睪丸酮對大鼠前列腺上皮細(xì)胞有絲分裂方向的影響

劉向云，桂博，潘琦，許麗，孫祖越

(1.上海市計劃生育科學(xué)研究所，上海 200032； 2.上海體育學(xué)院，上海 200438)

我國已步入老齡化社會，《中國人口和就業(yè)統(tǒng)計年鑒—2011》資料顯示，2010年全國65歲及以上的老年人達(dá)11894萬人，占總?cè)丝诘?.9%，估計到2025年我國老年人口比例將占全國人口20%左右。前列腺增生在老年男性中的發(fā)病率非常高，達(dá)到50%以上[1]。眾所周知睪丸酮在男性前列腺增生性疾病中發(fā)揮著重要作用，但是其引發(fā)前列腺增生的機制還不是十分清楚。細(xì)胞增殖和染色體有絲分裂分不開，曾有研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以改變大鼠子宮細(xì)胞染色體有絲分裂的方向[2]，本研究將從雄性動物著手，觀察睪丸酮對前列腺細(xì)胞染色體有絲分裂方向的改變并初步探索其發(fā)生機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠20只，110～130 g，4～5周齡，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2008-0016】。動物飼養(yǎng)在上海市計劃生育科學(xué)研究所SPF級動物房內(nèi)【SYXK(滬)2008-0027】，飼養(yǎng)于400 mm×350 mm×200 mm塑料籠內(nèi)，每籠飼養(yǎng)同性大鼠5只，自由飲水、攝食。室溫20～26℃，相對濕度 40%～70%，光照12 h，黑暗12 h。隨機分為兩組，對照組和給藥組，每組各10只。在實驗前，所有大鼠在深麻醉下去勢。

1.2 材料

Rabbit anti-adrogen receptor：單克隆抗體，購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，批號：BA0004；規(guī)格：0.2 mL(200 μg/mL)；DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術(shù)有限公司，批號：050324；多聚賴氨酸：Sigma公司生產(chǎn)，華美生物工程有限公司分裝，批號：ISP8920；丙酸睪丸酮 (testosterone propionate)(批號：010504，華聯(lián)制藥公司)。

1.3 動物分組及造模

采用SD大鼠實驗, 隨機分成對照組和實驗組，以1.0%的氯胺酮作50～100 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠四肢及頭部固定于手術(shù)板上，腹部碘伏消毒后，從尿道上端約l cm處正中切開皮膚約1 cm，逐層分離進入腹腔，沿脂肪找到睪丸，結(jié)扎系膜血管，切除雙側(cè)睪丸和附睪，關(guān)腹。消毒、對皮。術(shù)后肌注慶大霉素每只0.1 mL，預(yù)防感染?；謴?fù)一周后，開始給藥，對照組注射橄欖油每只0.1 mL，給藥組注射丙酸睪酮(每只0.5 mg)0.1 mL[3]，均給藥一個月(30d)。每天皮下注藥一次，每周根據(jù)動物體重變化調(diào)整給藥劑量。于最后一次給藥后24 h取血、處死、取材。測量前列腺體積、濕重、計算前列腺系數(shù)。

1.4 取血和取材

在深麻醉下，打開腹腔，經(jīng)腹主動脈取血，離心，取上層血清，-20℃保存待測。立即取出前列腺、稱重和測量體積，固定于甲醛中。

1.5 病理制片和免疫組化

前列腺組織固定并制成蠟塊。制作5 μm石蠟切片用于鐵蘇木素染色。并購買雄激素受體(AR)免疫組化試劑盒，按照說明進行染色。二甲苯脫蠟3次，每次10 s；無水乙醇洗去二甲苯兩次，每次5 s；依次酒精濃度從高到低梯度水化，微波修復(fù)抗原后，加一抗(1∶50)，孵育1 h(37℃)二抗孵育20 min(37℃)DAB顯色后終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染后，在顯微鏡下觀察。

1.6 基因芯片檢測

采用大鼠全基因組芯片對兩組大鼠基因進行檢測，把大鼠前列腺RAN提出，按照組別分別把各組所有的RNA混合后檢測。檢測儀器和軟件：GeneChip Scanner 3000：Affymetix；GeneChip operating software： Affymetix。

1.7 實時定量PCR檢測

使用樣品RNA進行cDNA合成后，制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板，進行實時定量PCR檢測。

1.8 統(tǒng)計方法

以SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行整理和分析。用單因素方差分析進行多組均數(shù)比較，再用最小顯著差數(shù)法(LSD法)進行兩兩比較，以檢測哪幾對均數(shù)間的差別有顯著意義。

RT-PCR結(jié)果分析方法：各樣品的目的基因和管家基因分別進行real-time PCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠前列腺標(biāo)本鐵蘇木素染色

正如我們預(yù)期結(jié)果，對照組大鼠前列腺發(fā)生形態(tài)學(xué)萎縮，注射睪丸酮(T)導(dǎo)致前列腺細(xì)胞增殖活躍，且前列腺上皮細(xì)胞有絲分裂的方向與基底膜平行 (染色體有絲分裂方向與基底膜夾角在0～45°，見圖1), 但是對照組前列腺上皮細(xì)胞有絲分裂的方向與基底膜垂直 (染色體有絲分裂方向與基底膜夾角在45°～90°，圖1)。T 的注射導(dǎo)致前列腺上皮細(xì)胞有絲分裂方向發(fā)生了改變。T注射后與基底膜平行的前列腺上皮細(xì)胞數(shù)分別為7.9%。圖1見封底。

2.2 雄激素對前列腺雄激素受體表達(dá)的影響

T給藥組，經(jīng)雄激素受體(AR)免疫組化染色觀察，給藥組均有 AR陽性表達(dá)，腺細(xì)胞核內(nèi)可見大量亮黃褐色顆粒，為AR表達(dá)(見圖2，封底)，而對照組AR無明顯表達(dá)。

2.3 大鼠基因芯片結(jié)果

基因芯片檢測到一些促進細(xì)胞增殖的基因如雄激素受體相關(guān)蛋白(RAN)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子(ODC1)和Wnt通道的Wnt2等基因均上調(diào)，而抑制細(xì)胞增殖的基因如負(fù)調(diào)控Wnt通道的DKK3和促進細(xì)胞凋亡的FAS等基因下調(diào)(見表1)。

表1 T組與對照組差異基因表達(dá)

2.4 實時定量PCR結(jié)果

實時定量PCR時各樣品加樣量均為1 μL，然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個樣品的1 μL體積的cDNA其含量并不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因β-actin(不同樣品間表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參，以樣品待測基因的值除以此樣品內(nèi)參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量(見表2和圖3，圖3見封底)。

表2 RT-PCR基因相對表達(dá)量

3 討論

長期暴露于T，前列腺上皮細(xì)胞有絲分裂的方向發(fā)生改變，提示我們可以從新的角度研究T促進前列腺的增殖作用[4]。從鐵蘇木素染色和AR免疫組化結(jié)果，可以看出前列腺是T的靶器官，長期暴露于T，引起前列腺細(xì)胞增殖和細(xì)胞有絲分裂方向的改變。由于對照組的前列腺上皮細(xì)胞未見明顯的細(xì)胞增殖和有絲分裂方向與前列腺基底膜平行現(xiàn)象，所以這一現(xiàn)象的機制可能和雄激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近二、三十年發(fā)現(xiàn)的信號分子家族，它在許多增生性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中，發(fā)揮著重要作用[5, 6]。這一現(xiàn)象也可能和WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[7, 8]。

據(jù)此，我們對28,000多個大鼠基因進行了分析，并通過RT-PCR試驗進行驗證。證實WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和AR激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了雄激素對前列腺上皮細(xì)胞的有絲分裂的影響。與對照組相比，本實驗暴露于T的大鼠，WNT2等正調(diào)控基因上調(diào)，而DKK3等負(fù)調(diào)控基因下調(diào)。DKK通過結(jié)合及激動LRP5/6受體，以及促進溶酶體對它們的細(xì)胞內(nèi)攝作用，而抑制Wnt通道的[9,10]。目前對DKK家族了解較少，尤其是DKK-3。有研究證明前列腺癌細(xì)胞中缺少DKK-3基因[11]，其表達(dá)量增加可以抑制腫瘤的發(fā)展[12]。但對其在良性前列腺增生中的作用，研究罕見。本實驗發(fā)現(xiàn)，給予去勢大鼠T，DKK-3的表達(dá)較對照組下調(diào)。而T亦是誘發(fā)良性前列腺增生模型的藥物[13]。由此可見，DKK-3基因下調(diào)致使抑制細(xì)胞增生和分化的作用下降，也可以導(dǎo)致前列腺細(xì)胞良性增生[14]。WNT2參與經(jīng)典WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激細(xì)胞增殖，參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的衰老過程，在衰老細(xì)胞中可以檢測到WNT2依賴信號下調(diào)[15]。由于WNT2的高表達(dá)刺激前列腺上皮細(xì)胞核分裂增多，激發(fā)WNT信號通路，改變前列腺上皮細(xì)胞極性[7]，可能從此途徑造成前列腺上皮細(xì)胞染色體的改變。

而AR受體是重要的基因調(diào)節(jié)蛋白，它是細(xì)胞內(nèi)雄激素通路的重要中間體[16]。長期慢性的雄激素刺激可以促進分泌性上皮細(xì)胞表達(dá)出AR受體。而存在于前列腺上皮基底細(xì)胞的亞型被認(rèn)為是表達(dá)干細(xì)胞，干細(xì)胞衰老和損傷的分子機制是老年性疾病(如BPH和腫瘤等)的重要誘發(fā)原因[17]。前列腺基底細(xì)胞不依賴雄激素存活，而雄激素存在時引發(fā)其增殖和分化[18]，是引發(fā)前列腺細(xì)胞增殖的機制之一。TGM4是AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因之一，其在正常和異常前列腺中均有表達(dá)，很多研究均把TGM4作為前列腺上皮細(xì)胞特征性標(biāo)志物的候選標(biāo)志物[19]。T組大鼠前列腺組織TGM4上調(diào)，促進了前列腺細(xì)胞的增殖。本實驗T給藥組FAS基因下調(diào)，抗細(xì)胞凋亡能力下降[20]，細(xì)胞凋亡減少，可致前列腺細(xì)胞發(fā)生增殖。RAN是RAS家族的成員，參與雄激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，正調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄。對RAN和前列腺癌的關(guān)系研究較多，但是對它和前列腺良性增生的關(guān)系研究甚少。在本實驗中經(jīng)RT-PCR驗證，RAN基因較對照組上調(diào)，它在BPH中也參與了細(xì)胞的增殖過程。AR在正常和異常前列腺中均發(fā)揮著重要作用，AR受激素與受體結(jié)合后共同調(diào)節(jié)，許多共同調(diào)節(jié)點和RAS家族有關(guān)。最近有研究發(fā)現(xiàn)RAS反應(yīng)成分結(jié)合蛋白(RREB-1)是AR的配體和共同調(diào)節(jié)體可以抑制AR功能。RAS/MAPK激酶通路可以對抗RREB-1對雄激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用[21]，RAN作為RAS的一員參與了這一過程，從而促進前列腺細(xì)胞增殖。此外，Ran還參與有絲分裂紡錘絲組織和生物發(fā)生，可能通過該機制改變了前列腺上皮細(xì)胞的有絲分裂方向。Krüppel-like5因子在RAS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，通過激活細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白B1/Cdc2 復(fù)合物，從而促進了細(xì)胞的有絲分裂[22]。

T可以改變前列腺上皮細(xì)胞的染色體有絲分裂的方向。WNT和AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了這一過程，Krüppel-like5因子在這一現(xiàn)象中的作用，仍需繼續(xù)深入研究。

(本文圖1～3見封底)。

[1] Berry SJ, Coffey DS, Walsh PC, et al.The development of human benign prostatic hyperplasia with age [J].J Urol, 1984, 132:474-479.

[2] Gunin AG..Estrogen changes mitosis orientation in the uterine epithelia cells [J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2001, 97:85-89.

[3] 劉向云, 邱曉燕, 吳建輝, 等.雌/雄激素比例對去勢大鼠前列腺體積及其臟器系數(shù)的影響 [J].中國實驗動物學(xué)報, 2007, 15(2):40-44.

[4] Liu XY, Li DM, Zhang XF, et al.Mitosis orientation in the prostate epithelia cells by endocrine effect [J].Acta Pharmacol Sin, 2008, 29(1):226-230.

[5] Liu XY, Xu YW, Xie CJ, et al.Possible mechanism of benign prostatic hyperplasia induced by androgen-estrogen ratios in castrated rats [J].Indian J Pharmacol, 2010, 42(5):312-317.

[6] Johan H, Anders S., Jan-?ke G.Current concepts and significance of estrogen receptor β in prostate cancer [J].Steroids, 2012, 77:1262-1266.

[7] Logan CY, Nusse R.The Wnt signaling pathway in development and disease [J].Annu Rev Cell Dev Biol, 2004, 20:781-810.

[8] Polakis P.Wnt signaling and cancer [J].Genes, 2000, 14:781-810.

[9] Zitranski N, Ackermann F, Borth H, et al.Cell signalling [J].Eur J Cell Biol, 2010, 89(Suppl 1):1-S2-1.

[10] Levasseur R, Lacombe D, de Vernejoul MC.LRP5 mutations in osteoporosis-pseudoglioma syndrome and high-bone-mass disorders [J].Joint Bone Spine, 2005, 72:207-214.

[11] Davidson G, Mao B, del Barco Barantes I, et al.Kremen proteins interact with Dickkopf1 to regulate anteroposterior CNS patterning [J].Development, 2002, 129(24):5587-5596.

[12] Fernando A, Masakiyo S, Mikiro T, et al.Adenovirus-mediated overexpression of REIC/Dkk-3 selectively induces apoptosis in human prostate cancer cells through activation of c-Jun-NH2-Kinase [J].Cancer Res, 2005, 65:9617-9622.

[13] Hsieh SY, Hsieh PS, Chiu CT, et al.Dickkopf-3/REIC functions as a suppressor gene of tumor growth [J].Oncogene, 2004, 23:9183-9189.

[14] Kawano Y, Kitaoka M, Hamada Y, et al.Regulation of prostate cell growth and morphogenesis by Dickkopf-3 [J].Oncogene, 2006, 25:6528-6537.

[15] Ye XF, Zerlanko B, Kennedy A, et al.Downregulation of Wnt signaling is a trigger for formation of facultative heterochromatin and onset of cell senescence in primary human cells [J].Mol Cell, 2007, 27:183-196.

[16] Gao WQ.Androgen receptor as a therapeutic target [J].Adv Drug Deliver Rev, 2010, 62(13):1277-1284.

[17] Chatterjee B.The role of the androgen receptor in the development of prostatic hyperplasia and prostate cancer [J].Mol Cell Biochem, 2003(1-2):253:89-101.

[18] Beltrami AP1, Cesselli D, Beltrami CA.At the stem of youth and health [J].Pharm Ther, 2011, 129(1):3-20.

[19] Isaacs JT, Coffey DS.Etiology and disease process of benign prostatic hyperplasia [J].Prostate, 1989, 15(suppl 2):33-50.

[20] Thielen JL, Volzing KG, Collier LS, et al.Markers of prostate region-specific epithelial identity define anatomical locations in the mouse prostate that are molecularly similar to human prostate cancers [J].Differentiation, 2007, 75(1):49-61.

[21] Matsumura Y, Tanaka N, Fujimoto K, et al.Phosphorylation status of the Fas-associated death domain-containing protein (FADD) is associated with the progression of prostate cancer [J].J Pathol, 2005, 206(4):423-432.

[22] Mukhopadhyay NK, Cinar B, Mukhopadhyay L, et al.The zinc finger protein Ras-responsive element binding protein-1 is a coregulator of the androgen receptor: Implications for the role of the Ras pathway in enhancing androgenic signaling in prostate cancer [J].Mol Endocrinol, 2007, 21:2056-2070.