GFP在綠色熒光裸鼠不同組織中的表達(dá)及分析

尤金煒，董敏，劉彪，梁磊，田迎，胡文娟，田小蕓，方天，

周森妹，趙志剛，惲?xí)r鋒

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實(shí)驗(yàn)動物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地，南京 210002)

近年來，無胸腺裸鼠作為新的動物模型，活躍于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、毒理學(xué)等各領(lǐng)域的研究工作中，尤其在免疫生物學(xué)、免疫病理學(xué)、移植免疫、腫瘤免疫、病毒和細(xì)菌免疫等領(lǐng)域，在短短的幾年中，就展開了一系列富有成效的新的研究，推動了各方面的工作，為實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)提供了新的工具[1-3]。而來源于水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白，它無需作用底物或共作用物，在熒光激發(fā)下可以直接發(fā)光，性質(zhì)穩(wěn)定，現(xiàn)已成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一[4-5]。

1980年，Gordon等[6]用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法獲得了2只轉(zhuǎn)基因小鼠。1995年，Ikawa等[7]采用綠色熒光蛋白報告基因，成功建立了綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠。2007年，馮娟等[8]建立了紅色熒光和綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠模型。2013年，王貴利等[9]建立綠色熒光轉(zhuǎn)基因大鼠，2013年，本科室張立波等[10]建立了綠色熒光轉(zhuǎn)基因裸鼠。

本實(shí)驗(yàn)針對這種動物模型，觀察外源綠色熒光蛋白基因能否在裸鼠體內(nèi)成功表達(dá)，并探討熒光蛋白在該模型組織中的分布特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取49及70日齡GFP轉(zhuǎn)基因雄裸鼠各6只，由本單位選育【SCXK(軍)2012-0014】，在本實(shí)驗(yàn)室無特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間飼養(yǎng)【SYXK(軍)2012-0047】。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：IVIS Lumina XR型小動物成像系統(tǒng)(美國)、熒光定量PCR儀、Allegra 21R 臺式高速冷凍離心機(jī)、AR5120電子天平、MultiTemp III 恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀、雪花狀制冰機(jī)、移液器、超凈工作臺。

主要試劑與耗材：TRlzol reagent、RNase inhibitor、Dnase I、RT mix、qPCR master mix、DEPC、SDS、agarose、毛細(xì)管、離心管、槍頭、PCR反應(yīng)管、三溴乙醇。

1.3 方法

1.3.1 熒光裸鼠GFP表達(dá)情況

6只鼠以0.18 mL /10 g 劑量腹腔注射三溴乙醇，麻醉后進(jìn)行整體熒光成像，大體解剖后，取胰腺、心臟、皮膚、全腦等主要組織器官進(jìn)行熒光成像。

1.3.2 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank公布的GFP mRNA序列(L29345.1)設(shè)計引物，引物序列、擴(kuò)增子長度見表1。

1.3.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

6只雄鼠解剖后，取胰腺、心臟、全腦、皮膚、睪丸、腸道、肺臟、腎臟、肝臟、脾臟等組織，TRIzol法提取樣品總RNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件的設(shè)置：25℃ 10 min，42℃ 50 min，85℃ 5 min。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR

將cDNA作為實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)模板，每個組織均作復(fù)孔以減少誤差，以β-actin為內(nèi)參基因作為對照。

擴(kuò)增條件為，擴(kuò)增曲線：94℃ 5 min；94℃ 20 s，55℃ 30 s，循環(huán)40次，55℃單點(diǎn)檢測信號。溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s，連續(xù)檢測信號。

1.3.5 實(shí)時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 綠色熒光裸鼠的熒光表達(dá)情況

綠色熒光裸鼠在自然光線下，耳廓呈黃綠色，皮膚薄呈綠色或黃綠色，大體解剖后，熒光裸鼠有先天性胸腺發(fā)育不良(圖1，彩插11)。部分組織器官呈綠色，尤其是皮膚、胰腺更明顯(圖2，見彩插11)。

小動物成像系統(tǒng)觀察，熒光裸鼠全身的發(fā)出明顯的綠色熒光(見圖2)。解剖后收集包括胰腺、心臟、皮膚、全腦、睪丸、腸道、肺臟，腎臟、脾臟、肝臟等主要器官，活體熒光成像下均發(fā)出了明顯的綠色熒光(圖3，見彩插12)。

2.2 SYBR實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果

GFP在不同周齡綠色熒光裸鼠的胰腺、心臟、皮膚等主要器官中均檢測到表達(dá)，其中在胰腺中相對表達(dá)量最高，其次是心臟、皮膚、全腦、睪丸，而在腸道、肺臟，腎臟、脾臟、肝臟中的相對表達(dá)量較低。49與70日齡相比，僅胰腺和肺臟差異有顯著性(P<0.05)，其他組間之間GFP的表達(dá)量差異無顯著性。見表2。

表1 目的基因及內(nèi)參基因的引物序列

以70日齡綠色熒光裸鼠為例，檢驗(yàn)GFP在各組織間的表達(dá)差異，經(jīng)多重比較Duncan法檢驗(yàn)結(jié)果可知，差異不顯著的有：全腦與睪丸；脾臟與肝臟；腸道、肺臟、腎臟三者之間。差異顯著的有腸道與脾臟、腸道與肝臟。其他組合均為差異極顯著。見表3。

表2 GFP在綠色熒光裸鼠的組織間的相對表達(dá)量

表3 GFP在綠色熒光裸鼠的組織間的表達(dá)差異(70 d)

3 討論

綠色熒光蛋白具有熒光穩(wěn)定、易于檢測、生物安全性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在生物學(xué)及基因研究等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)室培育的綠色熒光裸鼠，可實(shí)現(xiàn)裸鼠全身各個組織器官表達(dá)綠色熒光蛋白，尤其是在胰腺中表達(dá)量較高，這與馮娟等[8]報道的綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠及閆寒[11]等報道的綠色熒光裸鼠所得出的結(jié)果是一致的。

對該模型的大體解剖可見：胸腺缺失；胰腺、皮膚呈現(xiàn)肉眼可見的綠色。在活體熒光成像中，由于沒有毛發(fā)的遮掩，清晰可見全身發(fā)出明亮的綠色。同時，器官的熒光成像表明，綠色熒光蛋白在該模型的全身各個主要器官如胰腺、心臟、皮膚、全腦、睪丸等均可以穩(wěn)定表達(dá)。

GFP作為熒光報告基團(tuán)廣泛運(yùn)用于熒光標(biāo)記技術(shù)中，利用活體動物成像系統(tǒng)，研究人員能夠直接監(jiān)控活體動物內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及特定基因的表達(dá)過程等，而帶熒光標(biāo)記的裸鼠能更好地模擬及觀察腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)動物的遺傳背景、生理指標(biāo)、生物學(xué)特性以及品系個體差異都是影響動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素[12]。本實(shí)驗(yàn)室對此動物模型的繁殖情況、臟器系數(shù)、生理生化等已經(jīng)有了初步的研究[10,13-14]。國內(nèi)的閆寒等[11]也對此模型有比較深入的研究。但是對熒光蛋白在裸鼠組織中的分布特點(diǎn)均未見深入的研究報道，為此，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時熒光定量PCR檢測了熒光蛋白在主要器官組織中的變化，為深入研究熒光裸鼠在腫瘤學(xué)等方面的研究提供一些參考。

根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析處理的結(jié)果，GFP在不同日齡裸鼠的主要器官中均檢測到表達(dá)，其中在胰腺中相對表達(dá)量最高。49與70日齡的比較，僅胰腺和肺臟差異顯著，其他組之間GFP的表達(dá)量差異無顯著性意義。而GFP在同一日齡裸鼠的組織間的表達(dá)差異性較大，以70 d綠色熒光裸鼠為例，經(jīng)多重比較Duncan法檢驗(yàn)結(jié)果可知，僅全腦與睪丸之間；脾臟與肝臟之間；腸道、肺臟、腎臟三者之間差異不顯著。差異顯著的有腸道與脾臟、腸道與肝臟之間。其他組合均為差異極顯著。GFP在各種組織中表達(dá)量的差異，這也就為我們在研究中選擇疾病模型及移植供體提供了依據(jù)。

本研究還發(fā)現(xiàn)GFP在不同日齡裸鼠的胰腺中均有高表達(dá)，隨日齡增長熒光表達(dá)量差異不顯著，GFP的高表達(dá)對臟器有無顯著毒副作用，本實(shí)驗(yàn)室方天等[15]報道了外源GFP基因會對脾臟形態(tài)及功能產(chǎn)生一定的影響。關(guān)于外源導(dǎo)入基因?qū)ζ渌K器特別是高表達(dá)的胰腺是否有影響，以及如何影響臟器形態(tài)及其功能的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

(本文圖1,2見彩插11,圖3見彩插12。)

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