吳茱萸總堿抑制大鼠左室肥厚及對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路的影響*

張婧怡，林淑嫻，侯化化，李 強(qiáng)，徐 洋，孫安盛

( 遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

心肌肥大是機(jī)體在心衰早期為維持正常心功能而發(fā)生的代償性變化，持續(xù)的心肌肥大可引起心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心功能失代償發(fā)生心力衰竭[1]。心肌肥厚作為心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，積極尋找抑制其發(fā)生發(fā)展的方法和藥物始終是心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)是一種受鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，Ca2+-CaN-NFAT信號(hào)通路是心肌肥大重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，CaN激活其下游 T 細(xì)胞活化核因子3(nuclear factor of activated T cells，NFAT3)，最終導(dǎo)致心肌肥大的發(fā)生和發(fā)展[2]。

我國傳統(tǒng)中藥吳茱萸(Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.)為蕓香科植物吳茱萸近成熟干燥果實(shí)，藥用始于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究其具有廣泛的心血管藥理作用，如對離體豚鼠心臟具有保護(hù)作用[3]、逆轉(zhuǎn)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌重塑[4]、抗血小板并降低ADP誘發(fā)小鼠急性肺血栓的死亡率[5]等。近來我室研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸提取物對右室肥厚具有顯著的抑制作用[6]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠腹主動(dòng)脈縮窄所致心肌肥厚模型，旨在明確吳茱萸總堿對左室心肌肥厚的抑制作用及對鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑 吳茱萸總堿(上海源葉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：201201211 )；L-精氨酸(美國Sigma公司)；戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒(大連寶生物工程公司)；熒光定量PCR混和液(英國ABI公司)；β-actin、心房利鈉因子( atrialnatriuretic factor，ANF)、CaN引物(大連寶生物工程公司)，引物序列(見表1)。

表1熒光定量PCR基因擴(kuò)增引物序列

基因基因庫序號(hào)Forward primer(5'-3')Reverse primer(5'-3')β-actinANFCaNNM031144NM012612NM017041GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTATGACAGGATTGGAGCCCAGAGCTGAGATGCAGGTAAACGTCCT-GAGACTCATCGTACTCCTGCTT-GCTGTCGAGCAGATTTGGCTGT-TATCTTCTGCTCGGATCTTGTTCCTGATG

1.2 儀器 BESN-Ⅱ多通道動(dòng)物無創(chuàng)測壓儀(南京德賽生物技術(shù)有限公司)；BL-420E型四道生理記錄儀(成都泰盟科技有限公司)；Leica光學(xué)顯微鏡(德國Leica Microsystems Ltd)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 動(dòng)物、分組及給藥 雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重 200±10 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝))2012-0005。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，篩選血壓正常大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，吳茱萸總堿低劑量(10 mg/kg)組，中劑量(20 mg/kg)組，高劑量(40 mg/kg)組和L-arg(200 mg/kg)組，每組12只。大鼠造模次日灌胃給藥，假手術(shù)和模型組灌胃等量蒸餾水。

1.4 模型制備 左室肥厚模型參照Grodzicki等提供的方法[7]，大鼠戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，打開腹腔，在雙側(cè)腎動(dòng)脈的上方分離腹主動(dòng)脈，將7號(hào)針頭(去尖)連同腹主動(dòng)脈一同結(jié)扎(假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎)，結(jié)扎后隨即抽出針頭，造成大鼠腹主動(dòng)脈部分狹窄，然后將內(nèi)臟復(fù)位并縫合腹腔，每只大鼠肌內(nèi)注射芐星青霉素10萬單位預(yù)防感染。待大鼠清醒后分籠喂養(yǎng)，手術(shù)后第2天開始灌胃給藥，連續(xù)4周，假手術(shù)組及模型組大鼠灌胃等容量生理鹽水。

1.5 左室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)觀察 最后1次灌胃給藥后，大鼠稱重，戊巴比妥鈉40 mg / kg腹腔注射麻醉并仰位固定，鈍性分離右頸總動(dòng)脈，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈逆行插入聚乙烯心導(dǎo)管至左心室，心導(dǎo)管末端通過壓力換能器，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)記錄儀，測定左室內(nèi)壓峰值(LVSP )、左心室舒張期末壓(LVEDP)、左室等容收縮末期壓力上升最大速率(+dp/dtmax)和左室舒張期壓力下降最大速率(-dp/dtmax)。

1.6 左室肥厚指數(shù)的測定 處死大鼠后快速開胸摘取心臟，剪去心房與右室游離壁，保留左心室與室間隔，用濾紙吸去水分后稱其濕重，即為左室重量(LVW)，左室重量/體重即為左室肥厚指數(shù)(left ventricular hypertrophy index，LVHI)。

1.7 心肌病理學(xué)觀察 大鼠連續(xù)給藥4周處死后，取出大鼠心臟，切取左室部分心肌組織，用10%甲醛液固定，石蠟包埋組織塊后切片(厚度為3 μm)，經(jīng)HE染色后于光鏡下觀察各組大鼠心肌病理學(xué)變化。

1.8 Real-time PCR檢測左心室肌組織中CaN、ANF mRNA的表達(dá) Trizol法提取左室心肌組織中總RNA，純化后計(jì)算RNA含量及OD260/OD280nm比值，進(jìn)行樣品純度鑒定。兩步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為15 μL，第1步95 ℃×10 min；第2步95 ℃ × 15 s，循環(huán)40次，退火溫度60 ℃×1 min。相對定量法分析PCR結(jié)果，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCt 法計(jì)算CaN、ANF基因的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸總堿對腹主動(dòng)脈縮窄大鼠LVHI的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVHI明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，吳茱萸總堿20 mg/kg和40 mg/kg明顯減輕腹主動(dòng)脈縮窄所致LVW的增加(P<0.05)及LVHI的升高(P<0.05)，吳茱萸總堿10 mg/kg對大鼠LVW及LVW無明顯影響(見表2)。

組別Dose(mg/kg)BW(g)LVW(g)LVWI‰ShamModelL-argETAETAETA200102040339.15±17.49283.75±21.28325.14±24.38313.28±29.46327.29±20.19320.35±19.550.54±0.08 0.81±0.11*0.60±0.13#0.83±0.15 0.69±0.06#0.68±0.10#1.59±0.25 2.86±0.19*1.84±0.22#2.69±0.15 2.13±0.18#2.15±0.21#

注：*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group。

2.2 吳茱萸總堿對腹主動(dòng)脈縮窄大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVSP及LVEDP明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，而±dp/dtmax顯著減低(P<0.01)。吳茱萸總堿10 mg/kg和20 mg/kg對LVSP及 LVEDP無明顯影響，但吳茱萸總堿20 mg/kg能顯著升高±dp/dtmax。吳茱萸總堿40 mg/kg可明顯抑制腹主動(dòng)脈縮窄所致LVSP、LVEDP的升高(P<0.05)和±dp/dtmax的降低(P<0.01，見表3)。

組別Dose(mg/kg)LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)Sham127.85±14.2610.28±2.594452.39±205.32-4842.97±248.29Model167.19±18.43*21.44±8.15*1082.92±199.24**-996.18±132.30**L-arg200144.55±10.2113.65±2.77#3687.01±341.91#-3041.78±289.79#ETA10155.16±19.1021.36±5.522447.08±229.46-2389.51±214.67#ETA20153.20±20.3719.42±6.293942.71±387.20##-3345.87±375.85##ETA40137.93±15.86#14.38±3.28#3988.24±196.34##-3698.71±278.28##

注：*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group。

2.3 吳茱萸總堿對腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 心肌組織經(jīng)HE染色，于光鏡下觀察顯示，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，間質(zhì)未見增生和水腫，心肌細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，無異常發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞無炎癥及變性壞死(見圖1A)。模型組可見心肌細(xì)胞明顯增大，細(xì)胞邊緣不清晰，排列紊亂，細(xì)胞核固縮，心肌細(xì)胞束間隙增寬，細(xì)胞間質(zhì)見水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(見圖1B)。與模型組比較，吳茱萸總堿低、中劑量組的心肌纖維排列、增粗及間質(zhì)水腫程度較模型組有所減輕，中劑量組相對比低劑量減輕明顯(見圖1D、E)。吳茱萸總堿高劑量和L-arg組的心肌纖維排列明顯較模型組整齊，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生較輕，間質(zhì)水腫明顯減輕，心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，結(jié)構(gòu)較完整清晰(見圖1C、F)。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：L-arg組(200 mg/kg)；D：吳茱萸總堿10 mg/kg；E：吳茱萸總堿20 mg/kg；F:吳茱萸總堿40 mg/kg。 圖1 吳茱萸總堿預(yù)防給藥對腹主動(dòng)脈縮窄大鼠左室心肌病理學(xué)的影響(HE×400)

2.4 吳茱萸總堿對腹主動(dòng)脈縮窄大鼠左室心肌CaN和ANF mRNA表達(dá)的影響 Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，模型組與假手術(shù)組相比，CaN和ANF mRNA的表達(dá)顯著升高，分別增加1.6倍、10.3倍(P<0.01)。與模型組比較，吳茱萸總堿中、高劑量組明顯下調(diào)CaN和ANF mRNA(P<0.05)的表達(dá)(見圖2)。

注：**P<0.01 vs Sham group;#P<0.05,# #P<0.01 vs Model n=12)。 圖2 吳茱萸總堿對腹主動(dòng)脈縮窄心肌組織中CaN 和 ANFmRNA表達(dá)的影響

3 討論

腹主動(dòng)脈部分縮窄致左心肌肥厚病理模型，可使動(dòng)脈血壓升高，類似臨床高血壓所致壓力負(fù)荷型心肌肥厚。持續(xù)的心肌肥厚可導(dǎo)致心力衰竭、嚴(yán)重心律失?；蜮繹1]，積極尋求防治心肌肥厚的藥物和方法一直是心血管研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。吳茱萸是我國傳統(tǒng)中藥，近年來我室研究證實(shí)吳茱萸生物堿具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖作用[8],吳茱萸提取物對野百合堿所致大鼠右心室肥厚產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)[6]。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察吳茱萸總生物堿對大鼠左室肥厚的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

報(bào)道表明[9]，大鼠腹主動(dòng)脈部分縮窄致左心肌肥厚病理模型，在建立模型后3～4周達(dá)穩(wěn)定高峰。本實(shí)驗(yàn)于建模后第2天開始預(yù)防給藥，連續(xù)4周。4周后與假手術(shù)組比較，模型組LVW和LVHI明顯增加，提示左心室已發(fā)生肥厚性病理變化；模型組LVSP和LVEDP的升高，提示由于心臟壓力負(fù)荷的增加影響左室收縮和舒張功能；±dp/dtmax顯著降低提示左室舒縮性能下降。與此同時(shí)，模型組心肌病理組織學(xué)的變化，與上述心肌組織結(jié)構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)相一致，進(jìn)一步證實(shí)左室造模成功。吳茱萸總堿20 mg/kg和40 mg/kg給藥4周，明顯抑制大鼠腹主動(dòng)脈縮窄所致LVW、LVHI、LVSP和LVEDP的升高和±dp/dtmax的降低，明顯減輕腹主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致的病理學(xué)損傷，表明吳茱萸總堿具有明顯的防治實(shí)驗(yàn)性左室肥厚作用。ANF是胚胎期基因，其重新表達(dá)是心肌肥大的重要標(biāo)志，吳茱萸總堿各給藥組顯著下調(diào)造模引起ANF mRNA的升高，進(jìn)一步佐證吳茱萸總堿防治左室肥厚的作用。

CaN 是介導(dǎo)心肌肥大信號(hào)通路的重要蛋白磷酸酶，胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高活化CaN，進(jìn)而使NFAT3去磷酸化后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，NFAT3與鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子GATA4一起活化核內(nèi)心肌肥大相關(guān)基因如ANF等的表達(dá)，導(dǎo)致心肌肥厚[10]。吳茱萸總堿抑制CaN mRNA的表達(dá)，其抑制作用隨給藥劑量的增加作用增強(qiáng)，呈一定的量效關(guān)系，提示吳茱萸總堿防治大鼠左室肥厚的作用與其抑制CaN參與的心肌肥厚信號(hào)通路有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Berenji K，Drazner M H，Rothermel B A,et al. Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure?[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005，289(1):8-16.

[2] Heineke J，Molkentin J D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(8):589-600.

[3] Hu C P, Xiao L, Deng H W, et al. The cardioprotection of Rutaecarpine is mediated byendogenous calcitonin related-gene peptide through activation of vanilloid receptors in guinea-pig hearts[J]. Planta Med,2002,68(8)：705-709.

[4] Li J Z, Peng J, Xiao L,et al. Reversal of isoprenaline-induced cardiac remodeling by rutaecarpine via stimulation of calcitonin gene-related peptide production.[J]. Can J Physiol Pharmacol，2010,88(10):949-959.

[5] Sheu J R, Hung W C, Wu C H,et al.Antithrombotic effect of Rutaecarpine, an alkaloid isolated from Evodia rutaecarpa, on platelet plug formation in in vivo experiments[J]. Br J Haematol，2000,110(1):110-115.

[6] 高永雙,孫安盛,何娜,等.吳茱萸提取物對大鼠右室肥大細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶- mRNA表達(dá)的抑制作用[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥,2011,22(5):1122-1123.

[7] Grodzicki T ,Messerli F H. The heart in the hypertensive elderly[J] . J Hum Hypertens,1998,12 (9):593-597.

[8] 徐 洋，侯化化，李 強(qiáng)，等.吳茱萸生物堿類抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖作用的比較[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥,2013,24(9):2079-2080.

[9] 楊 濤,張 偉, 張 雷. 大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型的制備及其效果的探討[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2009, 29(1):24-26.

[10] Evans T.Regulation of cardiac gene expression by GATA-4/5/6[J].Trends Cardiovasc Med,1997, 7(3):75-83.