺組織中MCP-1的mRNA表達(dá)水平，引物序列如下：MCP-1，158bp，上游5’-ACTTCTATGCCTCCTGCTCAT-3’,下游5’-ACTGGCTGCTTGTGATTCTC-3’；GAPDH, 120 bp，上游5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’, 下游 5-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。以GAPDH為內(nèi)參照基因，得到目的基因表達(dá)的相對定量值(RQ值)。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 建模后小鼠一般情況及存活率

N組小鼠一般情況良好，活動正常，呼吸平穩(wěn)，食量正常，對外界刺激反應(yīng)正常；L-6 h組小鼠多數(shù)一般情況良好，少數(shù)幾只出現(xiàn)蜷臥少動、反應(yīng)遲鈍的癥狀，存活19只；L-24 h組小鼠多數(shù)行動較遲緩，嗜睡，反應(yīng)遲鈍，存活15只；L-72 h組小鼠體型瘦弱，進(jìn)食量明顯減少，呼吸微弱，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，存活9只；G-6h組小鼠一般情況與N組差異不大，無死亡現(xiàn)象；G-24h組小鼠活動稍微減少，呼吸較平穩(wěn)，少數(shù)幾只出現(xiàn)蜷臥少動、反應(yīng)遲鈍癥狀，存活18只；G-72 h組小鼠多數(shù)活動量明顯減少，嗜睡，對外界刺激反應(yīng)較遲鈍，存活14只。L組和G組不同時間點小鼠存活率(見圖1，彩插4)。

2.2 光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

正常對照組，肺泡壁完整，無增厚，無炎細(xì)胞浸潤，無充血；L-6 h組肺泡腔內(nèi)可見以中性粒細(xì)胞為主的滲出物，部分肺泡壁輕微破壞； L-24 h組肺泡腔內(nèi)可見大量中性粒細(xì)胞為主的滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管擴張充血，部分肺泡壁輕微破壞； L-72 h組部分正常肺組織結(jié)構(gòu)消失，呈實變狀，肺泡腔內(nèi)可見大量中性粒細(xì)胞為主的滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管擴張充血，部分肺泡壁輕微破壞，部分肺泡腔代償性擴張； G-6 h組支氣管及肺泡壁可見黑色顆粒物聚集； G-24 h組支氣管及肺泡壁可見黑色顆粒物聚集，巨噬細(xì)胞增多，無明顯滲出物； G-72 h組支氣管及肺泡壁可見黑色顆粒物聚集，巨噬細(xì)胞增多，肉芽腫形成，部分肺泡壁增厚，無明顯滲出物(圖2，彩插5)。

2.3 電鏡下觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化

正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞微絨毛排列整齊，胞質(zhì)內(nèi)有大量板層體和線粒體，板層小體結(jié)構(gòu)清晰，基膜完整； L-6 h組Ⅱ型上皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷，板層小體空泡化，微絲模糊、斷裂，基質(zhì)變淡； L-24 h組纖毛輕微斷裂、融合，胞質(zhì)細(xì)小空泡變，嗜鋨性板層體排空；L-72 h組Ⅱ型上皮細(xì)胞顆粒排出，損傷加重；G-6 h組Ⅱ型上皮細(xì)胞輕微損傷，部分板層小體脫落；G-24 h組Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷，內(nèi)部有黑色物質(zhì)出現(xiàn)，胞質(zhì)細(xì)小空泡變；G-72 h組Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷，內(nèi)部有大量黑色物質(zhì)出現(xiàn)，細(xì)胞腫脹空泡變。見圖3。

2.4 急性肺損傷小鼠肺組織中NE的蛋白表達(dá)、MCP-1的mRNA表達(dá) 見表1。

表1 肺組織中NE蛋白表達(dá)和MCP-1 m-RNA表達(dá)

3 討論

細(xì)顆粒物的來源廣泛、成因復(fù)雜，自然來源包括森林火災(zāi)、風(fēng)揚塵土、細(xì)菌、真菌孢子等，人為來源包括：燃燒產(chǎn)物(化石燃料、秸稈、垃圾等)、道路揚塵、工業(yè)粉塵等[1-2]。細(xì)顆粒物的粒徑為小于等于2.5 μm，因而直接進(jìn)入肺部深處，引起炎癥反應(yīng)；又因具有粒徑小、比表面積大的特點，它能夠攜帶易引起呼吸道疾病的細(xì)菌、病毒、重金屬等進(jìn)入肺部，從而激活炎性細(xì)胞釋放大量的炎癥因子，引起肺部損傷。大量的流行病學(xué)和毒理學(xué)研究表明[7-10]，PM2.5能夠直接進(jìn)入人體肺部并沉積于肺泡腔內(nèi)，誘發(fā)呼吸道上皮細(xì)胞及肺部免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)，從而引發(fā)肺部急性損傷并嚴(yán)重威脅人類健康。本實驗采用LPS和石墨粉分別模擬生物源細(xì)顆粒物成分和直接沉積入肺的顆粒物成分，觀察不同顆粒物成分導(dǎo)致急性肺損傷的病理變化。

注：A.肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；B.Ⅱ型上皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷，微絲模糊、斷裂；C.纖毛輕微斷裂、融合，嗜鋨性板層體排空；D.Ⅱ型上皮細(xì)胞顆粒排出；E.Ⅱ型上皮細(xì)胞輕微損傷，部分板層小體脫落；F.Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷，胞質(zhì)細(xì)小空泡變；G.Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞腫脹空泡變。

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種由多種致病因素引起的由炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子介導(dǎo)的肺內(nèi)過度性、失控性炎癥反應(yīng)，各種致病因子激活炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)引起“瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)”，它的發(fā)生發(fā)展與促炎細(xì)胞因子的合成、過度釋放及內(nèi)源性抗炎細(xì)胞因子的釋放不足密切相關(guān)[11-13]，其惡化階段即為急性呼吸窘迫綜合征，其死亡率高達(dá)30%～50%[14]。其病變組織病理學(xué)表現(xiàn)為：肺泡上皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞間隙增寬，肺泡壁斷裂，肺泡腔內(nèi)炎細(xì)胞浸潤和滲出[15-16]等。

Sochor等[17]認(rèn)為，中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集和激活是LPS所致ALI最常見的病理學(xué)改變和導(dǎo)致肺損傷的機制。中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)大量聚集，釋放氧自由基、彈性蛋白酶等炎性介質(zhì)，炎性介質(zhì)又可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放炎癥因子，而炎癥因子能夠促使中性粒細(xì)胞的大量滲出及粘附，從而引起級聯(lián)性炎癥反應(yīng)，最終引起急性肺部損傷[18-19]。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)是由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性分子，NE因能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)、血漿蛋白，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞釋放炎癥因子等作用，被認(rèn)為是引起ALI的重要機制之一[19]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是一種具有強烈趨化作用的趨化因子，它的主要功能是趨化和激活單核巨噬細(xì)胞，MCP-1在肺組織中的大量表達(dá)能夠?qū)е戮奘杉?xì)胞的大量聚集和浸潤[20-21]。

本研究中，LPS誘導(dǎo)的ALI可見肺組織中以中性粒細(xì)胞為主的滲出物，隨著造模時間的增長，中性粒細(xì)胞的數(shù)量明顯增多、浸潤現(xiàn)象加重，石墨粉誘導(dǎo)的ALI可見肺組織中巨噬細(xì)胞隨時間增長增多最終形成異物性肉芽腫，根據(jù)動物死亡率及病理形態(tài)學(xué)變化情況，檢測了L組、G組和正常對照組小鼠肺組織中NE蛋白表達(dá)和MCP-1基因表達(dá)，兩組均顯著高于正常對照組，說明LPS和石墨粉均可以引起肺內(nèi)NE和MCP-1的含量增加；L組NE在肺內(nèi)表達(dá)高于G組，而G組MCP-1在肺內(nèi)高于L組，說明LPS進(jìn)入肺內(nèi)后主要刺激中性粒細(xì)胞，石墨粉則主要引起巨噬細(xì)胞的增多。本實驗結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷是以中性粒細(xì)胞為炎癥發(fā)生的起點，肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集、滲出，由中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶誘導(dǎo)炎癥因子的大量出現(xiàn)，炎癥因子又反向刺激中性粒細(xì)胞大量滲出，最終導(dǎo)致炎癥彌漫于肺內(nèi)，引起急性肺損傷。且隨著LPS作用時間的延長，實驗小鼠的狀態(tài)越來越差，死亡率升高說明，肺部炎癥的長期發(fā)展最終會導(dǎo)致機體功能的衰弱甚至死亡。石墨粉誘導(dǎo)的ALI主要引起巨噬細(xì)胞增多，顆粒物通過呼吸道進(jìn)入肺內(nèi)，肺內(nèi)趨化因子會趨化單核巨噬細(xì)胞吞噬、清除進(jìn)入體內(nèi)的顆粒物，而來不及被吞噬的顆粒物與肺巨噬細(xì)胞接觸時間過長導(dǎo)致炎癥因子的產(chǎn)生,同時未被吞噬的顆粒物會發(fā)生遷移并反復(fù)誘導(dǎo)趨化因子趨化炎性細(xì)胞聚集、浸潤，最終導(dǎo)致肺內(nèi)嚴(yán)重炎癥損傷甚至肉芽腫。雖然兩種來源的顆粒物引起肺損傷的過程都是以炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子為主要途徑，但是LPS是直接刺激中性粒細(xì)胞，釋放炎癥因子引發(fā)炎癥反應(yīng)，石墨粉顆粒是通過大量沉積于肺部，引起趨化因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集、吞噬而最終導(dǎo)致的炎癥損傷，在損傷機制上是存在著差異的。

綜上所述，LPS和石墨粉導(dǎo)致的肺損傷的病理形態(tài)和機制存在著明顯差異，即自然環(huán)境中細(xì)顆粒物PM2.5引起肺損傷的機制也可能同時存在兩種機制-肺內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多，直接釋放炎癥因子或誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放炎癥因子最終造成肺損傷，但這還需要進(jìn)一步研究探討。

(本文圖1見彩插4,圖2見彩插5。)

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