• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    AT1受體自身抗體對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及JNK表達(dá)的作用*

    2014-08-13 12:42:50徐春艷趙林雙
    中國(guó)病理生理雜志 2014年11期
    關(guān)鍵詞:高糖亞組腎臟

    徐春艷, 趙林雙

    (廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北 武漢 430070)

    血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody,AT1-AA)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,是針對(duì)AT1受體(AT1receptor,AT1R)的特異性抗體,具有類似血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)的生物學(xué)效應(yīng)。自AT1-AA首次在先兆子癇患者體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[1]以來(lái),又先后證實(shí)其與難治性高血壓患者蛋白尿發(fā)生率有關(guān)[2],并參與了原發(fā)性腎小球疾病過程[3],成為獨(dú)立于高血壓之外的致腎臟損害的因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)患者血清AT1-AA陽(yáng)性率明顯高于糖尿病患者和正常對(duì)照者[4],提示AT1-AA與DN發(fā)病過程有關(guān),但其致DN腎臟損害的具體機(jī)制尚不清楚。

    研究顯示,DN時(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的活化可引起腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS),并可通過JNK凋亡途徑誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡[5-6]。AT1R是RAS的關(guān)鍵因子,也是AT1-AA發(fā)揮效應(yīng)的特異性受體,但其能否介導(dǎo)AT1-AA而致DN腎臟ERS反應(yīng),目前未見報(bào)道。因此,我們通過本研究探討DN大鼠血清AT1-AA與腎臟ERS及其相關(guān)的JNK凋亡信號(hào)通路的關(guān)系,以進(jìn)一步了解AT1-AA致DN腎臟細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    36只4周齡雄性SD大鼠,購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)為42000500001559。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫20~24 ℃,相對(duì)濕度40%~60%,自由攝食飲水,12 h交替照明。

    2 主要試劑和儀器

    鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(Sigma);TUNEL試劑盒(Promega);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)抗體(Bioworld);磷酸化c-Jun N末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)抗體(Santa Cruz);β-actin抗體、羊抗小鼠Ⅱ抗、羊抗兔Ⅱ抗和兔抗小鼠Ⅱ抗(武漢博士德生物工程有限公司)。全自動(dòng)生化儀(BECKMAN COULTER UniCelDxC 800);HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供)。

    3 主要方法

    3.1模型大鼠的建立 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)選取6只為正常對(duì)照(NC),選取30只進(jìn)行造模處理。NC組大鼠以普通飼料食喂養(yǎng),造模大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。造模大鼠于高糖高脂喂養(yǎng)4周時(shí)腹腔注射1%的STZ溶液(35 mg/kg),NC組注射等量的檸檬酸緩沖液。72 h后測(cè)尾靜脈血糖,隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L認(rèn)為糖尿病大鼠模型建立成功,繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng),每周復(fù)測(cè)血糖,持續(xù)觀察12周至其自然進(jìn)展至DN階段[7]。 將模型建立成功大鼠統(tǒng)一歸為模型組(model組)。

    3.2血清AT1-AA的測(cè)定及分組 大鼠稱重,給予10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔麻醉,腔靜脈取血,收集血清,分裝后-20 ℃保存。AT1R抗原肽片段的氨基酸序列為5’-IHRNVFFIENTTNITVCAFHYESQNSTL-3'(由華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心血管研究室人工合成并饋贈(zèng))。ELISA法測(cè)定血清AT1-AA 的A值[8],根據(jù)AT1-AA測(cè)定結(jié)果,隨機(jī)選擇DN大鼠納入DN組,并分AT1-AA陽(yáng)性DN(AT1-AA positive DN,APD)和AT1-AA陰性DN(AT1-AA negative DN,AND)亞組。

    3.3血、尿生化指標(biāo)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d,用代謝籠收集大鼠24 h尿液并記錄尿量,4 ℃保存。應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)尿肌酐(urine creatinine,UCr)和尿微量白表達(dá)(urine microalbumin,UMA);同時(shí)檢測(cè)血糖(blood glucose,BG)、血肌酐(serum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),計(jì)算肌酐清除率(creatinine clearance rate,CCr)。

    3.4TUNEL染色測(cè)定腎臟細(xì)胞凋亡 制備腎組織石蠟切片,常規(guī)脫水,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TUNEL染色,DAB顯色。光鏡下觀察,凋亡細(xì)胞呈棕褐色。應(yīng)用MIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞,計(jì)算凋亡率。

    3.5Western blotting技術(shù)測(cè)定腎組織GRP78和p-JNK蛋白表達(dá) 提取大鼠腎組織總蛋白,BCA法測(cè)定總蛋白濃度。10%的SDS-PAGE分離蛋白,PVDF膜印跡,5%脫脂奶粉封閉,GRP78抗體(1∶600)、p-JNK抗體(1∶3 000)或β-actin抗體(1∶400)浸泡,4 ℃過夜,分別加入辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶50 000)孵育2 h,滴加ECL底物液,暗視中X光片壓片、顯影、定影,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析膠片灰度值比值,進(jìn)行蛋白的定量分析。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示,采用2檢驗(yàn);計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 Model組和NC組大鼠一般情況比較

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),造模大鼠5只死亡,1只未成模,成模率為96.7%,死亡率為16.7%。與NC組大鼠比較,model組大鼠體重明顯減輕,而血糖及腎臟肥大指數(shù)均明顯升高,見表1。

    表1 NC組和model組大鼠血糖、體重和腎肥大指數(shù)的比較

    2 大鼠血清AT1-AA陽(yáng)性率結(jié)果及亞組分組

    Model組大鼠血清AT1-AA陽(yáng)性率為62.5%,較NC組16.7%明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)AT1-AA結(jié)果,在24只Model組大鼠中隨機(jī)選取8只AT1-AA陽(yáng)性和4只AT1-AA陰性大鼠納入DN組,其中AT1-AA陽(yáng)性DN為APD亞組,AT1-AA陰性DN為AND亞組。

    3 APD和AND亞組大鼠腎功能生化指標(biāo)結(jié)果比較

    與NC組比較,APD亞組大鼠的BUN和24 h UMA水平明顯升高(均P<0.01),CCr顯著降低(P<0.05);與APD亞組大鼠比較,前述各生化指標(biāo)在AND亞組大鼠中變化程度相對(duì)較輕,見表2。

    表2 各亞組大鼠腎功能生化指標(biāo)結(jié)果比較

    4 AT1-AA對(duì)DN組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響

    DN組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率(16.65±5.01)較NC組大鼠(0.38±0.24)顯著增高(P<0.01),其中腎小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞均有凋亡,但以腎小管上皮細(xì)胞凋亡為主。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),APD亞組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率(20.05±1.71)明顯高于AND亞組(13.24±4.93)(P<0.01),見圖1。

    Figure 1. Apoptosis of renal cells in all groups under optical microscope by TUNEL staining assay (×400). Apoptotic cells were brown as indicated by the arrows. Mean±SD. n=4~12. ** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs AND sub-group.

    5 DN組和NC組大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白表達(dá)比較

    Western blotting結(jié)果顯示,DN組大鼠腎組織GRP78和p-JNK的表達(dá)分別為0.750±0.030和0.603±0.048,而NC組大鼠為0.334±0.001和0.209±0.003,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。

    Figure 2. The protein levels of GRP78 and p-JNK in DN group and NC group. Mean±SD. n=6~12.**P<0.01 vs NC group.

    6 APD和AND亞組大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白表達(dá)比較

    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),APD亞組GRP78的表達(dá)(0.774±0.026)較AND亞組(0.728±0.003)明顯升高(P<0.05);且APD亞組p-JNK的表達(dá)(0.643±0.026)亦高于AND亞組(0.562±0.018)(P<0.01),見圖3。

    Figure 3. The protein levels of GRP78 and p-JNK in APD and AND sub-groups. Mean±SD. n=4~8. #P<0.05, ##P<0.01 vs AND sub-group.

    討 論

    DN是糖尿病危險(xiǎn)而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),已成為人類健康的重要威脅。但因DN是多因素綜合作用的結(jié)果,發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今仍未完全明確。本課題組前期大量臨床研究發(fā)現(xiàn),G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體相關(guān)的自身免疫反應(yīng)參與了DN的發(fā)病過程,并與DN患者蛋白尿水平關(guān)系密切[9],因而認(rèn)為自身免疫機(jī)制在DN病程中也起了重要作用。其中,AT1-AA通過與RAS的關(guān)鍵因子AT1R胞外第二環(huán)肽上的氨基酸序列特異性結(jié)合而發(fā)揮AngⅡ樣激動(dòng)效應(yīng),且該激動(dòng)效應(yīng)不隨時(shí)間而脫敏。目前普遍認(rèn)為,各種組織損傷和生理紊亂所致隱蔽抗原暴露,機(jī)體自身免疫應(yīng)答反應(yīng)激活,均可使機(jī)體AT1-AA產(chǎn)生增多[10]。而在DN狀態(tài)下,高糖毒性和RAS活化等因素可能通過循環(huán)或局部組織AngⅡ濃度升高或胞內(nèi)信號(hào)通路變化而致AT1R的構(gòu)象和密度改變,進(jìn)而引起血清AT1-AA生成增多,但AT1-AA與DN腎臟結(jié)構(gòu)損害的關(guān)系及作用機(jī)制,目前未見報(bào)道。

    腎臟細(xì)胞凋亡在DN腎功能惡化過程中起重要作用,是DN腎損害的重要機(jī)制。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射,然后繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng),任糖尿病大鼠自然進(jìn)展為DN階段而得到的DN模型,是目前公認(rèn)的接近人類2型DN自然病程和代謝特點(diǎn)的大鼠模型。實(shí)驗(yàn)中,TUNEL染色檢測(cè)DN大鼠腎臟細(xì)胞凋亡并定位發(fā)現(xiàn),AT1-AA陽(yáng)性DN大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率明顯高于AT1-AA陰性DN大鼠,表明AT1-AA在DN大鼠腎臟細(xì)胞凋亡過程中起到一定作用。大量腎臟細(xì)胞凋亡可直接導(dǎo)致尿蛋白水平顯著增加,腎功能明顯降低,這是本研究中AT1-AA陽(yáng)性和陰性DN大鼠腎功能生化指標(biāo)差異顯著的原因,但AT1-AA致腎臟細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、加工和Ca2+儲(chǔ)存及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要場(chǎng)所,可通過ERS對(duì)各種因素所致的應(yīng)激反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用[11]。早期ERS能激活未折疊蛋白反應(yīng),減少蛋白質(zhì)合成,增加蛋白質(zhì)折/疊降解來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,在該反應(yīng)過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶GRP78起著主要的調(diào)控作用而成為ERS的標(biāo)志性蛋白[12]。然而過度ERS會(huì)通過其相關(guān)的3條凋亡途徑:CHOP/GADD153基因激活轉(zhuǎn)錄,JNK磷酸化和caspase-12活化,促進(jìn)應(yīng)激受損細(xì)胞的凋亡[13]。其中,JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員,可在各種應(yīng)激刺激(如高糖,氧化應(yīng)激,G蛋白偶聯(lián)受體激活等)作用下磷酸化而活化。p-JNK主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的活性,上調(diào)促凋亡蛋白Bim、Bax等的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡[14]。

    研究發(fā)現(xiàn),DN大鼠腎臟ERS反應(yīng)與腎小管細(xì)胞的凋亡有關(guān)[15],且高糖可激活足細(xì)胞內(nèi)ERS相關(guān)的多條凋亡途徑,引起足細(xì)胞的損傷和凋亡[16],均表明過度ERS在DN腎臟細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。研究證實(shí),AngⅡ能上調(diào)心肌細(xì)胞GRP78的表達(dá),并介導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡,而AT1R特異性拮抗劑可降低DN大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白的表達(dá),抑制JNK途徑介導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡[6]。已知AT1-AA與AngⅡ均可通過AT1R而激活下游信號(hào)分子,并能經(jīng)相似的信號(hào)通路發(fā)揮效應(yīng),故假設(shè)DN發(fā)電時(shí),血清中持續(xù)存在的高滴度AT1-AA通過AT1R激活腎臟ERS反應(yīng),并活化JNK凋亡信號(hào)通路,使p-JNK凋亡蛋白的水平增高,促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡。但關(guān)于血清AT1-AA與腎臟ERS反應(yīng)的研究,目前尚少。

    本實(shí)驗(yàn)中,我們利用Western blotting技術(shù)對(duì)DN組和NC組大鼠腎臟GRP78和p-JNK蛋白進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示,DN組大鼠前述蛋白水平較NC組大鼠顯著升高,提示DN組大鼠腎臟發(fā)生了ERS反應(yīng),并激活了ERS相關(guān)的凋亡信號(hào)通路,與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道一致。為明確AT1-AA對(duì)DN大鼠腎臟ERS的影響,我們進(jìn)一步研究了AT1-AA陽(yáng)性和陰性亞組DN大鼠的Western blotting結(jié)果,發(fā)現(xiàn)AT1-AA陽(yáng)性DN大鼠ERS標(biāo)志蛋白GRP78和凋亡蛋白p-JNK的表達(dá)均不同程度高于AT1-AA陰性DN大鼠。據(jù)此我們認(rèn)為,DN大鼠血清AT1-AA與腎臟ERS關(guān)系密切,AT1-AA可調(diào)控ERS標(biāo)志蛋白GRP78的轉(zhuǎn)錄,且持續(xù)存在的AT1-AA的病理性刺激,又能激活ERS相關(guān)的JNK凋亡通路;與AT1-AA陰性DN大鼠比較,AT1-AA陽(yáng)性大鼠腎組織p-JNK蛋白表達(dá)上調(diào),腎臟細(xì)胞凋亡增加,也說(shuō)明AT1-AA能通過ERS的JNK凋亡途徑促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡,證實(shí)了我們的假設(shè)。

    綜上所述,血清AT1-AA的腎臟損害作用與其所致的腎臟細(xì)胞凋亡有關(guān);AT1-AA可誘導(dǎo)DN大鼠腎臟ERS反應(yīng),并上調(diào)p-JNK凋亡蛋白的表達(dá),通過JNK通路促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果可為進(jìn)一步完善DN的免疫機(jī)制及通過干擾ERS中的自身免疫環(huán)節(jié)來(lái)防治DN提供全新的理論支持。

    [參 考 文 獻(xiàn)]

    [1] Wallukat G, Homuth V, Fischer T, et al. Patients with preeclampsia develop agonistic antibodies against the angiotensin AT1receptor[J]. J Clin Invest, 1999, 103(7): 945-952.

    [2] Fu ML, Herlitz H, Schulze W, et al. Autoantibodies against the angiotensin receptor (AT1) in patients with hypertension[J]. J Hypertens, 2000, 18(7): 945-953.

    [3] 熊 京, 楊慧敏, 朱 峰, 等. 血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體在原發(fā)性腎小球疾病患者血清中的表達(dá)及意義[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(8):1487-1491.

    [4] 趙林雙, 向光大, 樂 嶺, 等. 糖尿病腎病患者血清抗AT1和α1受體抗體與腎小球?yàn)V過率的關(guān)系[J]. 華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 26(5):448-451.

    [5] Arora MK, Singh UK. Molecular mechanisms in the pathogenesis of diabetic nephropathy: an update[J]. Vascul Pharmacol, 2013, 58(4):259-271.

    [6] Lakshmanan AP, Thandavarayan RA, Palaniyandi SS, et al. Modulation of AT-1R/CHOP-JNK-Caspase12 pathway by olmesartan treatment attenuates ER stress-induced renal apoptosis in streptozotocin-induced diabetic mice[J]. Eur J Pharm Sci, 2011, 44(5):627-634.

    [7] 楊 峰, 唐麗琴, 王風(fēng)玲, 等.大鼠糖尿病腎病模型建立影響因素研究[J]. 安徽醫(yī)藥, 2012, 16(6):735-738.

    [8] Liao YH, Wei YM, Wang M. Autoantibodies against AT1-receptor and α1-adrenergic receptor in patients with hypertension[J]. Hypertens Res, 2002, 25(4):641-646.

    [9] 趙林雙, 孫慧伶,向光大, 等. 美托洛爾聯(lián)合貝那普利對(duì)β1、AT1受體自身抗體陽(yáng)性的糖尿病腎病患者尿白蛋白的影響[J]. 中國(guó)糖尿病雜志, 2011,19(4): 260-262.

    [10] Wang B, Liao YH, Zhou ZH, et al. Arterial structural changes in rats immunized by AT1-receptor peptide[J]. Heart Vessels, 2005, 20(4):153-158.

    [11] 姚樹桐,秦樹存. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展和防治中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(2):364-368,384.

    [12] Kim R, Emi M, Tanabe K, et al. Role of the unfolded protein response in cell death[J]. Apoptosis, 2006,11(1):5-13.

    [13] Fribley A, Zhang K, Kaufman RJ. Regulation of apoptosis by the unfolded protein response[J]. Methods Mol Biol, 2009, 559:191-204.

    [14] Okuno S, Saito A, Hayashi T, et al. The c-Jun N-terminal protein kinase signaling pathway mediates Bax activation and subsequent neuronal apoptosis through interaction with Bim after transient focal cerebral ischemia[J]. J Neurosci, 2004, 24(36):7879-7887.

    [15] Sun HL, Sun L, Li YY, et al. ACE-inhibitor suppresses the apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in renal tubular in experimental diabetic rats[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2009, 117(7):336-344.

    [16] Cao Y, Hao Y, Li H, et al. Role of endoplasmic reticulum stress in apoptosis of differentiated mouse podocytes induced by high glucose[J]. Int J Mol Med, 2014, 33(4):809-816.

    猜你喜歡
    高糖亞組腎臟
    基于Meta分析的黃酮類化合物對(duì)奶牛生產(chǎn)性能和血清免疫指標(biāo)影響的研究
    慢性阻塞性肺疾病患者膈肌移動(dòng)度分析
    保護(hù)腎臟從體檢開始
    中老年保健(2022年3期)2022-08-24 02:58:10
    槭葉鐵線蓮亞組的研究進(jìn)展
    園林科技(2021年3期)2022-01-19 03:17:32
    3種冠狀病毒感染后的腎臟損傷研究概述
    冠心病患者腸道菌群變化的研究 (正文見第45 頁(yè))
    哪些藥最傷腎臟
    憑什么要捐出我的腎臟
    特別健康(2018年9期)2018-09-26 05:45:46
    葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
    丹紅注射液對(duì)高糖引起腹膜間皮細(xì)胞損傷的作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:21
    真人做人爱边吃奶动态| 亚洲五月婷婷丁香| 久久这里只有精品19| 国产av一区在线观看免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 在线观看日韩欧美| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲七黄色美女视频| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 国产三级黄色录像| 免费观看人在逋| 99热只有精品国产| 欧美乱妇无乱码| 精品久久久久久成人av| 日韩国内少妇激情av| 嫩草影视91久久| 长腿黑丝高跟| 1024手机看黄色片| 波多野结衣巨乳人妻| 国产成人欧美| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美乱妇无乱码| 国产av一区在线观看免费| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜影院日韩av| 女性生殖器流出的白浆| 在线av久久热| 曰老女人黄片| 一进一出好大好爽视频| 久久九九热精品免费| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 麻豆国产av国片精品| 91麻豆av在线| 在线播放国产精品三级| 亚洲精品国产一区二区精华液| 天堂影院成人在线观看| 久久久久久久久中文| 日韩大尺度精品在线看网址| 色综合欧美亚洲国产小说| 免费在线观看成人毛片| 一本一本综合久久| 麻豆av在线久日| 国产国语露脸激情在线看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 窝窝影院91人妻| 午夜福利欧美成人| 久久中文看片网| 香蕉丝袜av| 两性夫妻黄色片| 久久人妻av系列| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 怎么达到女性高潮| 香蕉久久夜色| 一边摸一边做爽爽视频免费| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 久久国产精品人妻蜜桃| 美国免费a级毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 午夜免费成人在线视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 露出奶头的视频| 在线观看午夜福利视频| 99久久精品国产亚洲精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 搞女人的毛片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲精华国产精华精| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久久久九九精品二区国产 | 一二三四社区在线视频社区8| 露出奶头的视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 成年免费大片在线观看| 国产区一区二久久| 亚洲成国产人片在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 人人妻人人看人人澡| 亚洲熟女毛片儿| 99re在线观看精品视频| 日韩视频一区二区在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产成人欧美在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲在线自拍视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜福利18| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲五月天丁香| 亚洲男人的天堂狠狠| 久热爱精品视频在线9| 亚洲精品在线观看二区| 日韩精品青青久久久久久| 在线观看一区二区三区| 亚洲久久久国产精品| 亚洲av熟女| 亚洲欧美激情综合另类| 国产成人av激情在线播放| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩国内少妇激情av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 91国产中文字幕| 可以在线观看毛片的网站| 一区二区三区高清视频在线| 国产亚洲精品久久久久5区| 精品久久蜜臀av无| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产久久久一区二区三区| 日本熟妇午夜| 天堂动漫精品| 久久草成人影院| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品亚洲av一区麻豆| 又黄又爽又免费观看的视频| 香蕉av资源在线| 大香蕉久久成人网| 久久精品国产综合久久久| 在线视频色国产色| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产成人影院久久av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜视频精品福利| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产激情久久老熟女| 亚洲三区欧美一区| 黄频高清免费视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 嫩草影视91久久| 两个人视频免费观看高清| 国产av一区在线观看免费| 久久婷婷成人综合色麻豆| 午夜福利免费观看在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产一区二区三区视频了| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲熟女毛片儿| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 老司机在亚洲福利影院| 88av欧美| 老司机午夜福利在线观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 久久香蕉激情| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲精品在线美女| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产人伦9x9x在线观看| 色老头精品视频在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 少妇的丰满在线观看| 99国产精品一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 在线观看一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 男人操女人黄网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 搞女人的毛片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 女性生殖器流出的白浆| 国内精品久久久久久久电影| 99精品在免费线老司机午夜| 搞女人的毛片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 淫秽高清视频在线观看| 国产成人av教育| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品99久久99久久久不卡| 悠悠久久av| 美女大奶头视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久99久视频精品免费| 国产97色在线日韩免费| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 18禁国产床啪视频网站| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产一区二区激情短视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成人av一区二区三区在线看| 欧美又色又爽又黄视频| 免费av毛片视频| 一级毛片高清免费大全| 高清在线国产一区| 亚洲午夜理论影院| 亚洲专区国产一区二区| 午夜a级毛片| 色播亚洲综合网| aaaaa片日本免费| 久久国产精品人妻蜜桃| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲美女黄片视频| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜精品久久久久久毛片777| 最新在线观看一区二区三区| 伦理电影免费视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品电影一区二区三区| 精品国产国语对白av| 91字幕亚洲| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲av熟女| 性欧美人与动物交配| 香蕉久久夜色| 精品久久久久久,| а√天堂www在线а√下载| 日本一区二区免费在线视频| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品日产1卡2卡| 青草久久国产| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 91老司机精品| 曰老女人黄片| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲九九香蕉| 十分钟在线观看高清视频www| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产不卡一卡二| 老鸭窝网址在线观看| 午夜精品在线福利| 校园春色视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品精品国产色婷婷| 国产熟女午夜一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品久久视频播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 白带黄色成豆腐渣| 午夜福利欧美成人| 男女视频在线观看网站免费 | 久久精品91无色码中文字幕| 女警被强在线播放| 精品国产国语对白av| 丝袜在线中文字幕| 久久精品影院6| 女警被强在线播放| 岛国在线观看网站| 国产精品,欧美在线| 国产精品久久视频播放| 精品欧美一区二区三区在线| 超碰成人久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产91精品成人一区二区三区| 久久久久国内视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲五月婷婷丁香| 一级毛片精品| 国产不卡一卡二| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产熟女xx| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美中文综合在线视频| 中文字幕久久专区| 久久精品人妻少妇| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 美女国产高潮福利片在线看| 黄片小视频在线播放| 好男人在线观看高清免费视频 | 久久狼人影院| 69av精品久久久久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美性猛交黑人性爽| 免费在线观看亚洲国产| 99国产精品99久久久久| 午夜两性在线视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 麻豆av在线久日| 人妻久久中文字幕网| 日本熟妇午夜| 久久中文看片网| 香蕉国产在线看| 精品一区二区三区av网在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 淫秽高清视频在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 色老头精品视频在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 黄片大片在线免费观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲国产看品久久| 精品免费久久久久久久清纯| 成人一区二区视频在线观看| 久热这里只有精品99| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美乱色亚洲激情| 免费在线观看完整版高清| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日韩欧美 国产精品| 成人免费观看视频高清| 精品日产1卡2卡| 久久精品人妻少妇| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲国产看品久久| 精品一区二区三区四区五区乱码| 成年版毛片免费区| 国产av不卡久久| 欧美一级毛片孕妇| 国产一区二区三区视频了| 日本免费a在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜两性在线视频| 成人永久免费在线观看视频| 不卡一级毛片| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 视频区欧美日本亚洲| 在线观看午夜福利视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩精品中文字幕看吧| 免费在线观看完整版高清| 成人亚洲精品av一区二区| 久久精品91蜜桃| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品一区二区免费欧美| 国产av在哪里看| www.www免费av| 日日夜夜操网爽| 亚洲第一av免费看| 可以在线观看的亚洲视频| 午夜两性在线视频| 91av网站免费观看| 欧美大码av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久性视频一级片| 人人妻人人看人人澡| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产真实乱freesex| 制服人妻中文乱码| 国产av在哪里看| 久久久久九九精品影院| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 大香蕉久久成人网| 精品卡一卡二卡四卡免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 欧美最黄视频在线播放免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产熟女午夜一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久久午夜电影| 国产av一区在线观看免费| 日本黄色视频三级网站网址| 黑丝袜美女国产一区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 99热6这里只有精品| 欧美成人午夜精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 在线av久久热| 欧美一区二区精品小视频在线| 免费搜索国产男女视频| 国产成人av激情在线播放| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产精品二区激情视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美日韩黄片免| 1024视频免费在线观看| 中文字幕高清在线视频| 美女免费视频网站| 亚洲精华国产精华精| 看黄色毛片网站| 国产男靠女视频免费网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久人妻av系列| 丁香欧美五月| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线观看66精品国产| 久久中文字幕一级| 可以在线观看毛片的网站| 久久亚洲精品不卡| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产亚洲精品久久久久5区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美午夜高清在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 91字幕亚洲| 制服诱惑二区| 欧美成人午夜精品| 18禁美女被吸乳视频| 成年版毛片免费区| 禁无遮挡网站| 此物有八面人人有两片| 婷婷丁香在线五月| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产1区2区3区精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 岛国在线观看网站| 成人手机av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费在线观看成人毛片| 精品国产一区二区三区四区第35| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 精品免费久久久久久久清纯| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲美女黄片视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产成年人精品一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 在线观看www视频免费| 一本久久中文字幕| 久久精品人妻少妇| 色av中文字幕| 日本精品一区二区三区蜜桃| 9191精品国产免费久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| bbb黄色大片| 美女大奶头视频| 在线播放国产精品三级| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲黑人精品在线| 丝袜在线中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 黄色女人牲交| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久中文字幕人妻熟女| 精品福利观看| 在线观看日韩欧美| 亚洲第一av免费看| 国产在线精品亚洲第一网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一本久久中文字幕| av天堂在线播放| 国产激情久久老熟女| 天堂动漫精品| 无限看片的www在线观看| 免费看十八禁软件| 欧美+亚洲+日韩+国产| www国产在线视频色| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲av第一区精品v没综合| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久国产成人免费| 色在线成人网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99riav亚洲国产免费| 大型黄色视频在线免费观看| 校园春色视频在线观看| 国产av不卡久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品久久久久久久末码| 18禁观看日本| 亚洲国产中文字幕在线视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美性长视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 99国产综合亚洲精品| 一级a爱视频在线免费观看| 免费在线观看黄色视频的| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩欧美在线二视频| 久久香蕉国产精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 禁无遮挡网站| 波多野结衣av一区二区av| 久久久久精品国产欧美久久久| 成人免费观看视频高清| 国语自产精品视频在线第100页| 国产真实乱freesex| 欧美在线黄色| 黄色a级毛片大全视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产男靠女视频免费网站| 在线播放国产精品三级| 久久久国产精品麻豆| 国产精品国产高清国产av| 午夜精品在线福利| 丁香欧美五月| 国产99久久九九免费精品| 黄频高清免费视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品一区二区三区四区久久 | 成人免费观看视频高清| 国产精品98久久久久久宅男小说| 无人区码免费观看不卡| 在线永久观看黄色视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 视频在线观看一区二区三区| 午夜免费成人在线视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产高清有码在线观看视频 | 男女午夜视频在线观看| 精品第一国产精品| 久久久国产精品麻豆| 国产精品98久久久久久宅男小说| 热99re8久久精品国产| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久国产亚洲av麻豆专区| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲全国av大片| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲av电影在线进入| 天天一区二区日本电影三级| 男女视频在线观看网站免费 | 两个人视频免费观看高清| 中文字幕精品免费在线观看视频| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 男女视频在线观看网站免费 | 午夜影院日韩av| 午夜福利成人在线免费观看| 一进一出好大好爽视频| 一级毛片女人18水好多| 露出奶头的视频| 一本大道久久a久久精品| 色播亚洲综合网| 精品不卡国产一区二区三区| 成人手机av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 老司机午夜十八禁免费视频| 黄色女人牲交| 香蕉久久夜色| 好男人在线观看高清免费视频 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| ponron亚洲| 国产高清videossex| 久久中文字幕一级| 免费在线观看影片大全网站| 国产激情久久老熟女| 露出奶头的视频| 动漫黄色视频在线观看| 成人三级做爰电影| 午夜福利免费观看在线| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产男靠女视频免费网站| 黄片播放在线免费| 人成视频在线观看免费观看| 午夜福利在线在线| 黄色a级毛片大全视频| 欧美在线一区亚洲| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久久久久久免费视频了| 国产成人精品无人区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 老司机福利观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 级片在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美在线一区亚洲| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av片东京热男人的天堂| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 婷婷精品国产亚洲av| 俺也久久电影网| 一进一出抽搐gif免费好疼| x7x7x7水蜜桃| 老司机靠b影院| 午夜免费激情av| 日韩欧美 国产精品| 三级毛片av免费| 91字幕亚洲| 99久久国产精品久久久|