肝轉(zhuǎn)運體的生理變化對中草藥研究的影響*

劉 杰, 朱瓊妮, 侯瑋鈺, 陸遠富

(1. University of Kansas Medical Center, Kansas City KS 66160,USA;2. 遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨教育部-貴州省共建基礎(chǔ)藥理重點實驗室，貴州 遵義 563099)

中草藥的藥物相互作用在中國傳統(tǒng)中藥的研究過程中越來越重要[1-3]，當中草藥藥物提取物與處方藥或者非處方藥物合用時藥物間的相互作用更加明顯[2]。中草藥與其它藥物的合用可能會影響藥物的藥物代謝動力學與藥物效應學，從而增加/減弱它們的效果或者毒性作用[1,4-6]。其中，藥動學在中草藥與藥物的相互作用中占主要地位。藥動學包括吸收、分布、代謝及排泄，藥物代謝的主要器官在肝臟，而肝轉(zhuǎn)運體介導藥物的出胞和入胞，在藥物相互作用中起重要作用。

1 吳茱次堿對肝臟藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體的影響

1.1 藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體 藥物代謝主要發(fā)生在肝臟[7]，主要分為兩個步驟：①I相代謝反應，約90%以上的藥物在這相反應中被氧化、還原或水解。催化I相反應的酶主要為肝微粒體中的細胞色素P450 (CYP450) 酶；②II相代謝反應，即結(jié)合反應，藥物在這相反應中與一些內(nèi)源性物質(zhì)(如葡萄糖醛酸、谷胱甘肽、甘氨酸、硫酸等)結(jié)合或經(jīng)甲基化、乙?；笈懦鲶w外[8]，II相酶在中草藥與藥物相互作用中同樣發(fā)揮很重要的作用[8]。藥物轉(zhuǎn)運體又稱III相，主要分為兩類：一類為轉(zhuǎn)運底物進入細胞的有機陽離子轉(zhuǎn)運體(organic cation transporter, OCT)、有機陰離子多肽轉(zhuǎn)運體(organic anion-transporting polypeptide OATP)等;另一類為ATP依賴釋放能量的ABC結(jié)合式轉(zhuǎn)運體(ATP binding cassette transporter, ABC transporter)，包括多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein, MRP)，乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein BCRP)等[9]。藥物轉(zhuǎn)運體近年來被認為是中草藥合用其它藥物相互作用的基礎(chǔ)之一[10]。 中草藥與其他藥物的合用可導致藥物轉(zhuǎn)運蛋白的誘導或抑制，從而影響自身和合用藥物的效應[11]。藥物轉(zhuǎn)運體對藥物的影響與藥物療效、藥物相互作用、藥物不良反應及藥物解毒等密切相關(guān)[12]，然而目前對轉(zhuǎn)運體介導的中草藥與藥物相互作用的研究卻較少。

1.2 吳茱萸次堿對藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體的影響 轉(zhuǎn)運體介導藥物的體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄，從而進一步影響藥物的體內(nèi)過程[10]，這是中草藥與藥物相互作用的一個重要基礎(chǔ)[5,13]，如吳茱萸次堿合并用藥時，可加速咖啡因[14]，長效茶堿[15]，撲熱息痛[16]和黃連總生物堿[17]的排泄。轉(zhuǎn)運體對其是否產(chǎn)生影響卻不明確，故我們研究了中藥吳茱萸的提取物吳茱萸次堿對小鼠肝臟藥物代謝I,II,III相的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吳茱萸次堿不僅誘導I相代謝酶系P450和相關(guān)II相代謝酶，同時III相轉(zhuǎn)運體也是吳茱萸次堿的重要靶點[18]， 研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸次堿明顯的誘導有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽家族(Oatp1a1, Oatp1a4, Oatp1b2 和 Oatp2b1)的表達，從而增加藥物的肝細胞攝入和代謝，進而促進經(jīng)肝臟代謝并結(jié)合的藥物通過膽汁或腎排出體外。吳茱萸次堿也能誘導外排轉(zhuǎn)運體多藥耐藥相關(guān)蛋白(Mrp1,Mrp2,Mrp3,Mrp4)的表達。以Mrp2為例，它是多藥耐藥蛋白相關(guān)家族的一員，主要負責與葡萄糖醛酸或谷胱甘肽結(jié)合的內(nèi)源性及外源性物質(zhì)的外排[10,19]，是中草藥與藥物相互作用機制中的重要一員。吳茱萸次堿能誘導Mrp2的表達，提示吳茱萸次堿可促進經(jīng)葡萄糖醛酸和谷胱甘肽結(jié)合的產(chǎn)物經(jīng)膽汁排泄，進而影響中草藥與藥物的相互作用。肝臟I、II、III 相藥物代謝系統(tǒng)，并以吳茱萸次堿為例，顯示藥物的作用部位及產(chǎn)生的相應作用(見圖1)。

圖1 吳茱萸次堿對肝臟I相、II相和III相藥物代謝的影響示意圖

2 年齡和性別對肝臟藥物轉(zhuǎn)運體表達的影響

2.1 生理病理狀態(tài)對肝臟轉(zhuǎn)運體的影響 藥物轉(zhuǎn)運體是一類定位于細胞膜上的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛的分布在小腸，肝，腎，腦等器官。藥物吸收入血后經(jīng)肝細胞的血管側(cè)膜攝取進入肝細胞，經(jīng)過代謝反應后通過膽管側(cè)膜排入膽汁，血管側(cè)膜和膽管側(cè)膜存在很多藥物轉(zhuǎn)運體，包括介導攝入或排出肝臟的轉(zhuǎn)運體以及介導排出肝臟的轉(zhuǎn)運體[10]。研究發(fā)現(xiàn)肝臟生理病理條件下，尤其是在膽汁淤積和炎癥反應過程中藥物轉(zhuǎn)運體的改變非常明顯[20]，且轉(zhuǎn)運體的改變很可能與其mRNA轉(zhuǎn)錄時相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子受到抑制或誘導有關(guān)[10,21]。

2.2 年齡和性別對攝入轉(zhuǎn)運體Oatp2表達的影響 在給藥過程中，不同年齡階段，不同性別以及時間對體內(nèi)藥物濃度均有較大的影響。有研究表明在正常小鼠不同年齡階段轉(zhuǎn)運體的表達各不一樣[23]。有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽對多種內(nèi)、外源性物質(zhì)在生物體內(nèi)的攝取、清除具有重要作用[24]，如正常大鼠大腦和肝臟藥物攝入的有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽Oatp2的表達與年齡因素相關(guān)，大鼠腦內(nèi)Oatp2表達隨發(fā)育年齡增加表達呈下降趨勢，而肝內(nèi)Oatp2的表達則隨發(fā)育年齡的增長加而增加[25]。我們最近的研究表明(見圖2)，在SD大鼠出生2 d到60 d的8個時間點內(nèi)，肝臟Oatp2的表達隨發(fā)育年齡的增長而增加，這也符合肝功能隨年齡增長不斷成熟的生理特點。新生兒期肝內(nèi)Oatp2的低表達是為降低肝內(nèi)毒性物質(zhì)堆積所造成的肝臟損害，另外雄性動物Oatp2的表達明顯比雌性動物高，然而在雄性的老齡SD大鼠動物中(180 d，540 d)，Oatp2呈下降的趨勢這也與老齡動物肝臟各項生理功能下降的趨勢相符合。

注：A:表示與雌性大鼠比較*P<0.05；B:表示與60 d比較*P<0.05。 圖2 不同年齡階段SD大鼠有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽2(Oatp2)和多藥耐藥蛋白4(Mrp4)的mRNA表達的變化

2.3 年齡和性別對外排轉(zhuǎn)運體Mrp4表達的影響 Mrp4為ATP能量依賴性跨膜蛋白，分布在基底膜的外側(cè)，其在在睪丸、卵巢內(nèi)表達最高[10,26]，主要調(diào)節(jié)各種抑制細胞生長藥物、抗病毒藥物、抗生素及心血管藥物在體內(nèi)的再分布和腎臟的排泄，在細胞信號傳導和保護細胞中起關(guān)鍵作用[27]。Mrp4在雄性大鼠生長發(fā)育過程中隨著時間的增加而增加(見圖2)，尤其與出生前2 d(-2 d)比較，出生后21 d到60 dMrp4增加了10～40倍，在第35天達到最高值，是出生前2 d(-2)d的40倍。雌性大鼠肝臟Mrp4表達則相對較低，且其變化相對較小。老齡雄鼠(540 d)肝臟Mrp4的表達顯著降低至60 d鼠齡的35.7%，表明幼鼠與老齡大鼠體內(nèi)Mrp4的表達相對成年鼠的表達要低很多。

以上結(jié)果提示臨床在幼年和老年，轉(zhuǎn)運體的表達變化也可能導致藥物在肝臟內(nèi)蓄積而不能有效排除體外，進而導致藥物毒性增加。因此，藥物轉(zhuǎn)運體的生理改變可影響藥物相互作用并與機體疾病有密切的關(guān)聯(lián)[22]。

3 妊娠和哺乳動物肝臟轉(zhuǎn)運體的表達

3.1 妊娠肝內(nèi)膽汁淤積與肝臟轉(zhuǎn)運體 妊娠和哺乳期的胎鼠及幼鼠對營養(yǎng)的需求及其他生理變化顯著[28-29]，在此期間膽酸和膽固醇也有適應性的變化[29-31]，這些生理變化也會影響肝臟藥物代謝I,II,II相的相關(guān)基因的表達[32-33]。妊娠肝內(nèi)膽汁淤積(ICP)是一種發(fā)生在第三妊娠晚期的肝臟疾病[34]，許多研究表明其與膽汁酸代謝異常有關(guān)。充分了解膽汁酸的合成，運輸，和轉(zhuǎn)運將幫助我們揭示ICP病理學。因此我們研究了妊娠和哺乳期SD大鼠肝臟轉(zhuǎn)運體的表達情況。

3.2 孕期和哺乳期肝臟轉(zhuǎn)運體的表達 Oatp2和Mrp4是分別介導膽汁酸的攝取和外排的轉(zhuǎn)運體。在小鼠體內(nèi)孕期和哺乳期膽汁酸轉(zhuǎn)運體下調(diào)[32]，我們研究發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)也有同樣的現(xiàn)象[35](見圖3A、B)。Oatp2不僅是重要的膽汁酸攝入轉(zhuǎn)運體[32]，同時對藥物和其他異體物質(zhì)的攝取也發(fā)揮重要的作用[10](見圖3A)。Mrp4是主要的膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體[32]，其在大鼠孕期表達下降，在孕晚期有輕微的升高，但在哺乳期則表達升高，見圖3B。孕期和哺乳期Oatp2和Mrp4的變化可能是機體對幼鼠和胎鼠的保護作用的一種適應性反應。

了解轉(zhuǎn)運體在孕哺期的表達對ICP的防治有重要的意義[35]，并對孕哺期的合理用藥有重要的指導意義。

注：與空白對照組比較比較*P<0.05。 圖3 孕期和哺乳期SD大鼠有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽2(Oatp2)和多藥耐藥蛋白4(Mrp4)的表達

4 時辰對肝臟轉(zhuǎn)運體的影響

4.1 生物鐘和藥物代謝 臨床藥物給藥時間不同可能導致藥物效果的不同。晝夜節(jié)律是許多種生物行為和生理水平周期性波動的現(xiàn)象，而晝夜節(jié)律產(chǎn)生和維持的分子基礎(chǔ)是時鐘基因的節(jié)律性表達[36]。研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律在生物學和藥理學的研究中極為重要[37-38]，我們的研究工作表明細胞色素P450的表達呈明顯的晝夜節(jié)律性變化[37]，并影響不同時間給予撲熱息痛的毒性反應[35]。

4.2 生物鐘和肝轉(zhuǎn)運體 肝臟內(nèi)的攝取和排除轉(zhuǎn)運體隨著年齡的變化有明顯的差異，那么轉(zhuǎn)運體是否也存在晝夜節(jié)律性變化？我們最近研究發(fā)現(xiàn)Mrp2在正常大鼠體內(nèi)也存在明顯的晝夜節(jié)律變化(見圖4)。從06:00到18:00時，Mrp2的表達逐漸升高，其中雌鼠在18:00時升至峰值，是06:00時表達的6倍，然后Mrp2的表達在22：00時驟然下降到與06:00時相似的水平。且Mrp2晝夜的表達也具有雌雄差異性，雌鼠肝臟內(nèi)的表達高于雄鼠。Mrp2是ABCC外排轉(zhuǎn)運家族中的一員，與Mrp1有較高的同源性和功能特點，在大鼠肝臟中主要分布在肝細胞的膽管側(cè)面，協(xié)同底物從肝細胞向外排泄[40-41]，MRP2有較寬的內(nèi)源性和外源性的底物譜，是人體內(nèi)負責將膽酸鹽和膽紅素等成分排入膽汁的載體，具有保護肝細胞及避免因膽汁蓄積引起的肝毒性的作用，Mrp2的晝夜變化提示Mrp2介導轉(zhuǎn)運的藥物在不同的時間給藥會發(fā)生相應的變化。

因此，1 d內(nèi)不同時間給藥可影響藥物的相互作用，也是時辰藥理的一個重要研究內(nèi)容。

注：與雄性鼠比較*P<0.05。 圖4 1 d內(nèi)不同時間階段多藥耐藥蛋白2(Mrp2)表達的變化

5 展望

肝臟轉(zhuǎn)運體存在明顯的年齡，時辰差異，并在孕期及哺乳期有明顯的變化，提示在不同的發(fā)育階段，老齡化對藥物代謝有很大的影響。這對兒童、老年、孕婦等特殊人群的用藥具有指導意義。以此為切入點，在臨床藥物“增效減毒研究”中具有重要意義。同時藥物轉(zhuǎn)運體是藥物相互作用的重要基礎(chǔ)，國內(nèi)中草藥的使用比較廣泛，也常因中草藥與其它藥物或食物合用等發(fā)生相互作用，從而影響藥效或藥物的毒性作用。因此，在藥物相互作用的研究中， 應該充分考慮肝臟轉(zhuǎn)運體的年齡、性別、時辰等生理因素的影響。

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