pG-miR-7-Sponge轉(zhuǎn)基因小鼠載體的構(gòu)建及鑒定*

李永菊，周 涯，陳 超，朱順飛，胡 燕，秦娜琳，鄭 靜，徐 林

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室暨貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)物理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)是新近報道的miRNA家族成員，定位于第15號染色體，已有的研究顯示其可以廣泛參與調(diào)節(jié)機(jī)體生物學(xué)活動和臨床相關(guān)疾病的發(fā)生過程，但其在機(jī)體整體水平的生物學(xué)功能仍待深入研究闡明[1-2]。我們設(shè)想通過建立miR-7基因敲減小鼠，以研究動物整體的miR-7抑制后，對機(jī)體生物學(xué)功能的潛在影響。本文擬構(gòu)建轉(zhuǎn)基因用的真核表達(dá)載體pG-miR-7-Sponge，并通過轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞鑒定其表達(dá)活性，以驗證該載體用于下一步miR-7基因敲減小鼠建立的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 人源性肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D，由本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶HindⅢ與KpnI和T4 DNA連接酶購自Thermo公司；Stbl3感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室保存；質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司；MTT、DMSO試劑購自Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自Solarbio公司；SYBR Premix Ex Taq real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司；eGFP-C2真核表達(dá)載體和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；分析純級異丙醇、無水乙醇、甲醛、結(jié)晶紫購自重慶川東化工；生化培養(yǎng)基購自蘇州凈化設(shè)備廠；二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo公司；C1000TM Thermal Cycler Real-Time PCR儀、S1000TM Thermal cycler PCR 儀購自Bio-Rad 公司；TD5A-WS臺式低速離心機(jī)購自湘儀儀器公司；IX-51倒置顯微鏡、IX-71倒置熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司；DNA合成由賽業(yè)生物科技有限公司完成和測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 miR-7靶序列的設(shè)計與合成 選取miRBase 數(shù)據(jù)庫上小鼠成熟miR-7a-5p序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則設(shè)計其反義序列，去掉前兩個堿基后在第12-14個堿基處突變?yōu)椴换パa(bǔ)堿基，并將第15個堿基處凸出，將6個拷貝互補(bǔ)靶序列串聯(lián)，每個拷貝之間由“CGCG”連接，該序列兩端加入酶切位點Hind Ⅲ與Kpn I，組成miR-7 Sponge片段(見圖1)。由賽業(yè)生物科技有限公司分別合成正義鏈和反義鏈。

1.2.2 重組質(zhì)粒pG-miR-7-Sp的構(gòu)建與鑒定正義鏈和反義鏈寡核苷酸片段溶解及退火配成雙鏈，其反應(yīng)體系為：200 μmol/L正義鏈寡核苷酸 5 μL，200 μmol/L反義鏈寡核苷酸5 μL，10×寡核苷酸退火緩沖液2 μL，ddH2O 8 μL，總體積20 μL。其反應(yīng)條件為：95℃加熱5 min，放置室溫冷卻10 min，形成雙鏈寡核苷酸。用Hind Ⅲ/ Kpn I雙酶切骨架載體pEGFP-C2、目的基因miR7- Sponge，回收片段，過夜連接。連接反應(yīng)體系：10×T4 Ligase buffer 2 μL，目的基因(Hind Ⅲ+ Kpn I)0.03 pmol，PEGFP(Hind Ⅲ+Kpn I)0.3 pmol，T4 DNA Ligase 1 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：16 ℃過夜。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到Stbl3感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑取克隆搖菌，菌液PCR鑒定陽性克隆(上游引物：5‘-ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’，下游引物：5‘-GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’)，并小量提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ/ Kpn I雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pG-miR-7-Sp，并送上海生物工程有限公司測序，并用Chromas軟件將測序所得到的序列與原設(shè)計寡核苷酸序列進(jìn)行比對分析。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 人肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞，用含10%胎牛血清、1000 μ/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)95D細(xì)胞。在6孔板中培養(yǎng)24 h后細(xì)胞達(dá)到90%～95%融合度時，采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染eGFP-C2-Control和pG-miR-7-Sp。具體操作步驟按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染36h后，用倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 Real-time PCR檢測細(xì)胞中miR-7的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，用TRIzol試劑抽提總RNA。采用miR-7反轉(zhuǎn)錄引物對RNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，利用Real-Time法對樣品中miR-7表達(dá)水平進(jìn)行檢測和比較分析。通過iCycler iQTMReal-Time PCR Detection System 進(jìn)行定量分析。內(nèi)參基因GAPDH逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件按試劑盒說明書操作，Real-Time PCR 反應(yīng)體系及條件：2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 1 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，95 ℃預(yù)變性30s，95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s，40個循環(huán)，獲取熒光信號溫度為84 ℃，以排除引物二聚體的干擾；miR-7逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件按試劑盒說明書操作，Real-Time PCR 反應(yīng)體系及條件：Premix Ex Taq Version2.0 10 μL， ddH2O 8μL，cDNA 1μL，20×TaqMan?Small RNA Assay 1 μL，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 15s, 60 ℃ 60 s，40個循環(huán)，獲取熒光信號溫度為60 ℃。在擴(kuò)增結(jié)束后對每對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的凝膠上進(jìn)行電泳分析確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和靈敏度。miR-7的表達(dá)量以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計算。miR-7反轉(zhuǎn)錄條件：16℃、30 min；42℃、30 min；85℃、30 min；4℃保存。GAPDH反應(yīng)條件 ：42 ℃、1 h；70 ℃、10 min；4 ℃保存。實驗步驟：取EP管，依次加入RNA樣品 7.5 μL、寡核苷酸 1 μL、DEPC處理后的水 3.5 μL，輕輕混勻，置于PCR儀上65 ℃ 5 min，之后立即取出，冰浴2 min以上；再加緩沖液3 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL，混勻，冰浴5 min后，于PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。分別利用探針法和用SYBR-Green熒光染料法于Real-Time PCR儀檢測miR-7和GAPDH的表達(dá)，miR-7上游引物：5’-ACA- -CTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT-3’，下游引物：5’-TGGTGTCGTGGAGGAGT- -C-3’；GAPDH上游引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，下游引物：5’-ATGGGTG- -GAATCATATTGGAA-3’。 miR-7反應(yīng)條件如上所述。GAPDH反應(yīng)條件：95 ℃、10 min， 95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共50個循環(huán)，84℃采集熒光信號，反應(yīng)完成后，繪制溶解曲線。

1.2.5 MTT實驗檢測95D細(xì)胞的增殖 取對數(shù)生長期的95D細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加100 μL，設(shè)立eGFP-Control和pG-miR-7-Sp組，每組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測570 nm處各孔吸光度(OD)值。對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 克隆PCR鑒定 目的基因與載體的連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(見圖2)，Amp抗性篩選培養(yǎng)12 h后隨機(jī)挑取4個克隆，分別培養(yǎng)16 h。經(jīng)菌液PCR和2%瓊脂糖電泳鑒定，可見約440bp大小的目的條帶(見圖3)，提示所挑取的4個克隆均為陽性克隆。

圖2 質(zhì)粒pG-miR-7-Sp示意圖

注：M：100bp DNA Ladder；1-4：分別為1號，2號，3號，4號克隆菌液PCR。 圖3 pG-miR-7-Sp克隆PCR鑒定

2.2 pG-miR-7-Sp質(zhì)粒的酶切與測序鑒定 將陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，抽提的重組質(zhì)粒用Hind Ⅲ和Kpn I雙酶切。2.0%瓊脂糖凝膠電泳后，可觀察到約170 bp大小的目的條帶(見圖4)。將酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果顯示與預(yù)期結(jié)果一致(見圖5)。

注:M：100bp DNA Ladder；1-3：分別為1號，2號，3號克隆質(zhì)粒。 圖4 pG-miR-7-Sp質(zhì)粒KpnI/ HindⅢ雙酶切鑒定

注：1號質(zhì)粒DNA測序結(jié)果。圖5 pG-miR-7-Sp質(zhì)粒測序結(jié)果

2.3 pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染后對95D細(xì)胞中miR-7表達(dá)的影響 pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞，48 h后倒置熒光顯微鏡觀察95D細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示兩組中GFP陽性細(xì)胞比例均約40%(見圖6A)；進(jìn)一步利用 Real-time PCR特異性探針法檢測了各組細(xì)胞中miR-7成熟體的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染組中miR-7成熟體的表達(dá)水平明顯較低(P<0.05，見圖6B)，提示pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染組中miR-7成熟體存在部分降解。

注：A:pG-miR-7-Sp與eGFP-Control轉(zhuǎn)染組分別在白光和熒光鏡下示意圖；B：Real-time PCR檢測miR-7相對表達(dá)量(P<0.05)。 圖6 pG-miR-7-Sp瞬時轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞后GFP(A)與miR-7(B)的表達(dá)

2.4 pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染后對95D細(xì)胞增殖的影響 進(jìn)一步光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，pG-miR-7-Sp瞬時轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞72 h后，細(xì)胞數(shù)明顯多于eGFP-Control對照轉(zhuǎn)染組；MTT實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72h后pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染組OD570值為0.65±0.03，而對照組的OD570值為0.42±0.03。提示，pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)。

注：pG-miR-7-Sp與eGFP-Control轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞在OD570處平均光密度值(P<0.05)。 圖7 瞬時轉(zhuǎn)染pG-miR-7-Sp對95D細(xì)胞增殖的影響

3 討論

miR-7是新近報道的miRNA家族成員之一，大量研究顯示，miR-7可能通過作用于不同的靶標(biāo)分子參與機(jī)體生長發(fā)育或多種疾病的發(fā)生發(fā)展[1,3-5]。如miR-7通過調(diào)節(jié)KFL-4抑制乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移[1]。Yu等[5]還發(fā)現(xiàn)miR-7抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SET8 (SET domain containing 8)，可使乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力下降，對DNA損傷更敏感。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)人肺癌細(xì)胞95D中，miR-7可以顯著抑制胰島素樣生長因子受體1(insulin-like growth factor 1 receptor ，IGF1R)的表達(dá)，從而降低其下游信號分子AKT的磷酸化水平及其體外侵襲能力[6]。此外，miR-7沉默人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR) /磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)通路可以逆轉(zhuǎn)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的惡性表型[7]。另外，最近的研究顯示，miR-7在正常腦組織中特異性高表達(dá)，并且敲除miR-7可以改變斑馬魚的大腦發(fā)育[2]。小鼠是研究人類生命科學(xué)的重要的實驗工具，且miRNA具有種屬保守性。然而，目前尚未有在小鼠整體水平上觀察miR-7功能的研究。

成熟的miRNA長度大約22個堿基，對于這些小分子RNA功能的研究，目前已有一系列功能獲得性(gain-of-function)和功能缺失性(loss-of-function)研究手段。對于功能缺失性研究而言，可以通過轉(zhuǎn)染外源性miRNA反義抑制劑，如，修飾的反義寡核苷酸，能最特異的抑制miRNA；LNA修飾的oligo能與miRNA高親和力結(jié)合，提供強(qiáng)烈的抑制作用。但這些方法存在親和力低、脫靶效應(yīng)或降解等問題，且只能用于瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在小鼠等動物模型中，觀察整體水平上miRNA功能下調(diào)的效應(yīng)，必須穩(wěn)定抑制miRNA。Phillip等人[8]根據(jù)miRNA自身特點和功能特點開發(fā)出的miRNA海綿技術(shù)，實現(xiàn)了對特定miRNA的穩(wěn)定抑制。其原理在于串聯(lián)多個miRNA靶位點(target)的序列，能與miRNA的天然靶標(biāo)競爭結(jié)合miRNA分子，隔離細(xì)胞中有活性的miRNA，從而可以對特定miRNA及含有相同種子序列的miRNA家族進(jìn)行功能缺失性研究[8]。該技術(shù)通過構(gòu)建到含有啟動子的真核表達(dá)載體上，可以在細(xì)胞甚至動物水平上長效抑制miRNA的表達(dá)或功能。尤其是，最新的研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)可能存在一種環(huán)狀大RNA，發(fā)揮類似miRNA海綿的作用[9]。Hansen等人[10]則明確指出miR-7的功能活性可受這種RNA抑制。因此，本課題組擬采用sponge技術(shù)研究miR-7下調(diào)表達(dá)對動物整體水平上生物學(xué)功能的影響。

本實驗首先應(yīng)用“海綿”的構(gòu)建策略，通過設(shè)計與miR-7結(jié)構(gòu)不完全互補(bǔ)的Sponge序列，構(gòu)建到具有強(qiáng)啟動子、及帶有綠色熒光蛋白eGFP標(biāo)志的真核表達(dá)載體pEGFP-C2上，并以菌液PCR、質(zhì)粒酶切、鑒定出陽性質(zhì)粒pG-miR-7-Sp，質(zhì)粒測序分析目的基因的正確性。其次，將成功構(gòu)建的pG-miR-7-Sp載體體外瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到pG-miR-7-Sp載體標(biāo)記蛋白GFP在真核細(xì)胞中的表達(dá)，提示載體啟動子可有效啟動miR-7-Sponge的表達(dá)。重要的是，Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)95D細(xì)胞中miR-7表達(dá)的顯著下降，提示載體表達(dá)的miR-7-Sponge可有效下調(diào)miR-7的表達(dá)。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-7能顯著促進(jìn)人肺源性癌細(xì)胞95C或95D細(xì)胞的體外增殖能力[11-12]。與之一致的是，本實驗中我們最后觀察到pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。可以推測這與真核表達(dá)載體pG-miR-7-Sp能功能性下調(diào)miR-7表達(dá)從而促進(jìn)95D細(xì)胞的增殖有關(guān)。

總之，本實驗成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pG-miR-7-Sp，并可在真核細(xì)胞中能有效表達(dá)miR-7-sponge序列，發(fā)揮基因敲減的作用，這為后續(xù)miR-7基因敲減小鼠模型的建立提供了前期實驗基礎(chǔ)。

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