FH/Wjd大鼠酒精性肝損傷模型探討

張彥芬，秘堯，何奇龍，王宏濤

(河北以嶺醫(yī)藥研究院，石家莊 050035)

FH/Wjd大鼠是紐約衛(wèi)生中心 W．Jean Dodds 教授將遠交系Wistar大鼠近親繁殖了 19 代得到的，這個品系的大鼠具有遺傳性5-HT功能低下和大量自主飲酒的特點[1]。北京大學(xué)中國藥物依賴性研究所于2007年將FH/Wjd大鼠引入我國并成功繁殖，是我國第一個先天嗜酒的大鼠模型，同時也是一個先天抑郁癥的模型。目前主要用于精神依賴物質(zhì)及其戒斷的研究。我們根據(jù)其嗜酒特性，觀察了長期飲酒后FH/Wjd肝臟病變相關(guān)指標(biāo)，探討其作為肝臟損傷動物模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級FH/W jd大鼠36只，雌雄各半，12～16周齡。雄性體重280～320 g，雌性體重160～200 g。來源于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部[SCXK(京)2011-0012]。動物飼養(yǎng)于河北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)藥研究院新藥評價中心[SYXK(冀)2009-0033]，光照12h/d，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。

1.1.2 主要試劑

無水乙醇購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO)生化檢測試劑盒購自北京九強。組織TG試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。組織谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。PPARα一抗購自Abcam美國公司。

1.2 方法

1.2.1 造模方法[2]

將36只大鼠單籠飼養(yǎng)，按體重隨即分為2組，即飲水組和飲酒組。飲水組每日自由攝取無菌水，飲酒組自由飲用15%乙醇溶液，持續(xù)16周。每周2次監(jiān)測飲酒組大鼠乙醇攝入量，計算公式如下(ME為純乙醇攝入量，mE為乙醇溶液攝入量，CE為乙醇濃度，ρE為乙醇密度，ρW為水密度，BW為體重)：

1.2.2 指標(biāo)檢測

10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，4℃、3000 r/min轉(zhuǎn)離心10 min，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST、TBIL、TG、CHO。取肝臟組織約100 mg，70%乙醇固定，制成單細胞懸液，碘化丙啶染色，Epics XL流式細胞儀檢測，用cxp Analysis軟件分析細胞凋亡率。取肝臟組織200 mg，制備組織勻漿，檢測肝臟勻漿中TG、GSH。取肝臟組織約100 mg，Western法檢測肝臟組織過氧化物酶體增殖物激活受體α[3,4](peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)蛋白表達。留取部分肝臟甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，觀察肝臟病理組織學(xué)改變。

1.2.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 血清生化

雄性大鼠飲酒組與飲水組相比，TBIL與TG明顯升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；轉(zhuǎn)氨酶及CHO略有降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異。雌性大鼠飲酒組與飲水組相比，除TBIL與TG明顯升高外(P<0.05或P<0.01)，ALT、CHO降低更為明顯，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1、表2。

表1 酒精攝入對雄性FH/Wjd大鼠血清生化指標(biāo)的影響±s，n=9)

表2 酒精攝入對雌性FH/Wjd大鼠血清生化指標(biāo)的影響±s，n=9)

2.2 肝組織生化

雌、雄大鼠飲酒組與飲水組相比，肝組織勻漿液中TG含量均明顯升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；GSH含量有降低趨勢，但未見統(tǒng)計學(xué)差異。見表3、表4。

表3 酒精攝入對雄性FH/Wjd大鼠肝組織生化指標(biāo)的影響±s，n=9)

表4 酒精攝入對雌性FH/Wjd大鼠肝組織生化指標(biāo)的影響±s，n=9)

2.3 肝細胞凋亡

雌、雄大鼠飲酒組與飲水組相比，肝細胞凋亡率有升高趨勢，但未見統(tǒng)計學(xué)差異。見表5。

表5 酒精攝入對FH/Wjd大鼠肝臟細胞凋亡的影響±s，n=9)

2.4 肝PPARα蛋白表達

飲酒組與飲水組相比，肝臟組織PPARα蛋白表達明顯降低，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 肝臟組織PPARα的蛋白表達

注：與飲水組相比，*P<0.05

2.5 組織病理學(xué)

飲水組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞索、肝血竇排列規(guī)則，未見炎細胞浸潤、肝細胞變性、壞死等病理變化。飲酒組可見肝細胞空泡變性(符合小泡性脂肪變的病理特點)、小灶性，多發(fā)，偶見壞死。見圖3(彩插4)。

3 討論

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝中毒性損害，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化[5]。為了研究ALD的發(fā)病機制，篩選有效的治療藥物，建立相應(yīng)的動物模型是非常有必要的。

關(guān)于酒精性肝損傷的動物模型主要有強制灌酒、自由攝入酒精食料(Lieber-Decarli)[6-8]，前者乙醇溶液濃度過大或體積過大都會嚴(yán)重損傷消化道，長期灌胃酒精大鼠死亡率高，短期則造成乙醇攝入量低；后者由于大鼠厭酒，也會導(dǎo)致乙醇攝入量受限。為控制厭酒的大鼠的酒精攝入，以保證血液中長期維持高濃度的酒精，1984年Tsukamato-French等[9]給SD大鼠手術(shù)植入胃管，持續(xù)注入含酒精的液體食料。但該模型中酒精是強制注入的，不符合正常攝入過程，并且制作此模型需要一些技術(shù)上的特別訓(xùn)練，不易復(fù)制。FH/W jd大鼠先天嗜酒特性使其在自然狀態(tài)下可以自由飲用大量酒精，與人類飲酒行為非常相似，實驗操作簡便易行。

從本次實驗數(shù)據(jù)可以看出，F(xiàn)H/Wjd大鼠自由飲酒16周后，血清TG和TBIL變化較大，從GSH可以推測肝臟可能出現(xiàn)了氧化損傷，而病理改變則以小泡性脂肪變性為主，這與肝臟TG含量升高吻合。與脂代謝密切相關(guān)的PPARα的蛋白表達受到了明顯影響，并且肝細胞凋亡率有升高趨勢。飲酒組大鼠血清CHO有所降低，雌性動物降低程度尤為明顯，可能是由于肝細胞受損，膽固醇酯生成減少，導(dǎo)致血清膽固醇總量降低。飲酒組大鼠血清AST、ALT均呈現(xiàn)降低趨勢，同時血清TBIL水平升高，其中雌性大鼠ALT降低較為明顯，與飲水組出現(xiàn)了顯著統(tǒng)計學(xué)差異。臨床上這種膽酶分離的現(xiàn)象是由于肝細胞大量壞死，對膽紅素的處理能力進行性下降，同時轉(zhuǎn)氨酶進行性耗竭造成的，所以我們推測FH/Wjd大鼠這種血清生化指標(biāo)的改變與肝細胞受損或壞死有關(guān)。

本模型采用了兩種性別的動物，從數(shù)據(jù)來看，雌雄動物各數(shù)據(jù)的變化趨勢是一致的，但變化程度有一定差異，雌性動物變動幅度較雄性動物略大。在乙醇攝入量監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)，雌性動物乙醇攝入量高于雄性動物，故推測病變程度性別差異可能與此有關(guān)。本研究對FH/Wjd大鼠作為酒精性肝損傷動物模型的可行性進行了初步探討，此模型仍然有待我們進一步深入研究。

(本文圖3見彩插4。)

[1] 李雨玲, 梁建輝.FH/Wjd大鼠的生物學(xué)特性及其在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用 [J]．中國藥理學(xué)通報, 2012, 28(7):893-897．

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[4] 石巧娟, 劉月環(huán), 樓琦, 等.非酒精性脂肪肝大鼠PPARα基因表達及脂代謝和胰島素水平的變化 [J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(8):26-30．

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