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    siArid2重組腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響*

    2014-08-13 12:42:48段玉潔聶麗珠
    中國病理生理雜志 2014年11期
    關(guān)鍵詞:腺病毒復(fù)合物細(xì)胞周期

    段玉潔, 聶麗珠, 田 玲, 李 治, 陳 震, 唐 霓

    (重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400016)

    Arid2 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因,定位于第12對(duì)染色體的長臂上,包含21個(gè)外顯子[1],其編碼的蛋白是PBAF(polybromo-associated BRG1-associated factor)復(fù)合物的一種特有亞基,而PBAF是一種依賴ATP酶的染色質(zhì)重塑復(fù)合物,可以通過水解ATP獲得的能量, 改變組蛋白與核小體之間的相互作用,調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化過程。

    Arid2蛋白結(jié)構(gòu)分為N端富含保守AT的結(jié)構(gòu)域,RFX型翼狀螺旋DNA結(jié)合域,富含脯氨酸、甘氨酸的結(jié)構(gòu)域以及C端2個(gè)保守鋅指結(jié)構(gòu)域[2]。人類Arid家族包含15個(gè)成員,可分為7個(gè)亞家族:Arid1~5、JArid1和JArid2[3]。研究表明Arid家族的突變失活與人類多種腫瘤如肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、黑色素瘤、非小細(xì)胞型肺癌以及頭頸部癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì),在丙型肝炎病毒(HCV)感染相關(guān)的HCC中,約18.2%的HCC組織標(biāo)本存在Arid2 的失活突變。

    研究表明Arid2等組成的蛋白復(fù)合物SWI/SNF具有腫瘤抑制作用,被認(rèn)為是一類腫瘤抑制因子或抑癌基因,可能通過以下途徑發(fā)揮作用:(1)調(diào)控IFN信號(hào)通路,調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答;(2)調(diào)控pRb信號(hào)通路下游靶基因,抑制細(xì)胞增殖;(3)調(diào)控細(xì)胞骨架蛋白、跨膜糖蛋白CD44等參與調(diào)控細(xì)胞的遷移與侵襲力[5]。Arid2的生物學(xué)功能尚不明確,其在腫瘤發(fā)生發(fā)展特別是肝細(xì)胞肝癌中的作用目前知之甚少。

    小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是含有21~23個(gè)堿基的單鏈或雙鏈RNA,能夠高效、特異地與目標(biāo)mRNA位點(diǎn)結(jié)合,促使同源mRNA降解,從而特異地下調(diào)甚至沉默目標(biāo)基因的表達(dá)[6]。本研究運(yùn)用小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建沉默Arid2 的重組質(zhì)粒,并將質(zhì)粒包裝成腺病毒[7],通過體外實(shí)驗(yàn)初步分析該基因的功能,為今后的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    1.1質(zhì)粒、細(xì)胞 pSES-1穿梭質(zhì)粒載體、BJ5183菌株及其衍生物AdEasy-1細(xì)胞、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1和含有無關(guān)序列(scrambled)的siRNA腺病毒Adsicontrol均由美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室HE Tong-chuan教授惠贈(zèng);人腎上皮細(xì)胞HEK293和人肝癌細(xì)胞SMMC-7721為本實(shí)驗(yàn)室保存;HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基,SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的1640培養(yǎng)基中。

    1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶HindIII、KpnI和SfiI購于New England Biolabs;T4 DNA連接酶和質(zhì)粒小量提取試劑盒購于Promega;DNA marker購于TaKaRa;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen;蛋白定量試劑盒購于碧云天公司;Arid2單克隆抗體(兔)購于Santa Cruz;鼠抗IgG-HRP、山羊抗兔多克?、蚩笽gG購于Abcam;ECL發(fā)光試劑購于Millipore;胎牛血清購自Gibco;雙抗(青霉素+鏈霉素)、DMEM和1640培養(yǎng)基購自Hyclone。

    2 方法

    2.1siArid2腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)PubMed公布的Arid2基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA,見表1,將3對(duì)正、反義鏈引物按照1:3稀釋,分別等比例混勻后,沸水煮沸10 min,自然冷卻至室溫以便形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA。用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ酶切載體pSES-1使其線性化,用T4 DNA連接酶將上述引物與線性化的載體連接,電轉(zhuǎn)入感受態(tài)菌DH5α中,鋪板后置于37 ℃孵箱中過夜。挑取陽性單克隆菌落,提取質(zhì)粒后送華大基因進(jìn)行測序分析,測序結(jié)果成功獲得重組質(zhì)粒psiArid2-1、psiArid2-2和psiArid2-3。

    表1 引物序列

    2.2siArid2腺病毒的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒psiArid2-1、psiArid2-2和psiArid2-3分別用限制性內(nèi)切酶PmeI酶切,使其線性化,再電轉(zhuǎn)入腺病毒同源穿梭質(zhì)粒BJ-AdEasy中,電轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂于含100 mg/L卡那霉素的LB平板上,于37 ℃孵箱中孵育過夜,在LB平板上挑取約20個(gè)偏小的單克隆菌,接種于 4 mL 含100 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。用堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,將提取的質(zhì)粒在0.8%瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)質(zhì)粒大小篩選出陽性克隆質(zhì)粒pAdsiArid2-1~3。將上述質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)菌E.coliDH5ɑ中擴(kuò)大培養(yǎng),將提取的重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶PacⅠ進(jìn)行酶切鑒定。

    2.3重組腺病毒的包裝擴(kuò)增 用小量抽提試劑盒提取pAdsiArid2-1~3質(zhì)粒,PacⅠ酶切后無水乙醇沉淀法純化。用3 mL無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌HEK293細(xì)胞,吸去培養(yǎng)基,再加入2.5 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2濕度孵箱中。將13 μL脂質(zhì)體,3 μg AdEasy-siArid2質(zhì)粒和250 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基混勻,室溫靜置15~17min后加入到培養(yǎng)基中,輕輕混勻,于37 ℃、5%CO2濕度孵箱中孵育4 h。吸去轉(zhuǎn)染液,加入7 mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光情況。轉(zhuǎn)染成功后約10~15 d,收取含病毒的上清,用約1/2的量繼續(xù)感染293細(xì)胞,進(jìn)行新的一輪病毒擴(kuò)增,重復(fù)擴(kuò)增4~5次后獲得滴度較高的重組腺病毒,保存至-80℃。

    2.4siArid2腺病毒的鑒定和效率測定 將SMMC-7721細(xì)胞以每孔40%的密度接種于24孔培養(yǎng)板中,設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將3種重組腺病毒以10 μL為初始量按1/2等比減量后依次加入6個(gè)孔中,即相應(yīng)的6個(gè)孔中所加入的腺病毒量為10μL、5μL、2.5μL、1.25μL、0.75μL和0.37μL)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)以及熒光強(qiáng)弱,選擇細(xì)胞狀態(tài)良好、熒光強(qiáng)度適中的孔所對(duì)應(yīng)的病毒量作為重組腺病毒的最適滴度。將4×105SMMC-7721細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒AdsiArid2-1、AdsiArid2-2、AdsiArid2-3以及對(duì)照腺病毒Adsicontrol。病毒感染后48 h分別提取總蛋白,并用BCA法測定其蛋白濃度。取50 μg蛋白,經(jīng)10% SDS-PAGE分離后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。按照抗體說明書將膜孵以最適稀釋度的Arid2抗體,4 ℃ 孵育過夜。TBST洗膜40 min后,加入1∶5 000稀釋的羊抗兔Ⅱ抗室溫孵育1 h。TBST洗膜后,加入ECL發(fā)光試劑,用ImageJ 2X灰度比對(duì)軟件分析各組Arid2的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

    2.5MTS法檢測SMMC-7721細(xì)胞的生長 將4×105SMMC-7721細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒Adsicontrol和AdsiArid2,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。病毒感染后12 h,將上述細(xì)胞以4×103/well密度重鋪于96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,分別于鋪板后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h向每孔加入20 μL MTS反應(yīng)液,輕輕混勻,于37 ℃、5%CO2孵箱中避光靜置2 h,檢測各時(shí)點(diǎn)的吸光度(A490)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將2×104SMMC-7721細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒Adsicontrol和AdsiArid2,同時(shí)設(shè)置空白處理組作為對(duì)照。病毒感染后12 h,更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基,72 h后棄去培養(yǎng)基,并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,加入75%的乙醇輕輕重懸收集細(xì)胞。-20 ℃固定細(xì)胞24 h,取等體積的碘化丙啶染液與細(xì)胞懸液混合后,4 ℃靜置30 min,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    每種實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,各組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 siArid2腺病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

    將構(gòu)建好的3個(gè)重組質(zhì)粒psiArid2-1~3電轉(zhuǎn)入BJ-AdEasy感受態(tài)細(xì)胞,挑取轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行搖菌,提取質(zhì)粒DNA。由于腺病毒的同源重組可以發(fā)生在穿梭質(zhì)粒AdEasy-1的ori區(qū)域之間或者其左臂上,這2種重組方式導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶PacI酶切后會(huì)產(chǎn)生3.0 kb或4.5 kb的片段。用PacI 酶切后2號(hào)、5號(hào)和8號(hào)重組菌落出現(xiàn)約4.5 kb DNA條帶,表明腺病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,見圖1。

    Figure 1. Identification of recombinant adenoviruses by Pac I digestion.Three of the 9 potential clones released a 4.5-kb fragment after Pac I digestion(Lane 2,Lane 5 and Lane 8).M: DNA marker 2000.

    2 siArid2重組腺病毒的構(gòu)建

    將已構(gòu)建好的pAdsiArid2-1~3重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的感染情況。在轉(zhuǎn)染后7 d,上述細(xì)胞中均可見明顯的紅色熒光,且呈現(xiàn)腺病毒包裝過程中出現(xiàn)的典型“彗星狀”熒光,隨著轉(zhuǎn)染天數(shù)的增加,熒光強(qiáng)度增強(qiáng),約轉(zhuǎn)染后10 d,部分細(xì)胞由貼壁轉(zhuǎn)為漂浮,大約14 d后,收集含病毒顆粒的上清,見圖2。

    3 鑒定重組干擾腺病毒的抑制效率

    將SMCC-7721細(xì)胞分別感染重組腺病毒AdsiArid2-1~3,并設(shè)置空白對(duì)照組和Adsicontrol組,細(xì)胞感染后48 h收集總蛋白,行Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測Arid2蛋白的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。結(jié)果顯示:以GAPDH為內(nèi)參照,AdsiArid2-1組的灰度比值為0.749±0.020,AdsiArid2-2的灰度比值為0.473±0.028,AdsiArid2-3的灰度比值為0.415±0.017,空細(xì)胞(mock)和Adsicontrol組的灰度比對(duì)值分別為0.772±0.031、0.783±0.018。統(tǒng)計(jì)分析顯示,mock組與Adsicontrol組的Arid2表達(dá)量無明顯差異,與Adsicontrol組相比,AdsiArid2-2和AdsiArid2-3對(duì)Arid2的表達(dá)均有明顯抑制作用(P<0.05),其中以AdsiArid2-3的抑制作用更強(qiáng),而AdsiArid2-1的抑制作用不明顯(P>0.05)。以上結(jié)果表明AdsiArid2-3沉默Arid2表達(dá)的效果最好。因此,在后續(xù)MTS和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中選擇AdsiArid2-3作為實(shí)驗(yàn)組,見圖3。

    Figure 2. Package of recombinant adenoviruses in HEK293 cells.Transfected HEK293 cells were observed under fluorescence field at 10 d(×400).

    Figure 3. Arid2 protein expression in SMCC-7721 cells transfe-cted with Adsicontrol,AdsiArid2-1, AdsiArid2-2 and AdsiArid2-3.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs Adsicontrol group; #P<0.05 vs mock group.

    4 siArid2對(duì)于SMCC-7721細(xì)胞增殖活性的影響

    MTS結(jié)果顯示,AdsiArid2組在72 h和96 h的吸光度值分別為1.13±0.05和1.23±0.04,mock組72 h和96 h的吸光度值分別為0.92±0.03和1.07±0.08,Adsicontrol組72 h和96 h的吸光度值分別為0.91±0.01、1.03±0.02。通過以上數(shù)值可以看出AdsiArid2組在72 h和96 h的吸光度值與對(duì)照組相比明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明沉默Arid2基因的表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖,見圖4。

    Figure 4. The effects of recombinant adenovirus on the proliferation of SMMC-7721 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs Adsicontrol group;#P<0.05 vs mock group.

    5 siArid2對(duì)于細(xì)胞周期的影響

    流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果顯示,感染腺病毒72 h后,AdsiArid2組SMMC-7721細(xì)胞處于G1期和S期的百分比分別為55.67%±0.38%和31.93%±0.38%;mock組處于G1期和S期細(xì)胞百分比分別為63.57%±2.90%和24.75%±2.53%;而Adsicontrol組處于G1期和S期細(xì)胞百分比分別為66.02%-2.13%和24.37%±1.91%。從以上數(shù)值可以看出,感染AdsiArid2腺病毒組,SMMC-7721細(xì)胞G1期縮短,S期延長,細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài),細(xì)胞周期進(jìn)程加快,見圖5。

    Figure 5. The percentage of cell phase.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs Adsicontrol group.

    討 論

    HCC是全球最常見的十大惡性腫瘤之一,在我國,肝癌死亡率已居癌癥死亡率的第二位[1]。癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用的過程,包括細(xì)胞分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活、原癌基因與抑癌基因的失衡以及腫瘤干細(xì)胞的分化等。其中抑癌基因的失活一直在癌癥研究中受到重視[8]。

    Arid2,存在于PBAF復(fù)合物中,而PBAF復(fù)合物是SWI/SNF復(fù)合物的一種類型。SWI/SNF復(fù)合物是一種ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物,它可以利用催化ATP水解釋放的能量改變組蛋白與DNA之間的相互作用來調(diào)整染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),這對(duì)于轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的順利進(jìn)行具有重要意義[9]。功能學(xué)研究顯示,Arid2是PBAF復(fù)合物中唯一的短半衰期轉(zhuǎn)錄因子,通過小干擾RNA抑制Arid2的表達(dá)可以降低PBAF復(fù)合物中其它蛋白的表達(dá)[10]。Arid2被發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌、黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中均存在不同程度的突變[11-13],其中在丙型肝炎病毒相關(guān)的HCC中存在3種形式的突變:移碼突變、無義突變和剪接位點(diǎn)突變[1]。Arid2的突變失活能否影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程,可能發(fā)揮作用的機(jī)制,目前的認(rèn)識(shí)與研究都知之甚少。因此本研究旨在通過小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建siArid2的重組腺病毒,初步觀察其對(duì)于細(xì)胞生長及細(xì)胞周期的影響,為之后更加深入地研究Arid2的抑癌機(jī)制提供重要的前期工作基礎(chǔ)。

    通過分析Arid2編碼區(qū)序列,我們設(shè)計(jì)了3段編碼區(qū)的siRNA片段,分別構(gòu)建3個(gè)siArid2的重組質(zhì)粒,并進(jìn)一步構(gòu)建了其重組腺病毒,且通過Western blotting我們篩選出了抑制效果最明顯的重組腺病毒AdsiArid2-3。將該腺病毒感染體外培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞后,在72 h和96 h時(shí)細(xì)胞的吸光光度值(A值)較對(duì)照組顯著增加,說明沉默Arid2的表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長。Arid2參與調(diào)控細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚不明確。有研究表明,Arid家族其它成員如Arid1A、Arid1B可以通過與E2F-Rb信號(hào)通路相關(guān)分子相互作用調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程,從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與增殖[14]。細(xì)胞周期分為G0/G1、G2、S和M四個(gè)周期,各期都存在關(guān)鍵的檢測點(diǎn),例如G1/S和G2/M檢測點(diǎn)。各檢測點(diǎn)功能正常可以保證細(xì)胞周期順利進(jìn)行。其中,G1/S檢測點(diǎn)在細(xì)胞周期進(jìn)程中起關(guān)鍵作用,決定細(xì)胞周期能否啟動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞增殖[15-17]。通過流式細(xì)胞學(xué)分析,SMCC-7721細(xì)胞在感染重組腺病毒AdsiArid2后,G0/G1期細(xì)胞百分比減少,S期細(xì)胞百分比增加,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示Arid2有可能通過調(diào)控肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期,從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了沉默Arid2表達(dá)的重組腺病毒,初步觀察了Arid2對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,對(duì)于Arid2是如何調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能及其相關(guān)的分子機(jī)制,還需進(jìn)一步深入研究。

    [參 考 文 獻(xiàn)]

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