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    糖尿病患者與健康人脂蛋白單糖組成差異研究*

    2014-08-13 12:12:34郭守東崔英杰秦樹存
    中國病理生理雜志 2014年10期
    關(guān)鍵詞:唾液酸健康人單糖

    郭守東, 馮 蕾, 張 穎, 崔英杰, 秦樹存

    (泰山醫(yī)學(xué)院山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271000)

    近年研究顯示,脂蛋白自身結(jié)構(gòu)的改變是影響其功能的生物學(xué)機(jī)制之一,且脂蛋白自身結(jié)構(gòu)改變而失去原有功能的現(xiàn)象在多種疾病中普遍存在[1-3]。脂蛋白糖基化修飾是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,其對(duì)于維持脂蛋白的功能至關(guān)重要。有研究證實(shí),脂蛋白的唾液酸化修飾,主要是指N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid, NANA)化修飾,以及半乳糖、甘露糖等糖基構(gòu)成對(duì)維持脂蛋白的正常生理功能十分重要;另有研究顯示,脂蛋白等的去唾液酸化與動(dòng)脈粥樣硬化等心血管病變的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。因此,脂蛋白單糖組成的精確測(cè)定是探究脂蛋白糖基化修飾與脂蛋白功能的重要技術(shù)手段之一。

    測(cè)定單糖組成的方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法和液相串聯(lián)質(zhì)譜法等。由于糖類紫外吸收很弱,為提高檢測(cè)靈敏度,研究者常將糖復(fù)合物水解后采用柱前或柱后衍生化色譜法分離和檢測(cè)。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolone,PMP)柱前衍生化高效液相色譜法反應(yīng)條件較溫和,產(chǎn)物無立體異構(gòu),紫外檢測(cè)靈敏度較高,可用于同時(shí)檢測(cè)中性、酸性及堿性單糖。本文建立一種高效液相色譜法測(cè)定脂蛋白上的中性和堿性單糖的PMP柱前衍生方法,結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)快速定量脂蛋白顆粒上的NANA,并對(duì)糖尿病患者和健康人脂蛋白顆粒的單糖構(gòu)成進(jìn)行比對(duì)分析。

    材 料 和 方 法

    1 材料和儀器

    D(+)-葡萄糖(glucose,Glc)、D(+)-甘露糖(mannose, Man)、D(+)-半乳糖(galactose, Gal)、L(-)-巖藻糖(fucose, Fuc)、L(+)-阿拉伯糖(arabinose, Ara)、D(+)-葡萄糖胺(glucosamine, GlcN)、N-乙酰D(+)-葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)、L-鼠李糖(rhamnose, Rha)、D-葡萄糖醛酸(glycuronic acid, GlcUA)、D(+)-半乳糖醛酸(galactose-uronic acid, GalUA)、NANA、PMP、乙腈和溴化鈉購于Sigma;透析袋(MWCO 8000-14000)(北京Solarbio科技有限公司);蛋白測(cè)定試劑盒購于Invitrogen;去離子水從Millipore 純水機(jī)獲??;其余試劑均為分析純。

    Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(粒徑5 μm,4.6×250 mm)(Agilent);2695型高效液相色譜儀(Waters);Laboroto-4002型低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph);TDL-5000B型低速冷凍離心機(jī)(中國上海嘉鵬科技有限公司);3K30型高速冷凍離心機(jī)(Sigma);Optima L-80XP型超速離心機(jī)(Beckman);LC-MS/MS由島津 HPLC(LC-20AD、DGU-20A3脫氣機(jī)和SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器)、AB SCIEX的串聯(lián)質(zhì)譜儀(4000 QTRAP)和PEAK牌氮?dú)獍l(fā)生器(ABN2ZA)組成。

    2 方法

    2.1脂蛋白分離 健康人(平均年齡52.5歲)及糖尿病患者(平均年齡51.8歲)血漿樣本采集于空腹12 h之后的早餐前,抗凝血液經(jīng)1 000×g離心15 min獲得血漿,定量移入離心管,采用溴化鈉固體調(diào)節(jié)密度至1.006,充N2,封口,10 ℃下40 000 r/min離心24 h,取上層極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein, VLDL);下層采用溴化鈉固體調(diào)節(jié)密度至1.063,10 ℃下40 000 r/min離心48 h,獲得低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL);余下液體采用溴化鈉固體調(diào)密度至1.21,10 ℃下40 000 r/min離心48 h,得高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)。脂蛋白經(jīng)透析,充N2,封口備用。

    2.2單糖組成分析 分別精密稱取適量的Man、GlcN、Rha、GlcUA、GalUA、GlcNAc、Glc、Gal、Ara和Fuc等10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品,加去離子水配制成100 mmol/L的單糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。衍生過程及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作等詳見參考文獻(xiàn)[7]。色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(粒徑5 μm,4.6×250 mm);流動(dòng)相:0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液/乙腈 (82∶18,V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫,30 ℃;紫外檢測(cè)波長:245 nm。脂蛋白經(jīng)4 μmol/L三氟乙酸于120 ℃酸水解5 h,低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除三氟乙酸。所得單糖混合物采用PMP柱前衍生。將樣品色譜峰面積代入相應(yīng)單糖的回歸方程即可得出各脂蛋白單糖構(gòu)成的摩爾比例。

    脂蛋白唾液酸的分析采用LC-MS/MS分析。取20 μg脂蛋白樣本加入pH=2的醋酸溶液200 μL,80 ℃下水解2 h,所得水解液加4倍甲醇沉淀蛋白,40 000×g離心20 min,0.22 μm濾膜過濾,濾出液進(jìn)行LC-MS/MS分析[8-9]。色譜柱為Waters C18分析柱(Waters Symmetry?, 外徑3.5 μm, 內(nèi)徑2.1 mm×100 mm);流動(dòng)相為含有4 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的5%的甲醇溶液;加樣體積為5.0 μL,流動(dòng)相流速為0.4 mL/min;質(zhì)譜采用電噴霧離子源的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)模式進(jìn)行,監(jiān)測(cè)離子對(duì)的m/z為308.1/86.7;溫度500 ℃,霧化氣、輔助氣和氣簾氣分別設(shè)定為55、55和20 psi,其中碰撞氣為中等(medium),在負(fù)離子模式下的噴霧電壓(ion-spray voltage)為-4 500V,碰撞能量為-16 eV,去簇電壓為-60 V。數(shù)據(jù)分析采用AB SCIEX 1.6分析軟件。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    完全酸水解樣品經(jīng)PMP衍生后,經(jīng)Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱分離衍生產(chǎn)物,采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。圖1A為10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)PMP柱前衍生后所得液相色譜圖,圖中的標(biāo)注以單糖名稱代指其衍生產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)中衍生引入雜質(zhì)的保留時(shí)間小于16 min,而單糖衍生物的保留時(shí)間在20 min以上,實(shí)現(xiàn)了衍生過程中引入的雜質(zhì)與樣品衍生產(chǎn)物之間的有效分離,即該法可有效分離哺乳動(dòng)物常見的中性、酸性和堿性單糖。健康人HDL(H-HDL)和糖尿病患者HDL(D-HDL)單糖組成如圖1B和C所示,可見HDL糖鏈由Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal構(gòu)成。如表1所示,采用LC-MS/MS法測(cè)定的H-HDL和D-HDL中NANA的含量分別為(2.14±0.12)和(3.53±0.27) mmol/(g protein)。如表1和圖1所示,H-HDL中Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal的含量依次為:(5.88±0.94)、(16.49±4.11)、(1.31±0.33)、(0.87±0.16)、(7.18±1.64) mmol/(g protein);D-HDL中Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal的含量依次為:(8.68±0.39)、(24.73±5.50)、(1.91±0.54)、(1.23±0.35)和(9.73±2.85) mmol/(g protein)??芍?,D-HDL中Glc和Gal的含量顯著升高(P<0.05),且Man、GlcN和NANA的含量較H-HDL上升更顯著(P<0.01)。

    LDL的單糖組成與HDL相同,如表1和圖2所示。采用LC-MS/MS法測(cè)定的H-HDL和D-HDL中NANA的含量分別為(6.86±0.11)和(6.45±0.18) mmol/(g protein)。H-LDL中Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal的含量依次為:(29.20±3.57)、(50.77±4.72)、(5.28±0.64)、(10.06±1.37)和(28.44±3.96) mmol/(g protein);D-LDL中Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal的含量依次為:(30.08±3.78)、(38.52±6.38)、(3.79±0.78)、(7.63±1.50)和(20.05±2.63) mmol/(g protein)。經(jīng)比對(duì)分析,可知D-LDL較H-LDL中GlcN和Gal含量顯著下降(P<0.05),同時(shí)GlcNAc、Glc和NANA含量均有所下降,但無顯著差異。

    VLDL由Man、GlcN、Glc、Gal和NANA構(gòu)成,如表1和圖3所示。采用LC-MS/MS法測(cè)定的H-VLDL和D-VLDL中NANA的含量分別為(2.95±0.24)和(4.42±0.15) mmol/(g protein)。H-VLDL中Man、GlcN、Glc和Gal的含量依次為:(91.21±4.12)、(27.05±2.34)、(4 230.95±15.83)、(43.40±3.75) mmol/(g protein);D-VLDL中Man、GlcN、Glc和Gal的含量依次為:(82.40±0.51)、(30.16±0.32)、(4 722.73±93.27)、(34.05±2.81) mmol/(g protein)??芍狣-VLDL較H-VLDL中的NANA含量顯著上升(P<0.01),而Gal的含量也顯著升高(P<0.05)。此外,VLDL的單糖組成色譜圖中存在一無法歸屬的色譜峰。

    表1 健康人和糖尿病患者血漿脂蛋白單糖組成

    *P<0.05,**P<0.01vsH-group.

    Figure 1. Typical chromatograms of 10 kinds of monosaccharide standards and the HDL samples after complete acid hydrolysis. A: typical chromatogram of 10 kinds of monosaccharide standards after PMP derivatization; B: monosaccharide composition of the HDL from healthy participants after acid hydrolysis; C: monosaccharide composition of the HDL from diabetic patients after acid hydrolysis.

    討 論

    由于糖基之間連接位點(diǎn)的復(fù)雜性,糖結(jié)構(gòu)的研究一直是生物化學(xué)研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著質(zhì)譜的發(fā)展,LC-MS/MS已成功應(yīng)用于多種疾病相關(guān)分子的檢測(cè),為探討疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了必不可少的技術(shù)手段[10]。本文采用PMP柱前衍生法建立了測(cè)定脂蛋白樣本單糖組成的方法,該法可將脂蛋白上的中性和堿性單糖完全分離,實(shí)現(xiàn)定量分析;同時(shí)結(jié)合液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)脂蛋白上的唾液酸含量。本研究結(jié)果顯示,糖尿病患者脂蛋白上糖基化修飾與健康人相比發(fā)生了顯著改變,而每種脂蛋白單糖組成的改變情況不同。如表1所示,糖尿病患者HDL的糖基化修飾程度較同齡健康人HDL升高達(dá)35.52%;糖尿病患者LDL的GlcN和Gal的糖基化修飾程度下降24.13%;糖尿病患者VLDL的Gal糖基化修飾下降達(dá)21.54%,但NANA含量升高達(dá)49.83%。本團(tuán)隊(duì)正在借助陰離子交換柱層析、凝膠柱層析和高分辨串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)手段開展糖尿病患者與健康人脂蛋白糖基化差異的精細(xì)研究。

    Figure 2. Typical chromatograms of the LDL samples after complete acid hydrolysis and PMP derivatization. A: monosaccharide composition of the LDL from healthy participants after acid hydrolysis; B: monosaccharide composition of the LDL from diabetic patients after acid hydrolysis.

    已有研究表明,脂蛋白上大約50%的負(fù)電荷是由唾液酸提供的。糖尿病患者HDL和VLDL唾液酸含量較之健康人顯著升高(P<0.01),而糖尿病患者LDL唾液酸含量卻有所下降。脂蛋白,特別是HDL糖基化修飾改變勢(shì)必影響HDL的抗氧化、抗炎癥[11]和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。我們尚未發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示,NANA具有抗氧化功能,在清除DPPH自由基、·OH自由基和對(duì)抗H2O2等方面具有較好的生物活性,上述研究結(jié)果與先前報(bào)道一致[12-14]。氧化應(yīng)激伴隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展[15],因此,氧化應(yīng)激可能對(duì)脂蛋白的糖基化產(chǎn)生重要影響。已有研究表明,在心血管疾病狀態(tài)下,肝臟會(huì)產(chǎn)生大量唾液酸化的糖蛋白,且伴隨唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的顯著升高。據(jù)此,可以假設(shè)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體為了保護(hù)脂蛋白等顆粒或細(xì)胞的正常功能,產(chǎn)生富唾液酸化的糖蛋白,一方面增強(qiáng)自身抗氧化功能,另一方面唾液酸提供的負(fù)電荷可有效保護(hù)血管內(nèi)脂蛋白之間以及脂蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附和蓄積。另有研究顯示,LDL的去唾液酸化或經(jīng)甘露糖苷酶水解處理后,可讓LDL中的膽固醇蓄積[16-18]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以推測(cè)糖尿病患者較同齡健康人LDL的去唾液酸化可能是糖尿病患者易發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的誘發(fā)因素之一。

    Figure 3. Typical chromatograms of the VLDL samples after complete acid hydrolysis and PMP derivatization. A: monosaccharide composition of the VLDL from diabetic patients after acid hydrolysis; B: monosaccharide composition of the VLDL from healthy participants after acid hydrolysis.

    [參 考 文 獻(xiàn)]

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