AT1受體自身抗體對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及JNK表達(dá)的作用*

徐春艷， 趙林雙

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430070)

血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody，AT1-AA)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，是針對(duì)AT1受體(AT1receptor，AT1R)的特異性抗體，具有類似血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)的生物學(xué)效應(yīng)。自AT1-AA首次在先兆子癇患者體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[1]以來(lái)，又先后證實(shí)其與難治性高血壓患者蛋白尿發(fā)生率有關(guān)[2]，并參與了原發(fā)性腎小球疾病過程[3]，成為獨(dú)立于高血壓之外的致腎臟損害的因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)患者血清AT1-AA陽(yáng)性率明顯高于糖尿病患者和正常對(duì)照者[4]，提示AT1-AA與DN發(fā)病過程有關(guān)，但其致DN腎臟損害的具體機(jī)制尚不清楚。

研究顯示，DN時(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的活化可引起腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，并可通過JNK凋亡途徑誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡[5-6]。AT1R是RAS的關(guān)鍵因子，也是AT1-AA發(fā)揮效應(yīng)的特異性受體，但其能否介導(dǎo)AT1-AA而致DN腎臟ERS反應(yīng)，目前未見報(bào)道。因此，我們通過本研究探討DN大鼠血清AT1-AA與腎臟ERS及其相關(guān)的JNK凋亡信號(hào)通路的關(guān)系，以進(jìn)一步了解AT1-AA致DN腎臟細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只4周齡雄性SD大鼠，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)為42000500001559。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由攝食飲水，12 h交替照明。

2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma)；TUNEL試劑盒(Promega)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78， GRP78)抗體(Bioworld);磷酸化c-Jun N末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)抗體(Santa Cruz)；β-actin抗體、羊抗小鼠Ⅱ抗、羊抗兔Ⅱ抗和兔抗小鼠Ⅱ抗(武漢博士德生物工程有限公司)。全自動(dòng)生化儀(BECKMAN COULTER UniCelDxC 800)；HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供)。

3 主要方法

3.1模型大鼠的建立 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)選取6只為正常對(duì)照(NC)，選取30只進(jìn)行造模處理。NC組大鼠以普通飼料食喂養(yǎng)，造模大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。造模大鼠于高糖高脂喂養(yǎng)4周時(shí)腹腔注射1%的STZ溶液(35 mg/kg)，NC組注射等量的檸檬酸緩沖液。72 h后測(cè)尾靜脈血糖，隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L認(rèn)為糖尿病大鼠模型建立成功，繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)，每周復(fù)測(cè)血糖，持續(xù)觀察12周至其自然進(jìn)展至DN階段[7]。 將模型建立成功大鼠統(tǒng)一歸為模型組(model組)。

3.2血清AT1-AA的測(cè)定及分組 大鼠稱重，給予10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔麻醉，腔靜脈取血，收集血清，分裝后-20 ℃保存。AT1R抗原肽片段的氨基酸序列為5’-IHRNVFFIENTTNITVCAFHYESQNSTL-3'(由華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心血管研究室人工合成并饋贈(zèng))。ELISA法測(cè)定血清AT1-AA 的A值[8]，根據(jù)AT1-AA測(cè)定結(jié)果，隨機(jī)選擇DN大鼠納入DN組，并分AT1-AA陽(yáng)性DN(AT1-AA positive DN，APD)和AT1-AA陰性DN(AT1-AA negative DN，AND)亞組。

3.3血、尿生化指標(biāo)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d，用代謝籠收集大鼠24 h尿液并記錄尿量，4 ℃保存。應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)尿肌酐(urine creatinine，UCr)和尿微量白表達(dá)(urine microalbumin，UMA)；同時(shí)檢測(cè)血糖(blood glucose，BG)、血肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，計(jì)算肌酐清除率(creatinine clearance rate，CCr)。

3.4TUNEL染色測(cè)定腎臟細(xì)胞凋亡 制備腎組織石蠟切片，常規(guī)脫水，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TUNEL染色，DAB顯色。光鏡下觀察，凋亡細(xì)胞呈棕褐色。應(yīng)用MIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。

3.5Western blotting技術(shù)測(cè)定腎組織GRP78和p-JNK蛋白表達(dá) 提取大鼠腎組織總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。10%的SDS-PAGE分離蛋白，PVDF膜印跡，5%脫脂奶粉封閉，GRP78抗體(1∶600)、p-JNK抗體(1∶3 000)或β-actin抗體(1∶400)浸泡，4 ℃過夜,分別加入辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶50 000)孵育2 h,滴加ECL底物液，暗視中X光片壓片、顯影、定影，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析膠片灰度值比值，進(jìn)行蛋白的定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，采用2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Model組和NC組大鼠一般情況比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，造模大鼠5只死亡，1只未成模，成模率為96.7%，死亡率為16.7%。與NC組大鼠比較，model組大鼠體重明顯減輕，而血糖及腎臟肥大指數(shù)均明顯升高，見表1。

表1 NC組和model組大鼠血糖、體重和腎肥大指數(shù)的比較

2 大鼠血清AT1-AA陽(yáng)性率結(jié)果及亞組分組

Model組大鼠血清AT1-AA陽(yáng)性率為62.5%，較NC組16.7%明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)AT1-AA結(jié)果，在24只Model組大鼠中隨機(jī)選取8只AT1-AA陽(yáng)性和4只AT1-AA陰性大鼠納入DN組，其中AT1-AA陽(yáng)性DN為APD亞組，AT1-AA陰性DN為AND亞組。

3 APD和AND亞組大鼠腎功能生化指標(biāo)結(jié)果比較

與NC組比較，APD亞組大鼠的BUN和24 h UMA水平明顯升高(均P<0.01)，CCr顯著降低(P<0.05)；與APD亞組大鼠比較，前述各生化指標(biāo)在AND亞組大鼠中變化程度相對(duì)較輕，見表2。

表2 各亞組大鼠腎功能生化指標(biāo)結(jié)果比較

4 AT1-AA對(duì)DN組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響

DN組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率(16.65±5.01)較NC組大鼠(0.38±0.24)顯著增高(P<0.01)，其中腎小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞均有凋亡，但以腎小管上皮細(xì)胞凋亡為主。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，APD亞組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率(20.05±1.71)明顯高于AND亞組(13.24±4.93)(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. Apoptosis of renal cells in all groups under optical microscope by TUNEL staining assay (×400). Apoptotic cells were brown as indicated by the arrows. Mean±SD. n=4～12. ** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs AND sub-group.

5 DN組和NC組大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白表達(dá)比較

Western blotting結(jié)果顯示，DN組大鼠腎組織GRP78和p-JNK的表達(dá)分別為0.750±0.030和0.603±0.048，而NC組大鼠為0.334±0.001和0.209±0.003，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The protein levels of GRP78 and p-JNK in DN group and NC group. Mean±SD. n=6～12.**P<0.01 vs NC group.

6 APD和AND亞組大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白表達(dá)比較

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，APD亞組GRP78的表達(dá)(0.774±0.026)較AND亞組(0.728±0.003)明顯升高(P<0.05)；且APD亞組p-JNK的表達(dá)(0.643±0.026)亦高于AND亞組(0.562±0.018)(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The protein levels of GRP78 and p-JNK in APD and AND sub-groups. Mean±SD. n=4～8. #P<0.05, ##P<0.01 vs AND sub-group.

討 論

DN是糖尿病危險(xiǎn)而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為人類健康的重要威脅。但因DN是多因素綜合作用的結(jié)果，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未完全明確。本課題組前期大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體相關(guān)的自身免疫反應(yīng)參與了DN的發(fā)病過程，并與DN患者蛋白尿水平關(guān)系密切[9]，因而認(rèn)為自身免疫機(jī)制在DN病程中也起了重要作用。其中，AT1-AA通過與RAS的關(guān)鍵因子AT1R胞外第二環(huán)肽上的氨基酸序列特異性結(jié)合而發(fā)揮AngⅡ樣激動(dòng)效應(yīng)，且該激動(dòng)效應(yīng)不隨時(shí)間而脫敏。目前普遍認(rèn)為，各種組織損傷和生理紊亂所致隱蔽抗原暴露，機(jī)體自身免疫應(yīng)答反應(yīng)激活，均可使機(jī)體AT1-AA產(chǎn)生增多[10]。而在DN狀態(tài)下，高糖毒性和RAS活化等因素可能通過循環(huán)或局部組織AngⅡ濃度升高或胞內(nèi)信號(hào)通路變化而致AT1R的構(gòu)象和密度改變，進(jìn)而引起血清AT1-AA生成增多，但AT1-AA與DN腎臟結(jié)構(gòu)損害的關(guān)系及作用機(jī)制，目前未見報(bào)道。

腎臟細(xì)胞凋亡在DN腎功能惡化過程中起重要作用，是DN腎損害的重要機(jī)制。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射，然后繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)，任糖尿病大鼠自然進(jìn)展為DN階段而得到的DN模型，是目前公認(rèn)的接近人類2型DN自然病程和代謝特點(diǎn)的大鼠模型。實(shí)驗(yàn)中，TUNEL染色檢測(cè)DN大鼠腎臟細(xì)胞凋亡并定位發(fā)現(xiàn)，AT1-AA陽(yáng)性DN大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率明顯高于AT1-AA陰性DN大鼠，表明AT1-AA在DN大鼠腎臟細(xì)胞凋亡過程中起到一定作用。大量腎臟細(xì)胞凋亡可直接導(dǎo)致尿蛋白水平顯著增加，腎功能明顯降低，這是本研究中AT1-AA陽(yáng)性和陰性DN大鼠腎功能生化指標(biāo)差異顯著的原因，但AT1-AA致腎臟細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、加工和Ca2+儲(chǔ)存及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要場(chǎng)所，可通過ERS對(duì)各種因素所致的應(yīng)激反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用[11]。早期ERS能激活未折疊蛋白反應(yīng)，減少蛋白質(zhì)合成，增加蛋白質(zhì)折/疊降解來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在該反應(yīng)過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶GRP78起著主要的調(diào)控作用而成為ERS的標(biāo)志性蛋白[12]。然而過度ERS會(huì)通過其相關(guān)的3條凋亡途徑：CHOP/GADD153基因激活轉(zhuǎn)錄，JNK磷酸化和caspase-12活化，促進(jìn)應(yīng)激受損細(xì)胞的凋亡[13]。其中，JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員，可在各種應(yīng)激刺激(如高糖，氧化應(yīng)激，G蛋白偶聯(lián)受體激活等)作用下磷酸化而活化。p-JNK主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的活性，上調(diào)促凋亡蛋白Bim、Bax等的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠腎臟ERS反應(yīng)與腎小管細(xì)胞的凋亡有關(guān)[15]，且高糖可激活足細(xì)胞內(nèi)ERS相關(guān)的多條凋亡途徑，引起足細(xì)胞的損傷和凋亡[16]，均表明過度ERS在DN腎臟細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。研究證實(shí)，AngⅡ能上調(diào)心肌細(xì)胞GRP78的表達(dá)，并介導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，而AT1R特異性拮抗劑可降低DN大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白的表達(dá)，抑制JNK途徑介導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡[6]。已知AT1-AA與AngⅡ均可通過AT1R而激活下游信號(hào)分子，并能經(jīng)相似的信號(hào)通路發(fā)揮效應(yīng)，故假設(shè)DN發(fā)電時(shí)，血清中持續(xù)存在的高滴度AT1-AA通過AT1R激活腎臟ERS反應(yīng)，并活化JNK凋亡信號(hào)通路，使p-JNK凋亡蛋白的水平增高，促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡。但關(guān)于血清AT1-AA與腎臟ERS反應(yīng)的研究，目前尚少。

本實(shí)驗(yàn)中，我們利用Western blotting技術(shù)對(duì)DN組和NC組大鼠腎臟GRP78和p-JNK蛋白進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，DN組大鼠前述蛋白水平較NC組大鼠顯著升高，提示DN組大鼠腎臟發(fā)生了ERS反應(yīng)，并激活了ERS相關(guān)的凋亡信號(hào)通路，與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道一致。為明確AT1-AA對(duì)DN大鼠腎臟ERS的影響，我們進(jìn)一步研究了AT1-AA陽(yáng)性和陰性亞組DN大鼠的Western blotting結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AT1-AA陽(yáng)性DN大鼠ERS標(biāo)志蛋白GRP78和凋亡蛋白p-JNK的表達(dá)均不同程度高于AT1-AA陰性DN大鼠。據(jù)此我們認(rèn)為，DN大鼠血清AT1-AA與腎臟ERS關(guān)系密切，AT1-AA可調(diào)控ERS標(biāo)志蛋白GRP78的轉(zhuǎn)錄，且持續(xù)存在的AT1-AA的病理性刺激，又能激活ERS相關(guān)的JNK凋亡通路；與AT1-AA陰性DN大鼠比較，AT1-AA陽(yáng)性大鼠腎組織p-JNK蛋白表達(dá)上調(diào)，腎臟細(xì)胞凋亡增加，也說(shuō)明AT1-AA能通過ERS的JNK凋亡途徑促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡，證實(shí)了我們的假設(shè)。

綜上所述，血清AT1-AA的腎臟損害作用與其所致的腎臟細(xì)胞凋亡有關(guān)；AT1-AA可誘導(dǎo)DN大鼠腎臟ERS反應(yīng)，并上調(diào)p-JNK凋亡蛋白的表達(dá)，通過JNK通路促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果可為進(jìn)一步完善DN的免疫機(jī)制及通過干擾ERS中的自身免疫環(huán)節(jié)來(lái)防治DN提供全新的理論支持。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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