熱應激對小鼠器官指數(shù)、小腸損傷及胃HSP70 mRNA表達的影響

王超，趙傳超，施忠秋，廖睿，周穎，齊智利

(華中農業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070)

隨著全球變暖，溫室效應加劇，熱應激對高度集約化養(yǎng)殖模式下的畜禽以及養(yǎng)殖者的經濟效益的影響顯現(xiàn)，引發(fā)熱應激方面的研究日益增多。

監(jiān)測應激畜禽各器官的變化有利于判斷機體機能是否正常，而熱應激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)家族蛋白是細胞處于應激時迅速合成的一類高度保守的蛋白[1,2]，一定范圍內， HSP70在細胞內含量越高，細胞的熱耐力越強[3]。小腸是畜禽營養(yǎng)物質消化吸收的主要場所，小腸黏膜結構的穩(wěn)定是保證營養(yǎng)物質正常吸收和機體正常生長的前提。本實驗通過研究小鼠熱應激和非熱應激條件下其器官指數(shù)，胃黏膜HSP70mRNA表達，肝臟、十二指腸和空腸形態(tài)以及血漿中胰島素、胰高血糖素含量，研究動物主要器官對熱應激的敏感度，為實際生產中動物怎樣避免熱應激損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

42日齡左右的SPF級KM小鼠18只，平均體重(24.23±3.63)g，親代購自湖北省實驗動物研究中心【SCXK(鄂)2008-0005】，自繁后代。實驗采用單因子實驗設計，將小鼠隨機分為兩種方法處理，每個處理設3個重復，每個重復3只。1組為對照組，在溫度15～25℃、相對濕度30%左右條件下正常生長；2組為實驗組，實驗期間2組小鼠每天中午12:00～13:00置于(39±1)℃的熱處理箱中，其余時間的飼養(yǎng)管理和對照組一致。實驗場地位于華中農業(yè)大學動物科技學院動物房【SYXK(鄂)2010-0029】，小鼠自由采食、飲水。適應期3 d，預試期3 d，正試期10 d。

1.2 樣品的采集和制備

正試期第9天 20:00給所有小鼠禁食不禁水。次日熱處理完后全部小鼠眼球采血，放入2 mL抗凝管中，安樂死，剖檢出心、肝、脾、肺、腎，每個處理中選擇體重相近的小鼠各3只，采集鼠胃，切開并用0.9%的生理鹽水沖洗，在胃下部同一區(qū)域切一小塊置于2 mL凍存管中，做好標記，迅速放入液氮罐中待用。取出每只小鼠肝臟同一位置一段、十二指腸和空腸中段一部分，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，放入標記好的含有4%多聚甲醛的5 mL離心管中固定，備用。

1.3 測定的指標和方法

1.3.1 器官指數(shù)、肝臟形態(tài)、胃黏膜HSP70mRNA表達量的測定

器官指數(shù)(%)=器官鮮重(g)/宰前空腹活重(g)× 100%。用HE染色法對肝臟形態(tài)進行觀察。目的基因 HSP70 和內參基因 GAPDH 的引物由Primer 5.0 軟件設計(如表1)，由Invitrogen Biotechnology Co., LTD公司(中國)合成，采用Trizol 法提取總RNA，反轉錄出對應的cDNA，通過熒光定量PCR得到溶解曲線和擴增曲線，獲得Ct值，換算出mRNA的拷貝數(shù)，對HSP70 mRNA表達情況進行判斷。

1.3.2 小腸黏膜的組織結構的測定

十二指腸和空腸切片制作，HE染色，觀察圖形。并在顯微鏡下選出5個最長絨毛的長度、最深隱窩的深度。切片用O1ympus攝影顯微鏡拍照保存，采用影像分析軟件Image-Pro Plus 5.02(Media Cybernetics公司，美國)進行數(shù)據(jù)收集。

1.3.3 血液指標的測定

購買Bender MedSystems 公司(奧地利)的ELISA試劑盒測定小鼠血液中胰島素和胰高血糖素的含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方法

2 結果

2.1 熱應激對小鼠主要器官的影響

2.1.1 熱應激對小鼠器官指數(shù)的影響

見表2，熱應激組和對照組比較，小鼠器官指數(shù)變化不明顯，差異無顯著性(P>0.05)。

表1 引物信息

表2 熱應激對小鼠器官指數(shù)的影響 ± s，%)

表3 兩種處理對小鼠十二指腸和空腸形態(tài)的影響±s)

2.1.2 熱應激對小鼠肝臟形態(tài)的影響

從圖1(彩插10)中可以看出，對照組小鼠的肝臟組織結構完整，熱處理組的肝臟形態(tài)異常，受損嚴重，細胞出現(xiàn)分散甚至壞死，有出血、溶血現(xiàn)象。

2.1.3 熱應激對小鼠胃黏膜HSP70mRNA表達量的影響

胃黏膜HSP70mRNA表達量：對照組為(1.04±0.17)，熱應激組為(1.64±0.21)，熱應激組顯著(P<0.05)高于對照組。

2.2 熱應激對小鼠小腸黏膜的影響

2.2.1 熱應激對小鼠十二指腸和空腸的絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度/隱窩深度比值的影響

熱應激小鼠十二指腸絨毛高度和隱窩深度與對照組的相比都極顯著降低(P<0.01)，絨毛高度和隱窩深度的比值與對照組的相比差異無顯著性(P>0.05)；空腸的絨毛高度與對照組的相比極顯著降低(P<0.01)，絨毛高度和隱窩深度的比值與對照組的相比顯著降低(P<0.05)，隱窩深度與對照組的相比差異無顯著性(P>0.05)。 見表3。

2.2.2 熱應激對小鼠十二指腸和空腸形態(tài)的影響

由圖2可知，無論是十二指腸還是空腸，熱應激后黏膜結構都受到一定程度的損傷，自身結構不完整，部分腸絨毛脫落、縮短，絨毛之間排列散亂，界限模糊，部分腸絨毛的頂端有開裂，暴露出固有層組織(圖2中B、D)。對照組小鼠的十二指腸和空腸腸黏膜結構完整，沒有絨毛脫落現(xiàn)象，腸絨毛之間排列整齊，清晰可見(圖2中A、C)(圖2見彩插10)。

2.3 熱應激對小鼠糖代謝相關激素的影響

熱應激對小鼠血液中胰島素影響顯著，熱應激組小鼠血液中胰島素含量顯著下降(P<0.05)，而二者胰高血糖素濃度差異無顯著性(P>0.05)。

表4 熱應激對小鼠血液中胰島素和胰高血糖素含量的影響 ± s，mIU/L)

3 討論

3.1 熱應激對小鼠主要器官的影響

3.1.1 熱應激對小鼠器官指數(shù)的影響

一定程度上，內臟器官的重量和指數(shù)可反映動物機體的機能狀況，對于生產實踐和理論研究有著十分重要的意義[4]。本實驗得出的結果是熱應激對小鼠器官指數(shù)的影響不顯著(P>0.05)，但可看出脾臟指數(shù)有降低的趨勢，候殿東等[5]研究發(fā)現(xiàn)熱應激(42℃)組小鼠的脾臟指數(shù)均比對照組顯著降低，而本研究出現(xiàn)差異不顯著的原因可能和熱處理時間及周期的長短相關，有待進一步研究。

3.1.2 熱應激對小鼠肝臟形態(tài)的影響

肝臟既是動物機體新陳代謝的重要器官，也是消化系統(tǒng)中重要的消化腺，肝細胞核的狀態(tài)能夠說明肝組織是否受到較嚴重的影響。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，熱處理后小鼠肝臟形態(tài)異常，肝細胞受損嚴重，寧章勇等[6]也研究發(fā)現(xiàn)熱應激可導致雞的肝細胞血管、肝血竇產生不良現(xiàn)象，并出現(xiàn)水泡變性。表明熱應激能對動物肝臟造成損傷，從而影響營養(yǎng)物質正常消化吸收。

3.1.3 熱應激對小鼠胃黏膜HSP70mRNA表達量的影響

HSP70是加強胃黏膜防御功能的主要HSP[7]。Nakamura等[8]研究發(fā)現(xiàn)胃黏膜細胞應激條件下產生的HSP可以抵抗7.5%乙醇引發(fā)的細胞壞死及表層脫落。而且大鼠胃內產生的HSP量和其黏膜保護是呈現(xiàn)正相關的[9]。然而HSP70 對細胞的保護作用只能在一定的范圍內起作用，如果給予超過一定強度的應激或者應激持續(xù)的時間太長，機體仍會受到嚴重損傷。王楓等[3]發(fā)現(xiàn)，45℃下暴露超過6 h 以上的細胞，不管是HSP70 表達量高還是低，細胞活力都會降低。這是因為應激時間過長，阻礙細胞正常合成蛋白質，并致使蛋白質變性，當HSP70的保護能力無法消除變性蛋白引發(fā)的危害時就會影響細胞的功能，使細胞無法正常生存，進而發(fā)生死亡。本實驗結果顯示，小鼠在(39±1)℃的環(huán)境下應激1 h，其胃黏膜HSP70mRNA的表達量顯著高于對照組，說明熱應激下胃黏膜通過HSP70的增加來提高耐受能力，以便渡過高溫期。

3.2 熱應激對小鼠小腸黏膜的影響

動物機體對營養(yǎng)物質消化和吸收的主要部位是腸粘膜。熱應激會導致營養(yǎng)物質消化及吸收率降低，影響畜禽的生長[10]。鮑恩東等[11]研究發(fā)現(xiàn)，動物在高溫應激下，機體內的腸道黏膜屏障會受到損傷，影響機體對營養(yǎng)物質的正常消化吸收。因此，可將腸黏膜的損傷程度作為評價熱應激的重要指標。腸絨毛高度可反映腸道對于營養(yǎng)物質的吸收能力，隱窩深度可反映絨毛細胞的生成率，而絨毛高度/隱窩深度的比值則是對小腸功能的一種綜合評價，比值下降說明黏膜上皮發(fā)育不良或者受到損傷，對養(yǎng)分的消化吸收能力降低，影響機體健康[12]。吳錦華等[13]研究結果表明，母鼠產前熱應激使仔鼠的小腸黏膜組織結構發(fā)生了顯著變化，抑制了仔鼠小腸的消化、吸收能力及免疫力。胡艷欣等[12]在對熱應激豬腸道結構和功能的研究中發(fā)現(xiàn)，熱應激后豬腸黏膜結構嚴重損傷；每段腸的絨毛長度、絨毛寬度、隱窩深度及絨毛長度/隱窩深度的比值都出現(xiàn)降低，其中降低比較顯著的是回腸的絨毛長度。本次實驗結果表明熱應激致使小鼠十二指腸和空腸嚴重損傷，影響了小鼠的正常生長，尤其十二指腸的最為明顯。說明熱應激可以通過損害腸黏膜來影響動物對營養(yǎng)物質的消化吸收，進而影響機體健康。

3.3 熱應激對小鼠糖代謝相關激素的影響

胰島素對動物機體內部的平衡起著重要的作用，是體內唯一降低血糖的激素，還可促使糖原、脂肪和蛋白質的合成；胰高血糖素則是促進分解代謝的激素，既可促使肝糖原分解和糖異生，使血糖升高，也可促使脂肪的分解。本實驗結果表明熱應激組小鼠血漿胰島素和胰高血糖素含量均低于對照組，說明熱應激對小鼠的糖代謝具有一定的抑制作用。不過，胰島素的降低，也會降低對轉錄因子FoxO1的磷酸化程度，而FoxO1又會促進肝臟的糖異生[14,15]，而胰島素未回升的原因可能和肝臟受到損傷有關。因此，熱應激對糖代謝影響機理究竟如何，有待深入研究。

熱應激對小鼠器官指數(shù)影響不顯著，可顯著提高小鼠胃黏膜HSP70mRNA的表達量。并導致小鼠肝臟、十二指腸和空腸結構明顯損傷及十二指腸和空腸的絨毛高度、十二指腸的隱窩深度極顯著下降，空腸的絨毛高度/隱窩深度的比值顯著下降。還可顯著降低小鼠血液胰島素的含量。

(本文圖1,2見彩插10。)

[1] 張霞, 屈平平, 叢霞, 等.熱應激對小鼠胚胎細胞HSP70表達和超微結構的影響 [J].畜牧獸醫(yī)學報, 2011, 42(10):1463-1469．

[2] Buchmeier NA, Heffron F.Induction of Salmonella stress proteins upon infection of macrophages [J].Science, 1990, 248(4956):730-732.

[3] 王楓, 高俊生．HSP70 高表達對K562 細胞熱耐力的影響 [J]．中國公共衛(wèi)生, 2000, 16(7):587-588．

[4] 許貴善,刁其玉,紀守坤,等．不同飼喂水平對肉用綿羊生長性能、屠宰性能及器官指數(shù)的影響 [J]．動物營養(yǎng)學報,2012,24(5):953-960．

[5] 侯殿東, 趙寶霞, 劉輝.應激致免疫功能降低動物模型的建立 [J].中國實驗動物學報, 2007, 15(5):330-332．

[6] 寧章勇, 劉思當, 趙德明, 等．熱應激肉仔雞胸腺、 法氏囊超微組織學觀察和細胞凋亡檢測[J].畜牧獸醫(yī)學報, 2004, 35(3):310-313.

[7] 藍程, 孫曉寧, 董麗偉, 等.熱休克蛋白70對肝硬化門靜脈高壓性胃病大鼠胃黏膜損傷的保護作用[J].胃腸病學, 2010, 15(8):467-470.

[8] Nakamura K, Rokutan K, Marui N, et al.Induction of heat shock proteins and their implication in protection against ethanol-induced damage in cultured guinea pig gastric mucosal cells [J].Gastroenterology,1991, 101(1):161-166.

[9] Itoh YH, Noguchi R.Pre-treatment with mild whole-body heating prevents gastric ulcer induced by restraint and water-immersion stress in rats [J].Int J Hyperthermia, 2000, 16(2):183-191.

[10] Garriga C, Hunter RR, Amat C, et al.Heat stress increases apical glucose transport in the chicken jejunum [J].Am J Physiol Regul Integr Compar Physiol, 2006, 290(1):R195-R201.

[11] 鮑恩東, 龔遠英, 付旭彬, 等．肉雞熱應激病理損傷與熱應激蛋白(HSP70)相關性研究 [J]．中國農業(yè)科學, 2004, 37(2):301-305．

[12] 胡艷欣, 肖沖, 佘銳萍, 等.熱應激對豬腸道結構及功能的影響 [J].科學技術與工程, 2009 (3):581-586．

[13] 吳錦華, 胡茂穎, 陳忠, 等.產前熱應激對仔鼠小腸黏膜組織結構發(fā)育的影響[C].2011年環(huán)境污染與大眾健康學術會議, 2011, 75-80．

[14] 陳小玲, 黃志清, 毛湘冰, 等.FoxO1的功能研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38(9)::90-93.

[15] Rena G, Woods YL, Prescott AR, et al.Two novel phosphorylation sites on FKHR that are critical for its nuclear exclusion [J].EMBO J, 2002, 21(9):2263-2271.