用阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征動(dòng)物模型研究vaspin與胰島素信號(hào)通路的相關(guān)性*

莊向華， 倪一虹， 劉元濤， 孫愛麗， 孫福敦， 姜冬青， 李曉博， 陳詩(shī)鴻

(山東大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濟(jì)南 250033)

阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)是一種發(fā)病率較高，有潛在危險(xiǎn)性的慢性疾病，可引起心、腦、血管多組織多器官的損害，其確切的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。肥胖、機(jī)體脂肪含量增多在OSAHS的發(fā)生中具有重要的作用。脂肪組織可分泌許多脂肪因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、脂聯(lián)素(adiponectin, APN)、瘦素(leptin)、vaspin等，一方面以自分泌、旁分泌的形式調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的生理功能，另一方面通過血循環(huán)作用于遠(yuǎn)處組織。Vaspin是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，可參與糖脂代謝。Zvonic等[1]研究人脂肪組織vaspin mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)與肥胖、胰島素抵抗和糖代謝的參數(shù)相關(guān)。目前關(guān)于vaspin的基礎(chǔ)和臨床研究剛剛開始，脂肪因子vaspin功能及表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSAHS患者體內(nèi)vaspin參與了糖脂代謝紊亂，并推測(cè)OSAHS并發(fā)胰島素抵抗和高vaspin水平低有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在建立理想的模擬睡眠呼吸暫停綜合征的慢性間歇性缺氧大鼠模型，從mRNA和蛋白水平分析OSAHS中脂肪因子vaspin與胰島素信號(hào)途徑中關(guān)鍵因子的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠22只，購(gòu)于山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重160～200 g，標(biāo)準(zhǔn)飼料、專人單籠飼養(yǎng)，明暗周期為12 h，自由取食和飲水，室溫18～25 ℃，相對(duì)濕度55%～80%。實(shí)驗(yàn)期間，不控制飲水，墊料消毒，每日更換。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照(control)組(n=12)，給予大鼠食用的標(biāo)準(zhǔn)飼料在常規(guī)環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)；慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)組(n=10)，參照王璋等[2]的方法加以改進(jìn)，每天9:00～17:00將大鼠放入間歇性低氧艙內(nèi)，關(guān)閉艙門，向間歇性低氧艙循環(huán)充入氮?dú)夂蛪嚎s空氣，每一循環(huán)為60 s，即30 s充入氮?dú)?，隨之30 s充入壓縮空氣，由測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)間歇性低氧艙中的氧濃度，調(diào)節(jié)氣體流量，使每一循環(huán)間歇性低氧艙內(nèi)的最低氧濃度達(dá)到4%～6%，然后再逐漸恢復(fù)至21%。測(cè)氧儀檢測(cè)結(jié)果提示：艙內(nèi)氣體氧濃度(fraction of inspired oxygen，F(xiàn)iO2)在低氧氣體輸入后逐漸減低至7%～8%，在此水平持續(xù)約5～7 s，然后隨著空氣的輸入FiO2逐漸升至20%～21%，此實(shí)驗(yàn)共持續(xù)8周。安靜環(huán)境下，將大鼠放入鼠袋內(nèi)，待其安靜后應(yīng)用尾套管法檢測(cè)大鼠尾動(dòng)脈壓。每次測(cè)量3次，取3次數(shù)值的平均值。8周后2組大鼠空腹12 h，頸動(dòng)脈取血測(cè)定血糖，并分離血清于 -70 ℃保存用于生化指標(biāo)檢測(cè)；取血結(jié)束后處死動(dòng)物，留取脂肪標(biāo)本 -70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)脈血?dú)鈾z測(cè) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選取4只大鼠間歇低氧條件下的動(dòng)脈血氧飽和度變化情況。方法為：先將大鼠用苯巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，放入間歇缺氧艙中，進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，將其腹部朝上固定于解剖臺(tái)上，局部消毒后，切開腹部皮膚，2只在缺氧艙內(nèi)氧濃度降至最低點(diǎn)30 s內(nèi)直視下抽取腹主動(dòng)脈血，應(yīng)用動(dòng)脈血樣行血?dú)夥治?，另?只大鼠在循環(huán)充氣過程中當(dāng)缺氧艙內(nèi)氧濃度恢復(fù)至21%時(shí)同樣方法抽取。

2.2血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 大鼠尾靜脈取血，離心后分離血清，將血清樣品放入低溫冰箱中保存，供以后測(cè)定時(shí)使用。血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法，使用強(qiáng)生穩(wěn)豪型One Touch Ultra Easy 血糖儀測(cè)定(Life Scan)。血清總膽固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平應(yīng)用Beckman DXC 800型生化自動(dòng)分析儀測(cè)定。血清胰島素采用放射免疫法測(cè)定(Linco Research)。用內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)：HOMA-IR =空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG； mmol/L)×空腹胰島素(fasting insulin, FINS; mU/L)/22.5。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清vaspin和脂聯(lián)素(武漢 USCN Science生物有限公司)濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.3Real-time PCR 方法檢測(cè)mRNA表達(dá) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)vaspin、Akt 和GAPDH mRNA的表達(dá)。采用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA，取100 mg 左右的脂肪組織，按照說明書操作，RNA于紫外分光光度計(jì)定量后于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩２捎梅崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒合成cDNA，按照說明書操作。PCR反應(yīng)條件：93 ℃ 3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。于每個(gè)循環(huán)延伸反應(yīng)最后時(shí)刻收集熒光信號(hào)；熔解曲線設(shè)置：95 ℃ 1 s，60 ℃ 2 min，以0.2 ℃/s的升溫速度升溫至95 ℃，升溫時(shí)連續(xù)收集熒光信號(hào)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI Prism 7500 Detection System) 檢測(cè)。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物序列如下： vaspin的上游引物為5’-AGTCGGAAAACCCACAACAG-3’，下游引物為 5’-CGGTCTTGCCTTCCTCTATG-3’； Akt上游引物為5’-ACCTCTGAGACCGACACCAG-3’，下游引物為5’-AGGAGAACTGGGGAAAGTGC-3’； GAPDH的上游引物為5’-GCTGATGCCCCCATGTTTG-3’，下游引物為5’-GGGTGGTGGACCTCATGGC-3’。

2.4Western blotting蛋白水平表達(dá) 在冰凍緩沖液中研碎脂肪組織(50 mg)，提取蛋白，在4 ℃、 20 000 r/min條件下離心20 min，小心吸取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，確定上樣量。取50 mg蛋白在95 ℃溫度下變性5 min，SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。封閉1 h，應(yīng)用vaspin、 Akt 和p-Akt抗體(Santa Cruz)孵育，洗膜后加5 μL II抗(1∶2 000)與10 mL封閉緩沖液中充分混勻，加入PVDF膜。取出PVDF膜放入發(fā)光液，反復(fù)澆PVDF膜約5 min，取出PVDF膜，吸干過多液體，保鮮膜包裹PVDF膜，置于曝光盒中，顯影、定影。GAPDH作為內(nèi)參照，用多功能數(shù)字圖像分析儀Kodak Digital Science ID軟件進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，偏態(tài)分布變量經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行比較，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物體重、血壓變化

實(shí)驗(yàn)前后2組大鼠之間體重?zé)o顯著差異，實(shí)驗(yàn)前2組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)后CIH組大鼠收縮壓明顯高于正常對(duì)照組。

2 血壓和血氧飽和度檢測(cè)

隨機(jī)選擇4只大鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示缺氧最低點(diǎn)時(shí)大鼠尾動(dòng)脈血壓23.4 mmHg～32.8 mmHg，最低血氧飽和度范圍為40.8%～65.9%，恢復(fù)艙內(nèi)氧濃度至2l%后，測(cè)得尾動(dòng)脈血壓為74.5 mmHg～102.9 mmHg，動(dòng)脈血氧飽和度為93.8%～98.9%，符合人類阻塞型睡眠呼吸暫停綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)。

3 血清學(xué)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后抽血測(cè)FPG、FINS、TG、TC、APN和vaspin濃度。結(jié)果提示：與control組相比，CIH組大鼠的FPG、FINS、TG、TC、vaspin和HOMA-IR(P<0.01或P<0.05)水平顯著升高，APN水平顯著降低(P<0.05)，2組大鼠體重未見顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 2組大鼠體重及各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

4 相關(guān)分析

血清vaspin與血糖、脂代謝和胰島素抵抗的相關(guān)分析，Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示vaspin濃度與FINS、TG和HOMA-IR顯著相關(guān)(P<0.05)，與FPG和TC無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)。

5 2組大鼠vaspin和Akt mRNA表達(dá)水平比較

Real-time PCR方法檢測(cè)大鼠脂肪組織vaspin和Akt的mRNA水平。與control組相比，CIH組大鼠脂肪組織vaspin的mRNA表達(dá)水平增加10%，Akt 的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯改變，見圖1。

6 2組大鼠脂肪組織vaspin和Akt蛋白表達(dá)的比較

CIH組大鼠腹部脂肪組織中vaspin蛋白水平較正常對(duì)照組大鼠顯著增加。2組大鼠脂肪組織中Akt的蛋白水平無(wú)明顯區(qū)別，而CIH組大鼠的p-Akt蛋白水平較control組明顯降低，見圖2。

Figure 2. Protein levels of vaspin, Akt and p-Akt in adipose tissue.Mean±SD.*P<0.05 vs control group.

討 論

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征是一種近20年來(lái)才被人們認(rèn)識(shí)并引起重視的具有潛在危險(xiǎn)的常見疾病[3]，其中最常見的是OSAHS。OSAHS主要表現(xiàn)為睡眠時(shí)反復(fù)上氣道塌陷導(dǎo)致打鼾、頻繁呼吸暫停及呼吸淺慢、低氧血癥、睡眠中斷，呼吸睡眠節(jié)律紊亂，反復(fù)出現(xiàn)呼吸暫停及覺醒；由于缺乏足夠的肺泡通氣導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的急性低氧血癥、高碳酸血癥。在睡眠時(shí)可發(fā)生急性呼吸衰碣，長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作也可導(dǎo)致慢性呼吸衰竭、肺動(dòng)脈高壓、肺心病、冠心病、腦動(dòng)脈硬化癥等疾病，這些疾病之間通常存在一個(gè)共同的病理生理狀態(tài)，即胰島素抵抗(insulin resistance, IR)。

本研究的動(dòng)物造模實(shí)驗(yàn)中提示大鼠存在代謝紊亂，對(duì)比2組大鼠，CIH組大鼠的血壓、空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯、膽固醇、HOMA-IR和vaspin水平顯著高于正常對(duì)照組，而脂聯(lián)素水平顯著低于正常對(duì)照組；顯示CIH大鼠出現(xiàn)了機(jī)體代謝紊亂。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道模擬OSAHS患者低氧模式的慢性間歇低氧可導(dǎo)致大鼠持續(xù)性血壓升高，其機(jī)制可能有：(1)慢性間歇低氧可能通過激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)而導(dǎo)致高血壓發(fā)生；(2)機(jī)體對(duì)乙酰膽堿和異丙腎上腺素舒血管反應(yīng)降低；(3)慢性低氧導(dǎo)致腎素-血管緊張素-醛固酮活性增加等。我們用大鼠尾壓測(cè)量?jī)x測(cè)量血壓，結(jié)果表明間歇低氧組大鼠的尾動(dòng)脈血壓明顯高于正常對(duì)照組，說明慢性間歇低氧導(dǎo)致了大鼠持續(xù)性血壓升高。人群的研究顯示OSAHS患者中糖耐量異常發(fā)生幾率顯著高于正常對(duì)照組，普通人群中糖尿病的發(fā)病率約5%，而在50～59歲2型糖尿病中OSAHS發(fā)病率可高達(dá)17%。OSAHS患者存在胰島素的反應(yīng)性下降和胰島素抵抗，最終導(dǎo)致高血糖。OSAHS動(dòng)物模型亦發(fā)現(xiàn)2組動(dòng)物的胰島素抵抗指數(shù)存在顯著差別，提示OSAHS與胰島素抵抗顯著相關(guān)。

脂肪細(xì)胞因子在OSHAS致胰島素抵抗中亦起到重要的作用。研究顯示脂肪因子參與了胰島素敏感性、脂質(zhì)代謝、炎癥和免疫應(yīng)答等過程，與肥胖、糖脂代謝異常等相關(guān)性疾病密切相關(guān)[6]。脂聯(lián)素是專一由脂肪細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的明確具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、增加胰島素敏感性及改善胰島素抵抗等多種生物學(xué)效應(yīng)的脂肪因子[4]。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)OSAHS組血清脂聯(lián)素水平較對(duì)照組明顯下降，在控制BMI、腰圍、頸圍和胰島素抵抗指數(shù)這些因素后，血清脂聯(lián)素水平與AHI呈明顯負(fù)相關(guān)，與動(dòng)脈血氧飽和度呈正相關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，CIH組大鼠脂聯(lián)素水平顯著降低，與既往研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了脂聯(lián)素在OSAHS患者中的意義。

Vaspin屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，是由約395個(gè)氨基酸組成的具有疏水性N端的單肽。Vaspin與胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性目前亦結(jié)論不一。在脂肪組織的體外培養(yǎng)研究中，給予vaspin后可逆轉(zhuǎn)肥胖小鼠體內(nèi)與胰島素抵抗相關(guān)基因的表達(dá)，如瘦素、抵抗素、TNF-α和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4等?；蛐酒瑱z測(cè)顯示，vaspin治療肥胖小鼠可逆轉(zhuǎn)50%的高脂肪或高糖飲食所誘導(dǎo)的基因表達(dá)，提示vaspin可通過調(diào)控脂肪組織中與胰島素抵抗相關(guān)基因的表達(dá)而改善胰島素敏感性。也有研究未發(fā)現(xiàn)重組人vaspin對(duì)培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細(xì)胞具有葡萄糖代謝調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用以及對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響作用，推測(cè)其原因可能是由于肥胖狀態(tài)下，vaspin發(fā)揮胰島素增敏作用依賴于其靶向絲氨酸蛋白酶的存在；但該絲氨酸蛋白酶存在于白色脂肪組織中，不存在于培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中。本研究結(jié)果顯示CIH組大鼠血清vaspin濃度增加，且其血清濃度與胰島素、HOMA-IR、SaO2水平相關(guān)，提示其與胰島素抵抗是相關(guān)的。而取脂肪組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果提示vaspin mRNA表達(dá)水平在CIH大鼠的脂肪組織中較正常對(duì)照組大鼠明顯增加，應(yīng)用Western blotting檢查，結(jié)果提示vaspin蛋白在脂肪組織表達(dá)亦呈升高趨勢(shì)。

磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)家族是生長(zhǎng)因子超家族信號(hào)傳導(dǎo)過程中的重要分子，是一類特異性地催化磷酯酰肌醇3位羥基磷酸化，產(chǎn)生具有第二信使作用的肌醇脂物質(zhì)的激酶。Akt通路主要負(fù)責(zé)由PI3K始動(dòng)的生物信息的傳導(dǎo), Akt處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，它在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路是胰島素的主要信號(hào)通路，我們選擇在PI3K/Akt信號(hào)通路中最重要的p-Akt和Akt作用研究靶點(diǎn)，探討在OSAHS中胰島素抵抗的特點(diǎn)。應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)2組動(dòng)物脂肪組織蛋白表達(dá)水平，提示在2組Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，而p-Akt蛋白表達(dá)有顯著差異，實(shí)驗(yàn)組的CIH大鼠p-Akt蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著下降，進(jìn)一步支持我們?cè)炷５腃IH大鼠存在顯著的胰島素抵抗，同時(shí)提示vaspin蛋白在胰島素信號(hào)途徑中可能存在潛在作用。

綜上所述，通過間歇性低氧制造的CIH大鼠中，存在典型的胰島素抵抗，同時(shí)2組動(dòng)物中vaspin濃度以及蛋白表達(dá)存在差異。若今后能夠進(jìn)一步明確vaspin的在OSAHS發(fā)病機(jī)制中的確切作用將有助于我們對(duì)于OSAHS的治療。另一方面，雖然基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)vaspin具有胰島素增敏作用，但臨床研究中vaspin與胰島素敏感性之間的關(guān)系尚存在分歧，今后尚需大樣本的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Zvonic S, Lefevre M, Kilroy G, et al. Secretome of primary cultures of human adipose-derived stem cells: modulation of serpins by adipogenesis[J]. Mol Cell Proteomics, 2007, 6(1):18-28.

[2] 王 璋，司良毅，廖友斌. 大鼠睡眠呼吸暫停綜合征動(dòng)物模型的建立[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2006, 14(1):40-43.

[3] 劉輝國(guó), 林 玫, 管 頻, 等. 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征外周血IGF-2 及其mRNA水平變化的初步研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2007,23(9): 1782-1785.

[4] 孫升云，黃 進(jìn)，孟民杰，等. 山荷減肥顆粒對(duì)飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2009,25(6):1170-1174.

[5] Zhang XL, Yin KS, Wang H, et al. Serum adiponectin levels in adult male patients with obstructive sleep apnea hypopnea syndrome[J]. Respiration, 2006, 73(1):73-77.

[6] Carneiro G, Togeiro SM, Ribeiro-Filho FF, et al. Continuous positive airway pressure therapy improves hypoadiponectinemia in severe obese men with obstructive sleep apnea without changes in insulin resistance[J]. Metab Syndr Relat Disord, 2009, 7(6):537-542.