Sp3對(duì)β-catenin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用初探*

黃蘭姍， 黃子凌， 馮振博， 陳 罡， 危丹明

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530021)

特異性蛋白(specificity protein，Sp)家族屬于特殊轉(zhuǎn)錄因子，含有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)域，在羧基端有3個(gè)串聯(lián)的 Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)域，能與GC/GT盒及基本的轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合。轉(zhuǎn)錄因子Sp家族通過調(diào)控下游靶基因，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，涉及幾乎所有細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成等。其中，Sp3在多種組織中廣泛表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用具有特殊性，扮演著轉(zhuǎn)錄激活或者轉(zhuǎn)錄抑制的雙重角色。家族成員在結(jié)構(gòu)與功能上既有相似性也有各自的特性，在Sp家族中，前人的研究多集中于Sp1，而關(guān)于Sp3調(diào)控的下游基因情況的研究報(bào)道甚少。

β-catenin作為連環(huán)蛋白家族中的一員，具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附和Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙重活性，其在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生發(fā)展中的作用倍受關(guān)注，研究多集中于β-catenin蛋白的過表達(dá)、磷酸化、基因突變等[1-2]。部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)Sp家族與Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間存在聯(lián)系，提出β-catenin是Sp調(diào)控的下游基因之一[3]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞株HepG2中運(yùn)用RNAi下調(diào)Sp3后，β-catenin的表達(dá)隨之減少，而且細(xì)胞增殖能力明顯減弱，周期阻滯在G0/G1期[4]；在裸鼠人肝癌種植瘤模型中，Sp3可通過上調(diào)β-catenin及其下游基因MMP-9表達(dá)，同時(shí)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)人肝癌細(xì)胞的侵襲能力[5]；基因芯片結(jié)果亦提示肝癌細(xì)胞株HepG2中Sp3下調(diào)后β-catenin的變化與前期實(shí)驗(yàn)一致[6]。這些均提示在HCC中Sp3與β-catenin存在聯(lián)系，Sp3作為轉(zhuǎn)錄因子可能直接或間接調(diào)控β-catenin的表達(dá)，然而具體聯(lián)系與機(jī)制尚未清楚。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行Sp3與β-catenin啟動(dòng)子結(jié)合的預(yù)測與驗(yàn)證，初步研究轉(zhuǎn)錄因子Sp3對(duì)β-catenin啟動(dòng)子活性的影響，從而探索Sp3對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin的作用機(jī)制，為HCC中Sp3的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及作用原理提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚腎上皮細(xì)胞HEK-293T(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Wisent)，Opti-MEM不完全培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Promega)；β-catenin啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL3-β-catenin)、Sp1表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-Sp1)、Sp3表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-Sp3)和陰性對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1)由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建，PRL-TK質(zhì)粒由Promega提供。

2 主要方法

2.1生物信息學(xué)分析 在NCBI上查找人β-catenin的基因信息，預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)檗D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與上游2 000 bp之間，利用TFSEARCH軟件預(yù)測、分析此啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子Sp3結(jié)合位點(diǎn)的情況截取啟動(dòng)子序列進(jìn)行報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液, 于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的CO2恒溫培養(yǎng)箱。細(xì)胞分3組：實(shí)驗(yàn)組(啟動(dòng)子+轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒)、陰性對(duì)照組(啟動(dòng)子+陰性對(duì)照質(zhì)粒)和mock對(duì)照組。將處于對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞長至70%～80%融合率時(shí)以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染。pGL3-β-catenin分別與pcDNA3.1-Sp1、pcDNA3.1-Sp3、pcDNA3.1(劑量梯度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μg)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，觀察Sp1或Sp3單獨(dú)轉(zhuǎn)染對(duì)β-catenin啟動(dòng)子活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取對(duì)β-catenin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的促進(jìn)作用最強(qiáng)的劑量，后以該總量的pcDNA3.1-Sp1和pcDNA3.1-Sp3，設(shè)計(jì)不同比例，觀察Sp1與Sp3共同轉(zhuǎn)染對(duì)β-catenin啟動(dòng)子活性的影響。以上轉(zhuǎn)染均加入內(nèi)參照pRL-TK質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行螢光素酶活性的檢測。

2.3雙螢光素酶報(bào)告基因檢測 96孔板內(nèi)每孔加入30 μL 1×細(xì)胞裂解液(PLB)，室溫條件下用搖床充分裂解20 min。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，加入100 μL 螢火蟲螢光素酶底物，混合均勻，用單管發(fā)光計(jì)檢測每個(gè)樣本的發(fā)光強(qiáng)度，即為螢火蟲螢光素酶活性(firefly luciferase activity，F(xiàn)LA)。每管再加入100 μL 反應(yīng)終止液(Stop & Glo)，用單管發(fā)光計(jì)檢測每個(gè)樣本的海腎螢光素酶活性(Renillaluciferase activity，RLA)。將FLA除以RLA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于陰性對(duì)照組的相對(duì)螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

結(jié) 果

1 人β-catenin基因啟動(dòng)子內(nèi)Sp結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)β-catenin基因CTNNB1啟動(dòng)子區(qū)域存在3個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)，無Sp3特異性結(jié)合位點(diǎn)。由于Sp3與Sp1結(jié)構(gòu)比較相似，能識(shí)別并以相似的親和力結(jié)合經(jīng)典的Sp1結(jié)合位點(diǎn)，故選擇此3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究。以下為截取的啟動(dòng)子片段(410 bp，劃線部分為3個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn))：(-410 bp)CCGAGCGGTACTCGAAGGCCGGGGCCGA-GATGCCACCTTCCGCAGGCCGCGGGAAAGGCGCGCC-GAGTCCTGCAGCTGCTCTCCCGGTTCGGGAAACGC-GCGGGGCGGGGGCGTCGGGCTTGGGACAGGGGAG-GATACCAGGGCCACCTTCCCCAACCCAGGCCGCG-GGGGCCCGGCCTCCCCGATGCAGACCACAGCGCCC-TCACGGGCTGCCCTCAGGCCGCGCAGCGGGCAGCC-GCCAGCCGTCACCCCGGGGAGCGTCCGTGGGGTGC-CCAGGCACCCCACCCCGGCCCGGGGCGCTCAGACG-GCAGCAGACTGCTGGGCGGCGCGGGGACTACTTTC-CAC-CGCCCCCTCGCGCCCCGCCCCTTGTCCTCGCG-CGGCGGAACGCTCCGCGCTGCGCCGGTGGCGGC(-1 bp)。

2 Sp1或Sp3單獨(dú)轉(zhuǎn)染對(duì)β-catenin啟動(dòng)子活性的影響

2.1Sp1對(duì)β-catenin基因啟動(dòng)子(-410/-1 bp)轉(zhuǎn)錄活性的影響 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，Sp1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Sp1在0.4～0.5 μg時(shí)增強(qiáng)啟動(dòng)子活性，并且在0.4 μg時(shí)能提高啟動(dòng)子的活性2.4倍，但與陰性對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. Effect of Sp1 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp).Mean±SD.n=3.

2.2Sp3對(duì)β-catenin基因啟動(dòng)子(-410/-1 bp)轉(zhuǎn)錄活性的影響 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，Sp3表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Sp3在0.1 μg時(shí)抑制β-catenin啟動(dòng)子活性，而其它劑量均提高啟動(dòng)子活性，尤其在0.4 μg時(shí)能提高啟動(dòng)子的活性5.3倍，與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Effect of Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp).Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pcDNA3.1.

3 Sp1和Sp3共同轉(zhuǎn)染對(duì)β-catenin啟動(dòng)子活性的影響

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，共同轉(zhuǎn)染時(shí)，隨著Sp3/Sp1比例的遞增，即Sp3濃度增加，Sp1濃度降低，β-catenin啟動(dòng)子活性相近，無明顯變化。pcDNA3.1-Sp3轉(zhuǎn)染量為0.4 μg 時(shí)啟動(dòng)子活性最強(qiáng)，與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Effect of co-transfection of Sp1 and Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp). Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pcDNA3.1.

4 比較Sp1、Sp3單獨(dú)轉(zhuǎn)染與共同轉(zhuǎn)染對(duì)β-catenin啟動(dòng)子活性的影響

單獨(dú)轉(zhuǎn)染Sp1 0.3 μg時(shí)，相對(duì)活性值為0.4，單獨(dú)轉(zhuǎn)染Sp3 0.1 μg時(shí)，相對(duì)活性值為0.5，兩者共同轉(zhuǎn)染時(shí)相對(duì)活性值為3.5，見圖4A，此組為共轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)錄活性變化最大者，其它組亦出現(xiàn)共轉(zhuǎn)染后啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，見圖4B、C。

討 論

特殊轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的順式作用元件結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起增強(qiáng)或抑制作用，螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們根據(jù)文獻(xiàn)以及軟件預(yù)測結(jié)果(β-catenin啟動(dòng)子區(qū)域存在3個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn))，選擇-410 bp到-1 bp之間的序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究，通過螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Sp1與Sp3對(duì)β-catenin啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用進(jìn)行了初步的探討。

Sp1或Sp3單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)，Sp3對(duì)β-catenin基因啟動(dòng)子(-410/-1 bp)的轉(zhuǎn)錄活性有明顯的增強(qiáng)作用，而Sp1對(duì)β-catenin基因啟動(dòng)子(-410/-1 bp)的轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)作用較弱，說明在β-catenin基因的表達(dá)過程中，Sp3主要起著促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的作用。Sp3作為特殊轉(zhuǎn)錄因子在β-catenin基因啟動(dòng)子(-410/-1 bp)區(qū)域，與預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，從而解釋前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在HCC組織、細(xì)胞、裸鼠成瘤中Sp3均對(duì)β-catenin的表達(dá)起促進(jìn)作用，可能是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控β-catenin的表達(dá)。

Figure 4. Effect of transfection of Sp1 and Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp). A: transfection of 0.3 μg Sp1 and 0.1 μg Sp3; B: transfection of 0.2 μg Sp1 and 0.2 μg Sp3; C: transfection of 0.1 μg Sp1 and 0.3 μg Sp3.Mean±SD.n=3.

通過不同濃度的Sp1和Sp3共轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步研究Sp1與Sp3之間的相互作用以及對(duì)β-catenin基因啟動(dòng)子活性的影響。發(fā)現(xiàn)隨著Sp3濃度升高，Sp1濃度降低，即Sp3/Sp1比例的遞增，β-catenin基因啟動(dòng)子(-410/-1 bp)的轉(zhuǎn)錄活性無明顯變化，說明Sp3與Sp1表達(dá)比例的變化并未明顯影響靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)，隨著Sp1和Sp3以不同濃度共轉(zhuǎn)染，與Sp1或Sp3單獨(dú)轉(zhuǎn)染相比，共轉(zhuǎn)染后該啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，說明Sp1與Sp3共同存在時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)錄起促進(jìn)作用，兩者可能存在協(xié)同作用。

Sp作為特殊轉(zhuǎn)錄因子含有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)域，在羧基端有3個(gè)串聯(lián)的Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)域，能與GC(GGGGCGGGG)/GT(GGTGTGG)盒及基本的轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合。Sp1、Sp3和Sp4結(jié)構(gòu)比較相似，均含有2個(gè)谷氨酸轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TADs)，三者能識(shí)別并以相似的親和力結(jié)合經(jīng)典的Sp1結(jié)合位點(diǎn)[7-8]。其中，Sp1與Sp3蛋白的DNA結(jié)合區(qū)序列有90%以上的同源性，Sp1和Sp3的結(jié)合序列GC/GT盒常以多拷貝形式分布于基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中，Sp1和Sp3以相似的親和力結(jié)合這些基因調(diào)控區(qū)的GC/GT盒，并且與核內(nèi)其它因子相互作用，發(fā)揮對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)或抑制作用[9-10]。

與本研究結(jié)果不同的是，在大多數(shù)報(bào)道中，Sp3表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄抑制作用，Sp1與Sp3的相對(duì)表達(dá)水平影響基因的轉(zhuǎn)錄：Sp3與Sp1比例的下降能增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，比例升高則抑制啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。如Wong等[11]在結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)，Sp1增強(qiáng)MAOB基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，Sp3輕微抑制其活性，共轉(zhuǎn)染Sp1和Sp3后，下調(diào)Sp3/Sp1的比例則提高了MAOB基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。Schwarzmayr等[12]在骨肉瘤U2-OS細(xì)胞進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)，Sp1能顯著增強(qiáng)EAPP基因啟動(dòng)子活性，Sp3則表現(xiàn)出抑制作用，上調(diào)Sp3/Sp1的比例則抑制EAPP基因啟動(dòng)子活性。吳軍峰等[13]亦有相似報(bào)道。

在不同研究中Sp3表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄活性，我們認(rèn)為可能與以下因素有關(guān)：(1)不同的Sp3蛋白亞型，主導(dǎo)的功能不同：較短的Sp3亞型發(fā)揮抑制作用，而全長的Sp3亞型則發(fā)揮激活作用[14]；(2)識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和排布影響Sp3的調(diào)控作用：當(dāng)啟動(dòng)子包含1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)時(shí)Sp3可能作為激活因子，如果啟動(dòng)子包含多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)時(shí)Sp3則發(fā)揮抑制作用[15]；(3)Sp1和Sp3的相對(duì)表達(dá)水平影響Sp3對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控，當(dāng)Sp1存在時(shí)Sp3表現(xiàn)出抑制作用[16]；(4)其它蛋白質(zhì)因子對(duì)Sp3活性的影響，如其它蛋白質(zhì)因子與Sp3的結(jié)合能影響其調(diào)控轉(zhuǎn)錄[9]；(5)翻譯后修飾對(duì)Sp3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的影響，如Sp3的乙?；?、蘇素化等[17]；(6)染色質(zhì)的修飾和結(jié)構(gòu)對(duì)Sp3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的影響[18]等。

目前關(guān)于β-catenin表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，β-catenin順式作用元件和相關(guān)的反式作用因子的報(bào)道甚少，本課題組率先對(duì)β-catenin啟動(dòng)子區(qū)域的Sp結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。Nollet等[19]通過基因擴(kuò)增測序，提出β-catenin基因啟動(dòng)子區(qū)包括轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、Sp1、AP2和EGR1的結(jié)合位點(diǎn)。張菊等[20]采用PCR方法首次克隆CTNNB1基因5’上游1.8 kb(-1 650/+150)啟動(dòng)子，并預(yù)測該區(qū)域富含GC盒以及多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件如：NKX HP/N KX31、P53F、PERO、RREB和E2FF等。本研究通過螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于β-catenin基因啟動(dòng)子(-410/-1 bp)，轉(zhuǎn)錄因子Sp3起著轉(zhuǎn)錄激活的作用，Sp1則表現(xiàn)出較弱的轉(zhuǎn)錄激活作用，Sp3/Sp1比例的遞增對(duì)β-catenin基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性無明顯影響，Sp1、Sp3共同作用則能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。由此我們推測，Sp3作為轉(zhuǎn)錄因子可能直接或間接調(diào)控β-catenin的正向表達(dá)，造成β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚、核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而過度激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的下游靶基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移侵襲等。

綜上所述，Sp3可能通過β-catenin影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而參與HCC的發(fā)生發(fā)展。而雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果尚不能確定在HCC細(xì)胞內(nèi)Sp3直接與β-catenin啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，仍需更深入的研究去探索體內(nèi)細(xì)胞是否存在此調(diào)控關(guān)系。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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