白細(xì)胞介素4調(diào)節(jié)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和造血支持能力*

楊舟鑫， 韓之波， 賈兵兵△， 王國付

(1浙江醫(yī)院，浙江省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310013； 2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所,血液病醫(yī)院，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300020)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)最早分離于骨髓，它可以黏附在塑料培養(yǎng)瓶中快速增殖，并具有向脂肪、骨髓和軟骨分化的能力，因此可以作為細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞。不過，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSC)來源有一定的局限，限制了其在臨床上的應(yīng)用。隨著研究的逐漸深入，現(xiàn)在幾乎已經(jīng)可以從身體的各個(gè)組織得到MSC[1]。其中，圍產(chǎn)期來源的MSC如來源于胎盤、臍帶和臍帶血的MSC的獲得較為方便且受倫理學(xué)限制少，因而圍產(chǎn)期干細(xì)胞可能會具有更好的臨床應(yīng)用前景。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC)可以從臍帶中擴(kuò)增獲得，它具有BM-MSC的絕大部分生物學(xué)功能，可以向骨、脂肪、軟骨、神經(jīng)和內(nèi)皮等分化，有和BM-MSC相似的免疫調(diào)節(jié)功能，主要通過前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)來抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖和IFN-γ的分泌，同時(shí)，它在增殖能力和胚胎干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)要明顯高于BM-MSC[2-3]。研究表明MSC在移植物抗宿主病和多種自身免疫性疾病等多種難治性疾病中都有良好的應(yīng)用[4-6]。

MSC的功能會受到炎癥因子的調(diào)節(jié)，IFN-γ、IL-1β和TNF-α可以調(diào)節(jié)MSC的各種性質(zhì)[7-8]，但是針對Th2型的炎癥因子白細(xì)胞介素4(interleukin -4, IL-4對MSC的作用的研究相對較少，本研究本主要探討IL-4刺激后UC-MSC的生物學(xué)特性如免疫表型、增殖、分化能力和造血支持能力等的變化。

材 料 和 方 法

1 主要試劑及儀器

DMEM/F12和IMDM干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶和2-巰基乙醇均為Gibco產(chǎn)品；胎牛血清為HyClone產(chǎn)品；人臍血CD34陽性分選試劑盒為STEMCELL產(chǎn)品；小鼠抗人CD11b、 CD19、 CD34、 CD45、 CD73、 CD90、 CD105、人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-DR和HLA-ABC抗體以及同型對照抗體均為BD產(chǎn)品；地塞米松、IBMX、吲哚美辛、抗壞血酸磷酸鹽和β-甘油磷酸為Sigma產(chǎn)品；胰島素和IL-4為Peprotech產(chǎn)品；BrdU-ELISA試劑盒為Roche產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡購自O(shè)lympus；流式細(xì)胞儀購自BD。

2 細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

臍帶來源于正常足月剖宮或順產(chǎn)產(chǎn)婦，在獲得知情同意的情況下，由天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司采集。用D-Hanks緩沖液充分沖洗臍帶，將臍帶剪碎成小組織塊，再將組織塊用膠原酶和胰酶消化，然后混合液體經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，按1∶3傳代。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞表型的測定 分對照組和IL-4刺激組。IL-4刺激組在細(xì)胞50%融合時(shí)用IL-4(20 μg/L)刺激24 h后消化離心，將UC-MSC消化下來后，按每管2×105個(gè)細(xì)胞分管，使用抗體標(biāo)記后，用PBS重懸至400 μL，在流式細(xì)胞分析儀上檢測。

3.2MTT法檢測細(xì)胞活力 將UC-MSC 以2×103cells/well的密度種于96孔板中，IL-4刺激組在種細(xì)胞時(shí)加入IL-4 (20 μg/L)。利用MTT法分別于IL-4刺激的24 h、96 h和120 h后在酶標(biāo)儀上檢測A490值。

3.3BrdU法測定細(xì)胞增殖 將UC-MSC 以2×103cells/well的密度種于96孔板中，IL-4刺激組在種細(xì)胞時(shí)加入IL-4(20 μg/L)。使用培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h后加入BrdU，再培養(yǎng)12 h后棄上清。用固定液固定細(xì)胞，然后棄上清加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，室溫避光孵育1 h。棄上清，用洗滌液洗板5次，加入顯色底物，室溫避光孵育15 min后，加入終止液終止反應(yīng)，最后在酶標(biāo)儀上檢測A450值。

3.4細(xì)胞分化潛能的檢測 將UC-MSC以2×103cells/well的密度種于96孔板中。48 h后細(xì)胞貼壁完全，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為成脂和成骨培養(yǎng)基(成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：IMDM培養(yǎng)基、10% FBS、100 U青/鏈霉素、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、0.1 μmol/L地塞米松、0.2 μmol/L Vit C、10 μmol/L β-磷酸甘油；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基：IMDM培養(yǎng)基、10% FBS、100 U青/鏈霉素、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、1 μmol/L地塞米松、0.5 μmol/L IBMX、10 mg/L insulin、100 μmol/L吲哚美辛)。分對照組和IL-4(20 μg/L)刺激組。在誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，成脂分化用油紅O染色，成骨分化用茜素紅S染色，顯微鏡下觀察。成骨分化定量是向成骨分化染色完成后的96孔板中加入含20%甲醇和10%乙酸的水溶液，室溫孵育15 min后在酶標(biāo)儀上檢測A450值。成脂分化定量是向成脂分化染色完成后的孔板加入100%的異丙醇，室溫孵育10 min后在酶標(biāo)儀上檢測A409值。

3.5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測基因的表達(dá) IL-4(20 μg/L)刺激UC-MSC 24 h后收集細(xì)胞，并以平行培養(yǎng)的未刺激的UC-MSC作為對照，用E.Z.N.A. Total RNA Kit 1(Omega)抽提細(xì)胞總RNA，并按照MLV RT kit(Invitrogen)的逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR采用GoTaqr qPCR Master Mix(Promega)的反應(yīng)體系。使用ABI 7300 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s，共 45個(gè)循環(huán)。以次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1,HPRT1)為內(nèi)參照，分析目的基因的相對表達(dá)量。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過繪制熔解曲線來進(jìn)行驗(yàn)證。用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列見表1。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物

3.6UC-MSC條件培養(yǎng)液收集 取2×106UC-MSC，用10 mL含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(刺激組加入IL-4,終濃度為20 μg/L)，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h時(shí)后收集UC-MSC的培養(yǎng)上清，用0.22 μm的濾膜過濾上清，分裝、凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3.7分離純化臍血CD34+細(xì)胞 收集足月妊娠的臍血標(biāo)本，均獲得知情同意。PBS按1∶2的比例稀釋臍血。將稀釋的臍血以2∶1的比例沿管壁轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)的人淋巴細(xì)胞分離液上，使用較慢的加速度和減速度，600×g離心20 min，小心抽取中間的白膜層，PBS溶液洗2次。用人臍血CD34陽性細(xì)胞分選試劑盒，分選CD34+細(xì)胞。DMEM/F12培養(yǎng)基重懸CD34+細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/L。

3.8造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng) 將IL-4刺激或未刺激UC-MSC條件培養(yǎng)液400 μL與1.6 mL不完全甲基纖維素培養(yǎng)基MethoCultTMH4230混合，分別加入200 μL CD34+細(xì)胞懸液，接種于6孔板；于37 ℃、5% CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。在第14 天分別觀察集落形成單位的形態(tài)和種類，記錄≥50個(gè)細(xì)胞組成的集落形成單位的數(shù)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IL-4刺激對UC-MSC形態(tài)表型的影響

UC-MSC貼壁后，可以在體外迅速擴(kuò)增，細(xì)胞呈梭形。加入IL-4刺激，MSC形態(tài)無明顯變化，仍保持其原有形態(tài)。MSC表達(dá)CD73、CD90、CD105和HLA-ABC,不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。這些MSC的基本特征在IL-4刺激后并沒有明顯的變化，說明IL-4并不能改變UC-MSC的基本免疫表型,見圖1。

Figure 1. The phonotypes of UC-MSC with or without IL-4 stimulation assayed by flow cytometry.

2 IL-4刺激對UC-MSC增殖能力的影響

在體外貼壁并能迅速擴(kuò)增是UC-MSC的基本特征。MTT和BrdUELISA的檢測結(jié)果都表明，72 h后IL-4能輕微地削弱UC-MSC的增殖能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Effect of IL-4 on proliferation of UC-MSC. A: MTT test of UC-MSC with/without IL-4 stimulation； B: Brdu ELISA test of UC-MSC with/without IL-4 stimulation. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs control.

3 IL-4刺激對UC-MSC分化潛能的影響

IL-4刺激后，UC-MSC仍然具有體外向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞分化的能力，鏡下觀察UC-MSC脂滴形成和鈣沉積數(shù)量并不能觀察到明顯的變化，對成脂和成骨分化的定量檢測也沒有檢測到明顯的差異，見圖3。這說明在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，IL-4對UC-MSC成脂和成骨分化能力的影響并不大。

4 IL-4刺激對UC-MSC造血支持相關(guān)基因的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在經(jīng)過IL-4刺激之后，UC-MSC表達(dá)的粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)這幾個(gè)造血相關(guān)基因均未檢測到明顯的變化，但是IL-6卻出現(xiàn)了明顯上調(diào)(P<0.01)。

5 IL-4刺激對UC-MSC造血支持功能的影響

在不加入U(xiǎn)C-MSC培養(yǎng)上清的情況下，僅加入含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基或加入含IL-4和血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，均不足以促進(jìn)CD34+細(xì)胞集落形成。UC-MSC的培養(yǎng)上清作用于CD34+細(xì)胞時(shí)，則可以促進(jìn)CD34+細(xì)胞的集落形成。IL-4刺激組和未刺激對照組均可見粒系集落形成單位(colony forming unit-granulocyte, CFU-G)、巨噬系集落形成單位(colony forming unit-macrophage, CFU-M)和粒-巨噬集落形成單位(colony forming unit-granulocyte and macrophage, CFU-GM)，但是沒有觀察到觀察到紅系相關(guān)集落形成單位。CFU-GM占據(jù)其中的大多數(shù)。IL-4 刺激組的總集落形成單位要顯著高于未刺激組(P<0.05)。其中，IL-4刺激組中的CFU-GM的數(shù)量要顯著高于未刺激組(P<0.01)，但是CFU-G和CFU-M的差距則不顯著(P>0.05)，說明IL-4刺激組的上清相對于未刺激組上清主要增加了CFU-GM的數(shù)量,見圖5。

Figure 5. Numbers of CFU formed by umbilical cord blood-derived CD34+ cells in control and IL-4 stimulation group. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, ** P<0.01 vs control.

討 論

本研究中，我們檢測了IL-4刺激對UC-MSC的表型、增殖、分化等基本生物學(xué)特性和造血支持功能的影響，并探究了IL-4刺激對UC-MSC造血相關(guān)基因表達(dá)的改變。IL-4刺激UC-MSC并沒有改變UC-MSC的干細(xì)胞基本性質(zhì)。IL-4刺激后的MSC仍然符合國際細(xì)胞治療協(xié)會(ISCT)對于MSC的標(biāo)準(zhǔn)，仍然可以黏附于培養(yǎng)瓶大量增殖，表達(dá)CD73、CD90和CD105,不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD11b、CD19、CD34和CD45，并且可以成脂成骨分化。但I(xiàn)L-4刺激后UC-MSC還是有一些其它改變。首先MSC的增殖被削弱；其次MSC的造血支持功能也發(fā)生了變化。這說明IL-4刺激之后的UC-MSC具有了新的特征，具有新的不同的性質(zhì)。

造血支持作用是MSC重要的功能，UC-MSC的上清含有G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-6等因子，可以促進(jìn)CD34+細(xì)胞生成集落[9]。我們的實(shí)驗(yàn)表明，UC-MSC在 IL-4存在的情況下其上清具有更強(qiáng)的促進(jìn)人臍血CD34+細(xì)胞體外集落生成的能力。通過實(shí)時(shí)定量PCR我們發(fā)現(xiàn)G-CSF、M-CF、GM-CSF并沒有明顯變化；但是IL-6卻發(fā)生了明顯上調(diào)。IL-6能夠在多種免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞中表達(dá)。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞也可以表達(dá)IL-6。IL-6是一種重要的造血促進(jìn)因子，能夠促進(jìn)造血發(fā)生，促進(jìn)干細(xì)胞分化，形成更多的血液系統(tǒng)細(xì)胞，促進(jìn)小鼠骨髓移植后免疫功能的重建[10]。本實(shí)驗(yàn)中MSC造血支持能力的增強(qiáng)可能與IL-6的作用相關(guān)。此外，IL-4自身在這一體系中的作用仍有待進(jìn)一步研究。盡管在沒有MSC分泌的細(xì)胞因子的情況下，IL-4并不能誘導(dǎo)集落的產(chǎn)生，但I(xiàn)L-4是否與MSC分泌的細(xì)胞因子的協(xié)同作用仍不明確。

IFN-γ已經(jīng)被證明可以直接作用于UC-MSC，改變UC-MSC的各項(xiàng)功能[8]。IFN-γ與IL-4對UC-MSC的作用并不一致。IFN-γ被證明可以增強(qiáng)UC-MSC的分化，并誘導(dǎo)IDO1來促進(jìn)MSC的免疫調(diào)節(jié)功能，但是沒有發(fā)現(xiàn)IL-4的促分化能力增強(qiáng)。而IL-4可以明顯削弱UC-MSC的增殖能力，但是相同時(shí)間內(nèi)的IFN-γ并沒有明顯改變UC-MSC的增殖。因此，可以推測IFN-γ和IL-4在對MSC的作用上并不一致。在特異性免疫反應(yīng)中，IFN-γ與IL-4分別被認(rèn)為是Th1型和Th2型免疫反應(yīng)的標(biāo)志性因子。UC-MSC對IFN-γ與IL-4的不同反應(yīng)可能體現(xiàn)了其在Th1型和Th2型免疫反應(yīng)下的不同狀態(tài)，說明其在特異性免疫反應(yīng)時(shí)的有不同反應(yīng)。

TNF-α被認(rèn)為可以增強(qiáng)UC-MSC的G-CSF、GM-CSF和IL-6的表達(dá)，從而增強(qiáng)其造血支持能力[11]。其上清誘導(dǎo)CFU-M和CFU-GM的能力均有所增加。IL-4也有增強(qiáng)CFU-GM的能力，但是IL-4處理不能明顯上調(diào)UC-MSC的G-CSF和GM-CSF，僅僅有IL-6的上調(diào)，因此TNF-α和IL-4在調(diào)節(jié)UC-MSC的造血支持上也有不同的作用。

總之，IL-4能夠削弱UC-MSC的增殖能力，并增強(qiáng)其對造血的支持能力。這為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞如何在Th2型免疫疾病的患者中使用提供了一些基礎(chǔ)資料，為完善臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用于多種疾病的治療提供了理論依據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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