• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高脂血癥大鼠主動脈HSP22、TNF-α和eNOS的表達及阿托伐他汀的影響*

    2014-08-13 12:12:32方海洋吳延慶程曉曙
    中國病理生理雜志 2014年10期
    關鍵詞:棕黃色高脂高脂血癥

    方海洋, 陳 琦, 項 建, 吳延慶, 程曉曙

    (南昌大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科,江西 南昌 330006)

    熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類應激蛋白,因其與熱應激有關故冠名HSPs,它們屬于進化上較為保守的蛋白家族。 HSP22為一種絲/蘇氨酸激酶,分子量21.6 kD,又稱為HSPB8和H11,屬于小HSP家族成員,廣泛分布于哺乳動物的各種組織中,尤其是肌肉相關性組織[1]。早期研究表明高脂環(huán)境刺激下內(nèi)皮細胞HSP70的表達明顯升高,并證明對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)有保護作用[2]。Ghayour-Mobarhan等[3]發(fā)現(xiàn)他汀可以降低脂質(zhì)代謝紊亂患者HSP60、HSP65和HSP70抗體滴度,可能與他汀調(diào)脂外的抗炎及免疫調(diào)節(jié)等保護作用有關。最近有報道他汀可使高脂血癥小鼠血清HSP70抗體滴度降低而使HSP90抗體滴度升高[4]。高脂環(huán)境下動脈HSP的表達究竟如何,因HSP家族成員眾多,且實驗條件均不可能完全相同,尚無統(tǒng)一定論。目前HSP22與高脂血癥的研究甚少,高脂血癥環(huán)境下HSP22的表達如何尚不明確,他汀的干預下,HSP22的表達情況亦不清楚。本研究通過復制高脂血癥大鼠模型,主要探究高脂血癥時大鼠主動脈HSP22的表達,同時觀察高脂血癥時內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的表達和阿托伐他汀干預對其的影響。

    材 料 和 方 法

    1 動物與材料

    18只7周齡、體重180~210 g的SPF級雄性SD大鼠(實驗動物合格證號為0109526)及高脂飼料(配方:1%膽固醇、5%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽、5%砂糖、0.1%丙基硫氧嘧啶和78.7%基礎飼料)由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。HSP22 Ⅰ抗購于Abnova;TNF-α Ⅰ抗購于Abcam;eNOSⅠ抗購于Signalway Antibody;阿托伐他汀鈣片購于北京嘉林藥業(yè)股份有限公司;維生素D3注射液購于上海通用藥業(yè)股份公司;甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒和總膽固醇(total cholesterol,TC)試劑盒均購自浙江伊利康生物技術(shù)公司;低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)試劑盒和高密度脂蛋白試膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)劑盒均購自北京北化康泰臨床試劑公司;免疫組化試劑盒購自博士德生物技術(shù)公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物科技研究所。

    2 主要方法

    2.1高脂血癥模型的建立及實驗分組 將上述18只SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d,禁食不禁水12 h,眼眶后靜脈叢采血1 mL左右,制備血清,參照試劑盒方法測定大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平觀察其基礎值;18只大鼠隨機分為正常對照組4只和模型組14只,正常對照組給予基礎飼料,模型組給予高脂飼料喂養(yǎng),同時按照7×105U/kg體重的劑量腹腔注射維生素D3注射液(分3 d注射,1次/d)[5],連續(xù)喂飼10周,于末次喂飼后禁食不禁水12 h,再次測定大鼠血脂水平并與造模前的血脂結(jié)果比較,確定是否建成高脂血癥模型。造模成功后模型組大鼠隨機分為高脂對照組8只和他汀干預組6只。正常對照組繼續(xù)喂飼基礎飼料,高脂對照組喂飼高脂飼料,他汀干預組則在喂飼高脂飼料基礎上,同時給予阿托伐他汀2 mg/kg灌胃,其它各組則給予同體積生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)喂飼及灌胃21周。干預結(jié)束后,3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射全身麻醉,腹主動脈取血,離心分離血清,一部分用于檢測血脂水平,一部分-80 ℃留存?zhèn)溆谩H⊙笱杆僬〈笫笾鲃用},一半于4%多聚甲醛固定,一半液氮速凍。

    2.2主動脈組織切片制作及HE染色 經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h的主動脈組織,經(jīng)修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后,每條主動脈行4 μm厚連續(xù)石蠟切片5張,2張用于HE染色,選擇染色較好的用Olympus BX41顯微鏡拍照。余下3張用于免疫組織化學染色。

    2.3免疫組織化學染色 參照試劑盒方法步驟檢測大鼠主動脈HSP22、TNF-α的表達。HSP22 Ⅰ抗?jié)舛葹?∶200,TNF-αⅠ抗?jié)舛葹?∶200。陽性染色為明顯高于背景的棕黃色染色。根據(jù)以下標準將陽性染色分為4級:-:無明顯高于背景的棕黃色染色;+:陽性染色少于10%;++:介于弱陽性與強陽性標準之間;+++:陽性染色60%以上。染色較好的用OlympusBX41顯微鏡拍照。

    2.4免疫印跡法檢測eNOS的表達 從液氮中取出主動脈經(jīng)勻漿后,經(jīng)BCA法蛋白定量,取相同數(shù)量的蛋白樣品進行SDS-PAGE,并電轉(zhuǎn)移至NC膜上。用5%脫脂奶粉(用PBS稀釋)室溫封閉30 min,分別滴加1∶500工作濃度的兔抗鼠Ⅰ抗eNOS或GAPDH抗體4 ℃孵育膜過夜。1∶5 000羊抗兔Ⅱ抗37 ℃反應1 h,洗膜后用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶Gelpro32軟件分析數(shù)據(jù)。

    3 統(tǒng)計學處理

    用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組間比較若方差齊用方差分析,方差不齊用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1 一般情況及血脂水平

    高脂飼料喂飼后,模型組大鼠出現(xiàn)拒食,先后有3只大鼠死亡。高脂飼料誘導10周后,與正常對照組比較,高脂模型組大鼠血清TC和LDL-C水平均明顯升高,升高幅度分別為正常對照組的1.6倍(3.54±0.33vs2.15±0.33,P<0.05)和1.9倍(1.98±0.18vs1.03±0.30,P<0.05),而血清TG與HDL-C水平無顯著變化,形成了高膽固醇血癥。

    他汀干預期間,高脂對照組大鼠先后有2只大鼠分別于第14周和第20周處死用于觀察大鼠主動脈病變程度,他汀干預組大鼠有1只死亡。至他汀干預結(jié)束時,血清TC和LDL-C水平:高脂對照組分別為正常對照組5.2倍(P<0.01)和8.0倍(P<0.01);他汀干預組分別為正常對照組3.6倍(P<0.01)和5.8倍(P<0.01),均顯著低于高脂對照組。血清TG水平:與正常對照組相比高脂對照組及他汀干預組均無明顯升高(P>0.05)。血清HDL-C水平:他汀干預組為正常對照組的2.1倍(P<0.05);高脂對照組為正常對照組的1.9倍(P<0.05)。他汀干預組與高脂對照組相比無顯著差異(P>0.05),見表1。

    表1 阿托伐他汀干預前及干預14周和21周大鼠血脂情況

    *P<0.05,**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsHF (high fat).

    2 大鼠主動脈病理變化

    阿托伐他汀干預21周后,處死所有大鼠。正常對照組大鼠主動脈鏡下均未見病理改變,見圖1A。高脂對照組大鼠主動脈管腔明顯不規(guī)則,管壁厚薄不均,內(nèi)膜部分破壞,中膜層排列紊亂,彈性纖維結(jié)構(gòu)不清,可見明顯鈣化病變,未見脂質(zhì)沉積和泡沫細胞聚集,部分可見軟骨樣細胞增生,見圖1B箭頭所示。他汀干預組大鼠主動脈管腔不規(guī)則,管壁厚薄不均,內(nèi)膜、中膜見明顯鈣化,彈性纖維結(jié)構(gòu)明顯不清,與高脂對照組比較略有改善,見圖1C。模型觀察大鼠于第14周處死后觀察主動脈病理變化,無典型動脈粥樣硬化改變(圖1D),故各組繼續(xù)按原方案進行。

    3 主動脈HSP22的表達

    正常對照組大鼠胸主動脈管壁均未見HSP22陽性表達,見圖2A;高脂對照組大鼠胸主動脈管壁可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色,主要較集中分布在中膜,部分散在分布于內(nèi)膜,見圖2B箭頭所示;他汀干預組大鼠胸主動脈管壁可見呈線狀分布的棕黃色陽性著色,主要位于中膜,棕黃色著色較高脂對照組稍淺,見圖2C箭頭所示。他汀干預組平均吸光度值明顯低于高脂對照組(0.211±0.014vs0.345±0.042,P<0.05),見圖2D。

    Figure 1. Representative sections of HE staining of rat aortas(×200).A: normal control group (20 weeks); B: HF group (20 weeks);C: HF+ATV group (20 weeks);D: HF observation rat (14 weeks).

    Figure 2. The expression of HSP22 protein in the aorta of rats (immunohistochemistry, ×400). A: normal control group; B: HF group; C: HF+ATV group; D: statistical bar graph indicates the result of mean optical density of positive particles in each group.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs HF.

    4 主動脈TNF-α的表達

    正常對照組大鼠胸主動脈中膜和內(nèi)膜未見TNF-α陽性表達,外膜可見棕黃色著色,見圖3A;高脂對照組大鼠胸主動脈外膜可見棕黃色著色,同時中膜、內(nèi)膜可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色,見圖3B箭頭所示;他汀干預組大鼠胸主動脈外膜可見棕黃色著色,同時中膜、內(nèi)膜可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色,見圖3C箭頭所示。他汀干預組平均吸光度值明顯低于高脂對照組(0.218±0.090vs0.377±0.094,P<0.05),見圖3D。

    Figure 3. The expression of TNF-α protein in the aorta of rats (immunohistochemistry, ×400).A: normal control group; B: HF group; C: HF+ATV group; D: statistical bar graph indicates the result of mean density of positive particles in each group.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs HF.

    5 主動脈eNOS的表達

    經(jīng)高脂飲食干預后大鼠主動脈eNOS的表達較正常對照組明顯降低(0.968±0.168vs0.126±0.130,P<0.01),形成高脂血癥后給予阿托伐他汀干預21周,他汀干預組大鼠主動脈eNOS的表達仍明顯低于正常對照組(0.968±0.168vs0.202±0.177,P<0.01),他汀干預組eNOS表達水平略高于高脂對照組,但差異無顯著(P>0.05),見圖4。

    Figure 4. The expression of eNOS protein in the aorta of rats.Mean±SD.n=4. *P<0.05 vs normal control.

    討 論

    動脈是構(gòu)成循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分,并在一系列應激反應如局部的損傷、毒物、吸煙和高脂血癥形成過程中不斷變化,這些刺激直接或間接導致血壓升高和血管壁的損傷,并可進一步導致血管僵硬度增加和形成動脈硬化,機體為了在各種應激條件下存活,為了維持血管壁的穩(wěn)態(tài),內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞等血管壁細胞會產(chǎn)生大量的HSP而對抗應激狀態(tài)下的血管損傷[6-7]。新近研究發(fā)現(xiàn)人內(nèi)皮細胞在高脂血癥患者血清刺激下形成了內(nèi)皮源性泡沫細胞,并出現(xiàn)HSP27、HSP70和HSP90高表達[8]。

    目前,尚未發(fā)現(xiàn)HSP22與高脂血癥的相關研究。本研究中我們參考前人的經(jīng)驗[5]成功復制出高脂血癥大鼠模型,發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠主動脈HSP22的表達較正常對照組高,與其它HSP成員如HSP27、HSP70在高脂環(huán)境下表達升高呈一致的現(xiàn)象[8]。同時,高脂血癥大鼠主動脈TNF-α的表達較正常對照組高,eNOS的表達則較正常對照組低。TNF-α表達水平上調(diào)可導致血管內(nèi)皮細胞的功能損害而下調(diào)eNOS的表達[9]。TNF-α可誘導血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)化、遷移、增殖和凋亡,而這些改變在血管損傷的形成和進展中均起著關鍵作用[10-11]。而本研究HE染色結(jié)果顯示高脂血癥大鼠主動脈管腔明顯不規(guī)則,管壁厚薄不均,內(nèi)膜部分破壞,中膜層排列紊亂,彈性纖維結(jié)構(gòu)不清,可見明顯鈣化病變,呈現(xiàn)出明顯的血管損傷改變。推測HSP22表達的升高很可能是一種對血管損傷的炎癥性刺激的保護性反應,需進一步研究以證實。

    阿托伐他汀目前廣泛應用于高膽固醇血癥、冠心病的預防和治療,是膽固醇合成限速酶羥甲基-戊二酸單酰輔酶還原酶抑制劑,能明顯降低心血管死亡[12]。他汀類藥物除有效調(diào)脂作用外,還具有抑制炎癥反應,抗氧化應激,降低血小板活性及改善內(nèi)皮功能等多重調(diào)脂外作用[13]。本研究中阿托伐他汀干預后血脂的變化與他汀類藥物主要降低LDL-C和TC水平,輕度升高HDL-C水平的作用相一致。

    阿托伐他汀干預后,大鼠主動脈HSP22的表達較高脂對照組明顯降低。Ghayour-Mobarhan等[3]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀和阿托伐他汀都可降低脂質(zhì)代謝紊亂患者血清熱休克蛋白60、65、70抗體滴度。同時血清C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)濃度也均明顯降低,但他汀對HSP抗體滴度的影響與CRP濃度的改變并不具有相關性,提示他汀使HSP抗體滴度降低的作用并不能完全以其抗炎癥反應進行解釋,而可能存在其它的免疫相關調(diào)節(jié)機制。本研究中,阿托伐他汀干預后TNF-α的表達較高脂對照組明顯降低,eNOS的表達則略有升高,表明阿托伐他汀干預后血管炎癥反應已有所抑制,但內(nèi)皮功能尚未能完全恢復。Zhang等[14]進行的研究中阿托伐他汀干預組自實驗開始即給予他汀,共干預30 d,大鼠主動脈eNOS表達明顯較高脂組高(P<0.05),與正常對照組無明顯差異,血管內(nèi)皮功能明顯恢復。而本研究則是形成明顯高脂血癥后再行阿托伐他汀干預,未能明顯恢復血管內(nèi)皮功能。HE結(jié)果顯示他汀干預組與高脂對照組的差異并不十分顯著,他汀干預組依然存在明顯的血管損傷,這與eNOS的表達未見明顯升高呈一致表現(xiàn),如能早期進行他汀干預,可能更好地保護血管內(nèi)皮功能。阿托伐他汀是否通過HSP22途徑抑制血管炎癥,恢復內(nèi)皮功能,本研究尚不能闡明。在內(nèi)皮功能尚未完全恢復下,阿托伐他汀干預后HSP22及TNF-α的表達均降低,通過何種機制實現(xiàn)的亦有待進一步探索。

    本研究屬于觀察性探索,首次發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠主動脈HSP22表達升高,阿托伐他汀的干預可降低HSP22的表達。本研究的對象為SD大鼠,形成的高脂血癥中TG水平變化不明顯,分析可能與外源性TG攝取后在血液中主要以乳糜微粒形式存在、代謝較快有關。參照前人的造模方法成功復制高脂血癥模型,但未形成典型的動脈粥樣硬化病變,大鼠動脈硬化以血管的鈣化病變?yōu)橹饕憩F(xiàn),形成了Monckeberg型動脈硬化,研究提示大劑量的維生素D3可能通過誘導平滑肌細胞氧化應激,加速平滑肌細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化等復雜機制促進血管鈣化病變形成[15]。本研究中主動脈HSP22及TNF-α的陽性表達均成線狀或點狀分布,具體機制尚不明確,分析可能與血管鈣化病變形成,管壁中正常的細胞被鈣化物質(zhì)取代有關。故后續(xù)進行HSP22在高脂血癥中的具體機制研究時需進一步完善研究方案,減少可能的干擾因素。所選用的動物數(shù)量偏少,可能對實驗結(jié)果有一定影響。

    [參 考 文 獻]

    [1]KimMV,Seit-NebiAS,MarstonSB,etal.SomepropertiesofhumansmallheatshockproteinHsp22 (H11orHspB8)[J].BiochemBiophysResCommun, 2004, 315(4):796-801.

    [2] Zhu W, Roma P, Pirillo A, Angela P, et al. Human endothelial cells exposed to oxidized LDL express hsp70 only when proliferating[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1996, 16(9):1104-1111.

    [3]Ghayour-MobarhanM,LambDJ,VaidyaN,etal.Heatshockproteinantibodytitersarereducedbystatintherapyindyslipidemicsubjects:apilotstudy[J].Angiology, 2005, 56(1):61-68.

    [4] Uyy E, Ivan L, Boteanu RM, et al. High-fat diet alters protein composition of detergent-resistant membrane microdomains[J]. Cell Tissue Res, 2013, 354(3):771-781.

    [5] 趙 娟,李相軍,孫 波,等. 維生素D3聯(lián)合高脂飼料建立大鼠動脈粥樣硬化模型[J]. 實用醫(yī)學雜志,2009, 25(21):3569-3571.

    [6] Xu Q. Biomechanical-stress-induced signaling and gene expression in the development of arteriosclerosis[J]. Trends Cardiovasc Med, 2000, 10(1): 35-41.

    [7]XuQ.Disturbedflow-enhancedendothelialturnoverinatherosclerosis[J].TrendsCardiovascMed, 2009, 19(6):191-195.

    [8] Ivan L, Antohe F. Hyperlipidemia induces endothelial-derived foam cells in culture[J]. J Recept Signal Transduct Res, 2010, 30(2):106-114.

    [9]BayramgurlerD,KarsonA,YazirY,etal.Theeffectofetanerceptonaorticnitricoxide-dependentvasorelaxationinanunpredictablechronic,mildstressmodelofdepressioninrats[J].EurJPharmacol,2013, 710(1-3):67-72.

    [10] Stintzing S, Ocker M, Hartner A, et al. Differentiation patterning of vascular smooth muscle cells (VSMC) in atherosclerosis[J]. Virchows Arch, 2009, 455(2):171-185.

    [11]ChuWM.Tumornecrosisfactor[J].CancerLett, 2013, 328(2):222-225.

    [12] Baigent C, Keech A, Kearney PM, et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins[J]. Lancet, 2005, 366(9493):1267-1278.

    [13]BeowskiJ,A.ModulationofH2Smetabolismbystatins:anewaspectofcardiovascularpharmacology[J].AntioxidRedoxSignal, 2012, 17(1):81-94.

    [14] Zhang R, Niu H, Wang N, et al. Daming capsule restores endothelial dysfunction induced by high-fat diet[J]. BMC Complement Altern Med, 2012, 12:21

    [15]McCartyMF,DiNicolantonioJJ.Themolecularbiologyandpathophysiologyofvascularcalcification[J].PostgradMed, 2014,126(2):54-64.

    猜你喜歡
    棕黃色高脂高脂血癥
    你真的認識蝗蟲嗎
    細微之處顯本真
    化學教與學(2022年7期)2022-04-02 21:55:32
    高脂血標本對臨床檢驗項目的干擾及消除對策
    運動降低MG53表達及其在緩解高脂膳食大鼠IR中的作用
    高脂血癥對生化檢驗項目的干擾及消除
    食物不耐受與高脂血癥的關系
    高脂飲食誘導大鼠生精功能障礙
    社區(qū)健康促進模式降低老年高脂血癥的效果
    味精與高脂日糧對生長豬胴體性狀與組成的影響
    長爪沙鼠高脂血癥的初步研究
    国产精品伦人一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久99蜜桃精品久久| 国产毛片在线视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产淫片久久久久久久久| 国产男女内射视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产成人一区二区在线| 欧美成人午夜免费资源| 我要看黄色一级片免费的| 九色成人免费人妻av| 日韩伦理黄色片| h视频一区二区三区| 亚洲,一卡二卡三卡| av福利片在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美精品亚洲一区二区| 高清欧美精品videossex| 水蜜桃什么品种好| 特大巨黑吊av在线直播| 中文字幕制服av| 婷婷色av中文字幕| 免费看日本二区| 人妻系列 视频| 久久午夜福利片| 大香蕉97超碰在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 大片免费播放器 马上看| 深爱激情五月婷婷| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 只有这里有精品99| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产av一区二区精品久久 | 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩欧美 国产精品| 国产伦在线观看视频一区| 国产爽快片一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 黄片无遮挡物在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成人特级av手机在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成年av动漫网址| 精品一品国产午夜福利视频| 看免费成人av毛片| 亚洲欧美精品专区久久| 国产精品免费大片| 一本久久精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产伦理片在线播放av一区| 直男gayav资源| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲不卡免费看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 伦精品一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 99热国产这里只有精品6| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产黄片视频在线免费观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av免费观看日本| 日本免费在线观看一区| 十八禁网站网址无遮挡 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产亚洲一区二区精品| 一本一本综合久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 日韩av免费高清视频| 日韩伦理黄色片| av在线观看视频网站免费| 熟女电影av网| 亚洲最大成人中文| 午夜视频国产福利| av在线app专区| 香蕉精品网在线| 国产精品一区www在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 久久国内精品自在自线图片| 综合色丁香网| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲av.av天堂| 黄片wwwwww| 午夜日本视频在线| 熟女电影av网| 久久久久久久久久久免费av| 久久av网站| 国产综合精华液| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久亚洲精品成人影院| 大陆偷拍与自拍| 亚洲国产日韩一区二区| 久久这里有精品视频免费| 亚洲图色成人| 韩国高清视频一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 天天躁日日操中文字幕| 一级二级三级毛片免费看| 一边亲一边摸免费视频| 国产综合精华液| 亚洲精品日本国产第一区| 91在线精品国自产拍蜜月| 丰满乱子伦码专区| 亚洲国产欧美在线一区| 精品国产三级普通话版| av在线观看视频网站免费| 国产高潮美女av| 夫妻性生交免费视频一级片| 内射极品少妇av片p| 午夜视频国产福利| 夜夜爽夜夜爽视频| av线在线观看网站| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产爽快片一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类| 国产在视频线精品| 毛片一级片免费看久久久久| 青青草视频在线视频观看| 中文字幕久久专区| 晚上一个人看的免费电影| 久久久久国产精品人妻一区二区| 最近手机中文字幕大全| 美女内射精品一级片tv| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美一区二区亚洲| 久久久精品94久久精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚州av有码| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 日本午夜av视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 我的老师免费观看完整版| 亚洲第一区二区三区不卡| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产黄片美女视频| h日本视频在线播放| 黄色配什么色好看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| freevideosex欧美| 亚洲欧洲日产国产| av卡一久久| 婷婷色av中文字幕| 国产在线男女| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一级a做视频免费观看| 亚洲av免费高清在线观看| av在线老鸭窝| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 毛片女人毛片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品视频人人做人人爽| 国产高清不卡午夜福利| 高清日韩中文字幕在线| 我要看黄色一级片免费的| 国产高清三级在线| 永久免费av网站大全| 亚洲国产欧美在线一区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲国产精品一区三区| 中国三级夫妇交换| xxx大片免费视频| 亚洲内射少妇av| 国产精品欧美亚洲77777| 男女边吃奶边做爰视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 青青草视频在线视频观看| 久久99热这里只频精品6学生| 国产黄片视频在线免费观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品久久久久久久电影| 久久精品国产a三级三级三级| 午夜精品国产一区二区电影| 如何舔出高潮| 能在线免费看毛片的网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲欧洲国产日韩| av免费在线看不卡| 久久久久视频综合| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美国产精品一级二级三级 | 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲自偷自拍三级| 国产精品三级大全| 亚洲国产精品一区三区| 久久青草综合色| 亚洲成人手机| 日韩免费高清中文字幕av| 2021少妇久久久久久久久久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费黄色在线免费观看| 干丝袜人妻中文字幕| 中文字幕制服av| 中文在线观看免费www的网站| 成人综合一区亚洲| av视频免费观看在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美最新免费一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 22中文网久久字幕| 久久久午夜欧美精品| 深夜a级毛片| 一区二区av电影网| 午夜激情久久久久久久| 在线观看国产h片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 好男人视频免费观看在线| 一本一本综合久久| 日韩一区二区三区影片| 国产精品蜜桃在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日韩电影二区| 尾随美女入室| 黄色日韩在线| av在线蜜桃| 只有这里有精品99| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 各种免费的搞黄视频| 搡老乐熟女国产| 国产精品久久久久久av不卡| 精品久久久精品久久久| 51国产日韩欧美| 国产v大片淫在线免费观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| h视频一区二区三区| 国产精品99久久久久久久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲天堂av无毛| 久久久久视频综合| 国产精品女同一区二区软件| 97热精品久久久久久| a 毛片基地| 99热这里只有精品一区| 日本欧美视频一区| 在线精品无人区一区二区三 | 美女福利国产在线 | 一级爰片在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 插逼视频在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产精品av视频在线免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲国产最新在线播放| 国产成人aa在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 国产在线一区二区三区精| 国产午夜精品一二区理论片| 女人久久www免费人成看片| 国产成人精品久久久久久| 精品人妻视频免费看| 精品午夜福利在线看| av国产精品久久久久影院| 日韩亚洲欧美综合| 美女视频免费永久观看网站| av在线老鸭窝| 久久精品国产亚洲av涩爱| 三级国产精品欧美在线观看| 日韩中字成人| 亚洲国产欧美人成| 91精品国产国语对白视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲国产精品国产精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本免费在线观看一区| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲av福利一区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美成人午夜免费资源| 国产又色又爽无遮挡免| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 2018国产大陆天天弄谢| av卡一久久| 欧美丝袜亚洲另类| 黄色欧美视频在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 久久精品人妻少妇| av免费在线看不卡| 国产黄片视频在线免费观看| 国产美女午夜福利| 老女人水多毛片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 中文字幕av成人在线电影| 七月丁香在线播放| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩 亚洲 欧美在线| 高清在线视频一区二区三区| 国产精品99久久久久久久久| 欧美精品一区二区大全| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久ye,这里只有精品| 日本一二三区视频观看| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品一二三| 男女免费视频国产| 99久久精品热视频| 久久99热这里只频精品6学生| 久久精品夜色国产| 国产成人a区在线观看| 久久久欧美国产精品| 免费观看在线日韩| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久久久人妻精品一区果冻| 毛片女人毛片| 伊人久久国产一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜福利在线在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲欧美清纯卡通| av线在线观看网站| 黄色配什么色好看| 亚洲精品,欧美精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 性色avwww在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 伦精品一区二区三区| 久久久亚洲精品成人影院| 大码成人一级视频| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩国内少妇激情av| 久久久亚洲精品成人影院| 国产成人精品婷婷| 国产精品久久久久成人av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人免费观看视频高清| 精华霜和精华液先用哪个| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 在线天堂最新版资源| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久青草综合色| 性色av一级| 亚洲国产精品999| 国产亚洲5aaaaa淫片| 男女国产视频网站| 欧美精品亚洲一区二区| 黄色欧美视频在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 亚州av有码| 高清欧美精品videossex| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 黄色日韩在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日韩成人伦理影院| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产精品欧美亚洲77777| 精品人妻熟女av久视频| av专区在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一级a做视频免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| a级一级毛片免费在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| av天堂中文字幕网| 一级毛片 在线播放| 最近手机中文字幕大全| 少妇精品久久久久久久| 国产免费福利视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 色哟哟·www| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 欧美精品一区二区大全| 免费av中文字幕在线| 99热全是精品| 在线精品无人区一区二区三 | 少妇熟女欧美另类| 国产成人一区二区在线| av免费观看日本| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久精品国产a三级三级三级| 色网站视频免费| 在线观看三级黄色| 精品人妻熟女av久视频| 欧美高清成人免费视频www| 日本与韩国留学比较| 久久99热这里只频精品6学生| 熟妇人妻不卡中文字幕| 夫妻性生交免费视频一级片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 深爱激情五月婷婷| 中文字幕制服av| av播播在线观看一区| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜免费男女啪啪视频观看| 一区二区三区精品91| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费观看在线日韩| 免费av中文字幕在线| 性色av一级| 网址你懂的国产日韩在线| 97超视频在线观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲国产精品999| 国内揄拍国产精品人妻在线| 最近手机中文字幕大全| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 嫩草影院新地址| 新久久久久国产一级毛片| 国产高潮美女av| 一级毛片久久久久久久久女| 内地一区二区视频在线| 欧美xxⅹ黑人| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | av卡一久久| 国产色婷婷99| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 午夜免费鲁丝| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品.久久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 最近手机中文字幕大全| 欧美变态另类bdsm刘玥| 观看av在线不卡| 国内精品宾馆在线| 国产伦理片在线播放av一区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 婷婷色综合www| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲av成人精品一二三区| 久久久久网色| 国产一区二区三区综合在线观看 | www.色视频.com| 97精品久久久久久久久久精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久韩国三级中文字幕| 涩涩av久久男人的天堂| 婷婷色麻豆天堂久久| 99久久综合免费| 人妻 亚洲 视频| 亚洲av成人精品一二三区| 人妻少妇偷人精品九色| www.av在线官网国产| 日韩av免费高清视频| 特大巨黑吊av在线直播| 身体一侧抽搐| av国产精品久久久久影院| 夜夜爽夜夜爽视频| 五月伊人婷婷丁香| 国产片特级美女逼逼视频| 免费看光身美女| 2018国产大陆天天弄谢| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩欧美 国产精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 日韩视频在线欧美| 国产黄频视频在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 人人妻人人看人人澡| 久久久久久伊人网av| 久久久久性生活片| 日本免费在线观看一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99热这里只有是精品50| av国产免费在线观看| 国产 精品1| 夫妻性生交免费视频一级片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| videos熟女内射| 亚洲美女黄色视频免费看| 五月天丁香电影| 三级经典国产精品| 中国国产av一级| 国产日韩欧美在线精品| 日韩中字成人| 国产精品一区www在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 在线观看国产h片| 国产成人精品一,二区| 99热国产这里只有精品6| 免费黄色在线免费观看| 高清午夜精品一区二区三区| 国产黄片视频在线免费观看| 午夜免费观看性视频| 草草在线视频免费看| 51国产日韩欧美| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产高清有码在线观看视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 色吧在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 2022亚洲国产成人精品| 在现免费观看毛片| 黄色日韩在线| 午夜免费鲁丝| 国产精品国产av在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费看日本二区| 亚洲精品视频女| 日韩亚洲欧美综合| 久久国产精品大桥未久av | 在线观看国产h片| 联通29元200g的流量卡| 美女国产视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 男人舔奶头视频| 毛片女人毛片| 色网站视频免费| 91久久精品国产一区二区成人| 熟女av电影| 国产精品免费大片| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产av新网站| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久亚洲精品成人影院| av不卡在线播放| 亚洲色图av天堂| 国产黄片视频在线免费观看| 熟女av电影| 欧美另类一区| 成人一区二区视频在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲高清免费不卡视频| 免费大片黄手机在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久欧美国产精品| 国产精品免费大片| 成人综合一区亚洲| 久久久成人免费电影| 成年av动漫网址| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久韩国三级中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 午夜免费观看性视频| 少妇的逼好多水| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久久伊人网av| 国产深夜福利视频在线观看| 少妇丰满av| 亚洲精品国产av蜜桃| 3wmmmm亚洲av在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一区在线观看完整版| 亚洲av综合色区一区| 亚洲美女黄色视频免费看| 日本黄色片子视频| 久久99精品国语久久久| 三级国产精品片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 麻豆乱淫一区二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久人人爽人人片av| 日日啪夜夜撸| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲av福利一区| 联通29元200g的流量卡| 国产精品免费大片| 久久久精品免费免费高清| 欧美另类一区| 蜜桃在线观看..| 国产精品精品国产色婷婷| 91狼人影院| 久久青草综合色| 少妇高潮的动态图| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品一区二区在线观看99| 国产av国产精品国产| 黄色一级大片看看| 大片免费播放器 马上看| 大陆偷拍与自拍| 性色avwww在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 |