黃芪多糖對Lewis 肺癌小鼠細(xì)胞因子及順鉑所致免疫功能低下的影響

明海霞，陳彥文，胡永浩，董曉麗，顧靜，李楊

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730070；

2.甘肅中醫(yī)學(xué)院生理教研室，甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000；

3.甘肅中醫(yī)學(xué)院解剖教研室，甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

根據(jù)IARC(國際癌癥研究機(jī)構(gòu))發(fā)布的最新在線數(shù)據(jù)庫“全球癌癥2012”(GLOBOCAN 2012)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年，全球癌癥新發(fā)病例上升到1410萬人，另外有820萬人死于癌癥，其中發(fā)病率和死亡率均居首位的是肺癌[1]。目前化療仍是肺癌綜合治療的主要手段，但副作用大，因此尋找一種對腫瘤細(xì)胞有高效的殺傷或抑制作用，而對正常細(xì)胞無毒性或有保護(hù)作用的化療藥物顯得尤為重要?，F(xiàn)代研究表明，黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)可增強(qiáng)腫瘤抑制，減少毒副反應(yīng)，并可增進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫功能，改善腫瘤患者的生活質(zhì)量[2]。為進(jìn)一步探討APS輔助抗腫瘤機(jī)制，揭示其與荷瘤小鼠免疫功能之間的關(guān)系，本輔助化療可增強(qiáng)腫瘤抑制，減少毒副反應(yīng)，并可增進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫功能，實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度APS對小鼠Lewis肺癌移植瘤生長、細(xì)胞因子及DDP所致免疫功能的影響，為揭示APS的抑瘤和增效減毒機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株及動物

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株(LLC)中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供。

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，共90只，6～8周齡，體重約(20±2)g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供【SCXK(甘)2013-0002】；實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證【SYXK(甘)2011-0001-0001110】。

1.2 主要藥品

黃芪多糖(APS)：陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，產(chǎn)品批號：Uhqdt130518；使用時(shí)將黃芪多糖干粉劑用生理鹽水溶解，滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。順鉑注射液(DDP)2 mL：每支10 mg，云南個舊生物藥業(yè)有限公司，批號：120201。

1.3 主要試劑

HyClone High Glucose DMEM、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)：均購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司(批號：NYE0885、NVJ0313、NYE0884)；小鼠IL-2、IL-6、IL-12、TNF-αELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物工程公司(批號：2012920)。

1.4 主要儀器

新苗牌超凈工作臺：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Heal Force HF151-CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：香港力康發(fā)展有限公司；美國Bio-Rad iMark酶標(biāo)儀，購自上海眾生生命科學(xué)發(fā)展有限公司；CT14RD型高速冷凍離心機(jī)，購自天美科技有限公司；AR224CN電子天平，購自奧豪斯儀器(上海)有限公司ZHWY-110X30；AE31EF-INY熒光倒置相差顯微鏡：Motican Pro。

以上儀器由甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心和中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新鮮胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青、鏈霉素各100 IU /mL)中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。至對數(shù)生長期(80%鋪滿全層)時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶常規(guī)消化，將細(xì)胞調(diào)整為1×107個/mL的懸液。

2.2 肺癌移植瘤模型的建立、分組及用藥

90只小鼠，設(shè)空白對照組10只，余80只依次造模[3]：將復(fù)蘇的Lewis肺癌瘤株，接種于3只小鼠右腋窩皮下以保種，每10d轉(zhuǎn)種一次，連續(xù)2次，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取生長良好的Lewis肺癌組織，剪碎勻漿，按照腫瘤質(zhì)量(g)與生理鹽水(mL)1∶3勻漿制成細(xì)胞懸液，經(jīng)0.2%臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×107個。接種于C57BL/6J小鼠右前肢腋窩皮下，每只約0.2 mL，全程嚴(yán)格無菌操作。將造模的小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只：模型組(等體積生理鹽水)，順鉑陽性對照組(6 mg/kg DDP)，APS低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高劑量(200 mg/kg)組，聯(lián)合用藥低、中、高劑量組(DDP劑量減半，APS各劑量同上)，于造模次日起各組分別腹腔注射等體積的藥物0.3 mL。DDP每周一次，其余藥物每天1次，連續(xù)20 d。

2.3 標(biāo)本檢測

于第21天安樂處死，眼球摘取采血，放置4 h后離心，分離血清，放于-20℃?zhèn)溆?。臨用前平衡至室溫，按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，測定細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平。

取標(biāo)本：常規(guī)分離組織，稱體重、脾重、胸腺、腫瘤組織的重量，并將腫瘤組織一半用4%多聚甲醛固定，一半用冷生理鹽水沖洗后備用。計(jì)算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及抑瘤率。脾指數(shù)(mg/g)=脾重(mg)/體重(g)，胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重(mg)/體重(g)，抑瘤率=(1 - 實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對照組平均瘤重)× 100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 移植瘤模型建立結(jié)果

接種后5 d左右即可于右腋下捫及小腫塊即實(shí)體瘤。與陰性對照組相比，早期體重增大，后DDP化療組小鼠體重呈下降趨勢，小鼠皮毛糙雜，活動受限，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)解剖均可得腫瘤。

3.2 黃芪多糖對小鼠Lewis肺癌移植瘤生長的影響

與模型對照組比較，黃芪多糖低、中、高劑量組和順鉑組荷瘤小鼠瘤質(zhì)量顯著減輕，黃芪多糖低、中、高劑量組與順鉑組比較，小鼠瘤質(zhì)量差異無顯著性(P>0.05)。而聯(lián)用黃芪多糖可以顯著提高對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的抑瘤率，與順鉑組比較差異有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 APS對Lewis肺癌移植瘤生長的影響及對DDP增效作用± SD，n=10)

3.3 黃芪多糖對Lewis 肺癌小鼠細(xì)胞因子的影響

黃芪多糖可提高Lewis 肺癌小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平，與模型組比較差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)；DDP陽性對照組血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平則降低，與模型組比較差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)；聯(lián)合用藥組血清中各細(xì)胞因子與DDP組比較差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)。見表2。

表2 APS對Lewis 肺癌小鼠細(xì)胞因子的影響±s，n=10)

3.4 黃芪多糖對Lewis肺癌移植瘤小鼠DDP所致免疫器官指數(shù)的影響

與空白對照組比較，黃芪多糖中、高劑量組和聯(lián)合用藥組脾臟指數(shù)顯著升高；與模型組比較，黃芪多糖高劑量和聯(lián)合高劑量脾臟指數(shù)差異有顯著性(P<0.05)；與DDP組比較，黃芪多糖各劑量和聯(lián)合應(yīng)用黃芪多糖組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均升高。見表3。

表3 APS對Lewis肺癌移植瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響及對DDP減毒作用±s，n=10)

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，惡性腫瘤的發(fā)生與機(jī)體正氣虧虛密切相關(guān)，正氣虧虛，邪氣乘虛而入則易患腫瘤。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，當(dāng)免疫系統(tǒng)失去監(jiān)視功能時(shí)，就會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而腫瘤分泌的一些細(xì)胞因子會抑制機(jī)體的免疫功能，使腫瘤進(jìn)一步發(fā)展、轉(zhuǎn)移，因此免疫功能紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。外界的致癌因素只是促使腫瘤發(fā)生的外部條件，這個觀點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)的“正虛致瘤”的理論是一致的。據(jù)報(bào)道化療藥物在抗腫瘤的同時(shí)，免疫器官指數(shù)明顯下降，嚴(yán)重?fù)p害免疫器官[4]，說明其抗瘤療效好的代價(jià)是在損傷整體的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。

近年研究證實(shí)，許多中藥可以通過提高腫瘤宿主的免疫功能等干擾腫瘤的生長、代謝、增殖過程，最終使腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡或凋亡[5]，同時(shí)發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，從而延長腫瘤患者的生存期。黃芪是傳統(tǒng)扶正固本中藥，其成分中黃芪多糖類和黃芪皂苷類物質(zhì)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，運(yùn)用黃芪調(diào)節(jié)人體免疫功能的作用來治療疾病，體現(xiàn)了中醫(yī)扶正治療的原則[6]。

IL-2能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、刺激T細(xì)胞增殖分化、誘導(dǎo)干擾素等多種細(xì)胞因子的分泌、增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多方面作用，是一種免疫增強(qiáng)劑。IL-2含量高低反映了宿主免疫系統(tǒng)清除自身損傷細(xì)胞、衰老變性細(xì)胞、自體變性方面的能力大小及宿主T淋巴細(xì)胞活化程度。IL- 6可以介導(dǎo)免疫球蛋白的分泌、加強(qiáng)終末B細(xì)胞的分化、促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞溶解細(xì)胞的能力、提高T細(xì)胞活化信號。各種細(xì)胞因子可以直接調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長，抑制癌細(xì)胞增殖或促使癌細(xì)胞分化，也可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的其他成員發(fā)揮作用，因?yàn)樵趨⑴c機(jī)體免疫反應(yīng)的過程中，它們并非獨(dú)立作用，而是存在于相互依存的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)之中。

本實(shí)驗(yàn)首次研究APS及APS聯(lián)合化療藥物DDP對Lewis肺癌小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α及免疫功能的影響，探討其抗腫瘤的機(jī)制和對DDP的增效減毒作用。結(jié)果顯示，APS能提高Lewis 肺癌小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平；增強(qiáng)DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能，對免疫器官有一定的保護(hù)作用；能抑制小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的生長，在與DDP減半量聯(lián)合使用時(shí)可使DDP抑瘤作用增強(qiáng)，且其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能有關(guān)，說明APS在抑制腫瘤生長的同時(shí)可能通過提高荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子水平而提高免疫功能，增強(qiáng)自身抗腫瘤能力，并對DDP有一定的增效減毒作用，與單純的化療藥物比較，有獨(dú)特的優(yōu)勢。有關(guān)黃芪多糖的抗腫瘤機(jī)制及對免疫系統(tǒng)的其它影響，值得進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用。

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