• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高脂血癥大鼠主動脈HSP22、TNF-α和eNOS的表達及阿托伐他汀的影響*

    2014-08-13 12:12:32方海洋吳延慶程曉曙
    中國病理生理雜志 2014年10期
    關鍵詞:棕黃色高脂高脂血癥

    方海洋, 陳 琦, 項 建, 吳延慶, 程曉曙

    (南昌大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科,江西 南昌 330006)

    熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類應激蛋白,因其與熱應激有關故冠名HSPs,它們屬于進化上較為保守的蛋白家族。 HSP22為一種絲/蘇氨酸激酶,分子量21.6 kD,又稱為HSPB8和H11,屬于小HSP家族成員,廣泛分布于哺乳動物的各種組織中,尤其是肌肉相關性組織[1]。早期研究表明高脂環(huán)境刺激下內(nèi)皮細胞HSP70的表達明顯升高,并證明對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)有保護作用[2]。Ghayour-Mobarhan等[3]發(fā)現(xiàn)他汀可以降低脂質(zhì)代謝紊亂患者HSP60、HSP65和HSP70抗體滴度,可能與他汀調(diào)脂外的抗炎及免疫調(diào)節(jié)等保護作用有關。最近有報道他汀可使高脂血癥小鼠血清HSP70抗體滴度降低而使HSP90抗體滴度升高[4]。高脂環(huán)境下動脈HSP的表達究竟如何,因HSP家族成員眾多,且實驗條件均不可能完全相同,尚無統(tǒng)一定論。目前HSP22與高脂血癥的研究甚少,高脂血癥環(huán)境下HSP22的表達如何尚不明確,他汀的干預下,HSP22的表達情況亦不清楚。本研究通過復制高脂血癥大鼠模型,主要探究高脂血癥時大鼠主動脈HSP22的表達,同時觀察高脂血癥時內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的表達和阿托伐他汀干預對其的影響。

    材 料 和 方 法

    1 動物與材料

    18只7周齡、體重180~210 g的SPF級雄性SD大鼠(實驗動物合格證號為0109526)及高脂飼料(配方:1%膽固醇、5%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽、5%砂糖、0.1%丙基硫氧嘧啶和78.7%基礎飼料)由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。HSP22 Ⅰ抗購于Abnova;TNF-α Ⅰ抗購于Abcam;eNOSⅠ抗購于Signalway Antibody;阿托伐他汀鈣片購于北京嘉林藥業(yè)股份有限公司;維生素D3注射液購于上海通用藥業(yè)股份公司;甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒和總膽固醇(total cholesterol,TC)試劑盒均購自浙江伊利康生物技術(shù)公司;低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)試劑盒和高密度脂蛋白試膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)劑盒均購自北京北化康泰臨床試劑公司;免疫組化試劑盒購自博士德生物技術(shù)公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物科技研究所。

    2 主要方法

    2.1高脂血癥模型的建立及實驗分組 將上述18只SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d,禁食不禁水12 h,眼眶后靜脈叢采血1 mL左右,制備血清,參照試劑盒方法測定大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平觀察其基礎值;18只大鼠隨機分為正常對照組4只和模型組14只,正常對照組給予基礎飼料,模型組給予高脂飼料喂養(yǎng),同時按照7×105U/kg體重的劑量腹腔注射維生素D3注射液(分3 d注射,1次/d)[5],連續(xù)喂飼10周,于末次喂飼后禁食不禁水12 h,再次測定大鼠血脂水平并與造模前的血脂結(jié)果比較,確定是否建成高脂血癥模型。造模成功后模型組大鼠隨機分為高脂對照組8只和他汀干預組6只。正常對照組繼續(xù)喂飼基礎飼料,高脂對照組喂飼高脂飼料,他汀干預組則在喂飼高脂飼料基礎上,同時給予阿托伐他汀2 mg/kg灌胃,其它各組則給予同體積生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)喂飼及灌胃21周。干預結(jié)束后,3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射全身麻醉,腹主動脈取血,離心分離血清,一部分用于檢測血脂水平,一部分-80 ℃留存?zhèn)溆谩H⊙笱杆僬〈笫笾鲃用},一半于4%多聚甲醛固定,一半液氮速凍。

    2.2主動脈組織切片制作及HE染色 經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h的主動脈組織,經(jīng)修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后,每條主動脈行4 μm厚連續(xù)石蠟切片5張,2張用于HE染色,選擇染色較好的用Olympus BX41顯微鏡拍照。余下3張用于免疫組織化學染色。

    2.3免疫組織化學染色 參照試劑盒方法步驟檢測大鼠主動脈HSP22、TNF-α的表達。HSP22 Ⅰ抗?jié)舛葹?∶200,TNF-αⅠ抗?jié)舛葹?∶200。陽性染色為明顯高于背景的棕黃色染色。根據(jù)以下標準將陽性染色分為4級:-:無明顯高于背景的棕黃色染色;+:陽性染色少于10%;++:介于弱陽性與強陽性標準之間;+++:陽性染色60%以上。染色較好的用OlympusBX41顯微鏡拍照。

    2.4免疫印跡法檢測eNOS的表達 從液氮中取出主動脈經(jīng)勻漿后,經(jīng)BCA法蛋白定量,取相同數(shù)量的蛋白樣品進行SDS-PAGE,并電轉(zhuǎn)移至NC膜上。用5%脫脂奶粉(用PBS稀釋)室溫封閉30 min,分別滴加1∶500工作濃度的兔抗鼠Ⅰ抗eNOS或GAPDH抗體4 ℃孵育膜過夜。1∶5 000羊抗兔Ⅱ抗37 ℃反應1 h,洗膜后用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶Gelpro32軟件分析數(shù)據(jù)。

    3 統(tǒng)計學處理

    用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組間比較若方差齊用方差分析,方差不齊用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1 一般情況及血脂水平

    高脂飼料喂飼后,模型組大鼠出現(xiàn)拒食,先后有3只大鼠死亡。高脂飼料誘導10周后,與正常對照組比較,高脂模型組大鼠血清TC和LDL-C水平均明顯升高,升高幅度分別為正常對照組的1.6倍(3.54±0.33vs2.15±0.33,P<0.05)和1.9倍(1.98±0.18vs1.03±0.30,P<0.05),而血清TG與HDL-C水平無顯著變化,形成了高膽固醇血癥。

    他汀干預期間,高脂對照組大鼠先后有2只大鼠分別于第14周和第20周處死用于觀察大鼠主動脈病變程度,他汀干預組大鼠有1只死亡。至他汀干預結(jié)束時,血清TC和LDL-C水平:高脂對照組分別為正常對照組5.2倍(P<0.01)和8.0倍(P<0.01);他汀干預組分別為正常對照組3.6倍(P<0.01)和5.8倍(P<0.01),均顯著低于高脂對照組。血清TG水平:與正常對照組相比高脂對照組及他汀干預組均無明顯升高(P>0.05)。血清HDL-C水平:他汀干預組為正常對照組的2.1倍(P<0.05);高脂對照組為正常對照組的1.9倍(P<0.05)。他汀干預組與高脂對照組相比無顯著差異(P>0.05),見表1。

    表1 阿托伐他汀干預前及干預14周和21周大鼠血脂情況

    *P<0.05,**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsHF (high fat).

    2 大鼠主動脈病理變化

    阿托伐他汀干預21周后,處死所有大鼠。正常對照組大鼠主動脈鏡下均未見病理改變,見圖1A。高脂對照組大鼠主動脈管腔明顯不規(guī)則,管壁厚薄不均,內(nèi)膜部分破壞,中膜層排列紊亂,彈性纖維結(jié)構(gòu)不清,可見明顯鈣化病變,未見脂質(zhì)沉積和泡沫細胞聚集,部分可見軟骨樣細胞增生,見圖1B箭頭所示。他汀干預組大鼠主動脈管腔不規(guī)則,管壁厚薄不均,內(nèi)膜、中膜見明顯鈣化,彈性纖維結(jié)構(gòu)明顯不清,與高脂對照組比較略有改善,見圖1C。模型觀察大鼠于第14周處死后觀察主動脈病理變化,無典型動脈粥樣硬化改變(圖1D),故各組繼續(xù)按原方案進行。

    3 主動脈HSP22的表達

    正常對照組大鼠胸主動脈管壁均未見HSP22陽性表達,見圖2A;高脂對照組大鼠胸主動脈管壁可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色,主要較集中分布在中膜,部分散在分布于內(nèi)膜,見圖2B箭頭所示;他汀干預組大鼠胸主動脈管壁可見呈線狀分布的棕黃色陽性著色,主要位于中膜,棕黃色著色較高脂對照組稍淺,見圖2C箭頭所示。他汀干預組平均吸光度值明顯低于高脂對照組(0.211±0.014vs0.345±0.042,P<0.05),見圖2D。

    Figure 1. Representative sections of HE staining of rat aortas(×200).A: normal control group (20 weeks); B: HF group (20 weeks);C: HF+ATV group (20 weeks);D: HF observation rat (14 weeks).

    Figure 2. The expression of HSP22 protein in the aorta of rats (immunohistochemistry, ×400). A: normal control group; B: HF group; C: HF+ATV group; D: statistical bar graph indicates the result of mean optical density of positive particles in each group.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs HF.

    4 主動脈TNF-α的表達

    正常對照組大鼠胸主動脈中膜和內(nèi)膜未見TNF-α陽性表達,外膜可見棕黃色著色,見圖3A;高脂對照組大鼠胸主動脈外膜可見棕黃色著色,同時中膜、內(nèi)膜可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色,見圖3B箭頭所示;他汀干預組大鼠胸主動脈外膜可見棕黃色著色,同時中膜、內(nèi)膜可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色,見圖3C箭頭所示。他汀干預組平均吸光度值明顯低于高脂對照組(0.218±0.090vs0.377±0.094,P<0.05),見圖3D。

    Figure 3. The expression of TNF-α protein in the aorta of rats (immunohistochemistry, ×400).A: normal control group; B: HF group; C: HF+ATV group; D: statistical bar graph indicates the result of mean density of positive particles in each group.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs HF.

    5 主動脈eNOS的表達

    經(jīng)高脂飲食干預后大鼠主動脈eNOS的表達較正常對照組明顯降低(0.968±0.168vs0.126±0.130,P<0.01),形成高脂血癥后給予阿托伐他汀干預21周,他汀干預組大鼠主動脈eNOS的表達仍明顯低于正常對照組(0.968±0.168vs0.202±0.177,P<0.01),他汀干預組eNOS表達水平略高于高脂對照組,但差異無顯著(P>0.05),見圖4。

    Figure 4. The expression of eNOS protein in the aorta of rats.Mean±SD.n=4. *P<0.05 vs normal control.

    討 論

    動脈是構(gòu)成循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分,并在一系列應激反應如局部的損傷、毒物、吸煙和高脂血癥形成過程中不斷變化,這些刺激直接或間接導致血壓升高和血管壁的損傷,并可進一步導致血管僵硬度增加和形成動脈硬化,機體為了在各種應激條件下存活,為了維持血管壁的穩(wěn)態(tài),內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞等血管壁細胞會產(chǎn)生大量的HSP而對抗應激狀態(tài)下的血管損傷[6-7]。新近研究發(fā)現(xiàn)人內(nèi)皮細胞在高脂血癥患者血清刺激下形成了內(nèi)皮源性泡沫細胞,并出現(xiàn)HSP27、HSP70和HSP90高表達[8]。

    目前,尚未發(fā)現(xiàn)HSP22與高脂血癥的相關研究。本研究中我們參考前人的經(jīng)驗[5]成功復制出高脂血癥大鼠模型,發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠主動脈HSP22的表達較正常對照組高,與其它HSP成員如HSP27、HSP70在高脂環(huán)境下表達升高呈一致的現(xiàn)象[8]。同時,高脂血癥大鼠主動脈TNF-α的表達較正常對照組高,eNOS的表達則較正常對照組低。TNF-α表達水平上調(diào)可導致血管內(nèi)皮細胞的功能損害而下調(diào)eNOS的表達[9]。TNF-α可誘導血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)化、遷移、增殖和凋亡,而這些改變在血管損傷的形成和進展中均起著關鍵作用[10-11]。而本研究HE染色結(jié)果顯示高脂血癥大鼠主動脈管腔明顯不規(guī)則,管壁厚薄不均,內(nèi)膜部分破壞,中膜層排列紊亂,彈性纖維結(jié)構(gòu)不清,可見明顯鈣化病變,呈現(xiàn)出明顯的血管損傷改變。推測HSP22表達的升高很可能是一種對血管損傷的炎癥性刺激的保護性反應,需進一步研究以證實。

    阿托伐他汀目前廣泛應用于高膽固醇血癥、冠心病的預防和治療,是膽固醇合成限速酶羥甲基-戊二酸單酰輔酶還原酶抑制劑,能明顯降低心血管死亡[12]。他汀類藥物除有效調(diào)脂作用外,還具有抑制炎癥反應,抗氧化應激,降低血小板活性及改善內(nèi)皮功能等多重調(diào)脂外作用[13]。本研究中阿托伐他汀干預后血脂的變化與他汀類藥物主要降低LDL-C和TC水平,輕度升高HDL-C水平的作用相一致。

    阿托伐他汀干預后,大鼠主動脈HSP22的表達較高脂對照組明顯降低。Ghayour-Mobarhan等[3]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀和阿托伐他汀都可降低脂質(zhì)代謝紊亂患者血清熱休克蛋白60、65、70抗體滴度。同時血清C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)濃度也均明顯降低,但他汀對HSP抗體滴度的影響與CRP濃度的改變并不具有相關性,提示他汀使HSP抗體滴度降低的作用并不能完全以其抗炎癥反應進行解釋,而可能存在其它的免疫相關調(diào)節(jié)機制。本研究中,阿托伐他汀干預后TNF-α的表達較高脂對照組明顯降低,eNOS的表達則略有升高,表明阿托伐他汀干預后血管炎癥反應已有所抑制,但內(nèi)皮功能尚未能完全恢復。Zhang等[14]進行的研究中阿托伐他汀干預組自實驗開始即給予他汀,共干預30 d,大鼠主動脈eNOS表達明顯較高脂組高(P<0.05),與正常對照組無明顯差異,血管內(nèi)皮功能明顯恢復。而本研究則是形成明顯高脂血癥后再行阿托伐他汀干預,未能明顯恢復血管內(nèi)皮功能。HE結(jié)果顯示他汀干預組與高脂對照組的差異并不十分顯著,他汀干預組依然存在明顯的血管損傷,這與eNOS的表達未見明顯升高呈一致表現(xiàn),如能早期進行他汀干預,可能更好地保護血管內(nèi)皮功能。阿托伐他汀是否通過HSP22途徑抑制血管炎癥,恢復內(nèi)皮功能,本研究尚不能闡明。在內(nèi)皮功能尚未完全恢復下,阿托伐他汀干預后HSP22及TNF-α的表達均降低,通過何種機制實現(xiàn)的亦有待進一步探索。

    本研究屬于觀察性探索,首次發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠主動脈HSP22表達升高,阿托伐他汀的干預可降低HSP22的表達。本研究的對象為SD大鼠,形成的高脂血癥中TG水平變化不明顯,分析可能與外源性TG攝取后在血液中主要以乳糜微粒形式存在、代謝較快有關。參照前人的造模方法成功復制高脂血癥模型,但未形成典型的動脈粥樣硬化病變,大鼠動脈硬化以血管的鈣化病變?yōu)橹饕憩F(xiàn),形成了Monckeberg型動脈硬化,研究提示大劑量的維生素D3可能通過誘導平滑肌細胞氧化應激,加速平滑肌細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化等復雜機制促進血管鈣化病變形成[15]。本研究中主動脈HSP22及TNF-α的陽性表達均成線狀或點狀分布,具體機制尚不明確,分析可能與血管鈣化病變形成,管壁中正常的細胞被鈣化物質(zhì)取代有關。故后續(xù)進行HSP22在高脂血癥中的具體機制研究時需進一步完善研究方案,減少可能的干擾因素。所選用的動物數(shù)量偏少,可能對實驗結(jié)果有一定影響。

    [參 考 文 獻]

    [1]KimMV,Seit-NebiAS,MarstonSB,etal.SomepropertiesofhumansmallheatshockproteinHsp22 (H11orHspB8)[J].BiochemBiophysResCommun, 2004, 315(4):796-801.

    [2] Zhu W, Roma P, Pirillo A, Angela P, et al. Human endothelial cells exposed to oxidized LDL express hsp70 only when proliferating[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1996, 16(9):1104-1111.

    [3]Ghayour-MobarhanM,LambDJ,VaidyaN,etal.Heatshockproteinantibodytitersarereducedbystatintherapyindyslipidemicsubjects:apilotstudy[J].Angiology, 2005, 56(1):61-68.

    [4] Uyy E, Ivan L, Boteanu RM, et al. High-fat diet alters protein composition of detergent-resistant membrane microdomains[J]. Cell Tissue Res, 2013, 354(3):771-781.

    [5] 趙 娟,李相軍,孫 波,等. 維生素D3聯(lián)合高脂飼料建立大鼠動脈粥樣硬化模型[J]. 實用醫(yī)學雜志,2009, 25(21):3569-3571.

    [6] Xu Q. Biomechanical-stress-induced signaling and gene expression in the development of arteriosclerosis[J]. Trends Cardiovasc Med, 2000, 10(1): 35-41.

    [7]XuQ.Disturbedflow-enhancedendothelialturnoverinatherosclerosis[J].TrendsCardiovascMed, 2009, 19(6):191-195.

    [8] Ivan L, Antohe F. Hyperlipidemia induces endothelial-derived foam cells in culture[J]. J Recept Signal Transduct Res, 2010, 30(2):106-114.

    [9]BayramgurlerD,KarsonA,YazirY,etal.Theeffectofetanerceptonaorticnitricoxide-dependentvasorelaxationinanunpredictablechronic,mildstressmodelofdepressioninrats[J].EurJPharmacol,2013, 710(1-3):67-72.

    [10] Stintzing S, Ocker M, Hartner A, et al. Differentiation patterning of vascular smooth muscle cells (VSMC) in atherosclerosis[J]. Virchows Arch, 2009, 455(2):171-185.

    [11]ChuWM.Tumornecrosisfactor[J].CancerLett, 2013, 328(2):222-225.

    [12] Baigent C, Keech A, Kearney PM, et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins[J]. Lancet, 2005, 366(9493):1267-1278.

    [13]BeowskiJ,A.ModulationofH2Smetabolismbystatins:anewaspectofcardiovascularpharmacology[J].AntioxidRedoxSignal, 2012, 17(1):81-94.

    [14] Zhang R, Niu H, Wang N, et al. Daming capsule restores endothelial dysfunction induced by high-fat diet[J]. BMC Complement Altern Med, 2012, 12:21

    [15]McCartyMF,DiNicolantonioJJ.Themolecularbiologyandpathophysiologyofvascularcalcification[J].PostgradMed, 2014,126(2):54-64.

    猜你喜歡
    棕黃色高脂高脂血癥
    你真的認識蝗蟲嗎
    細微之處顯本真
    化學教與學(2022年7期)2022-04-02 21:55:32
    高脂血標本對臨床檢驗項目的干擾及消除對策
    運動降低MG53表達及其在緩解高脂膳食大鼠IR中的作用
    高脂血癥對生化檢驗項目的干擾及消除
    食物不耐受與高脂血癥的關系
    高脂飲食誘導大鼠生精功能障礙
    社區(qū)健康促進模式降低老年高脂血癥的效果
    味精與高脂日糧對生長豬胴體性狀與組成的影響
    長爪沙鼠高脂血癥的初步研究
    女人精品久久久久毛片| 免费日韩欧美在线观看| 蜜桃国产av成人99| 久久久欧美国产精品| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 精品第一国产精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 丝袜喷水一区| av.在线天堂| 日韩精品有码人妻一区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 在线观看三级黄色| 成人国语在线视频| 性少妇av在线| 国产 一区精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 看非洲黑人一级黄片| 哪个播放器可以免费观看大片| 99热国产这里只有精品6| 色婷婷av一区二区三区视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美精品国产亚洲| 国产高清国产精品国产三级| 午夜免费鲁丝| 国产免费视频播放在线视频| 不卡av一区二区三区| 乱人伦中国视频| 日本黄色日本黄色录像| 免费在线观看黄色视频的| 久久综合国产亚洲精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 成年动漫av网址| 欧美激情高清一区二区三区 | 看免费av毛片| 亚洲av综合色区一区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日韩av在线免费看完整版不卡| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲欧美一区二区三区久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 看十八女毛片水多多多| 亚洲伊人久久精品综合| 99久久综合免费| 中文字幕制服av| 91精品三级在线观看| 国精品久久久久久国模美| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久午夜福利片| 女性被躁到高潮视频| 99久久人妻综合| 久久久久国产网址| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久精品国产综合久久久| 亚洲成人av在线免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品免费大片| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜福利一区二区在线看| av网站免费在线观看视频| 国产成人精品婷婷| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美精品一区二区大全| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久精品免费免费高清| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩三级伦理在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久国产亚洲av麻豆专区| 超碰成人久久| 九色亚洲精品在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 秋霞伦理黄片| 免费在线观看完整版高清| 久久久久精品人妻al黑| 国产成人精品久久久久久| 日韩一本色道免费dvd| 哪个播放器可以免费观看大片| 不卡视频在线观看欧美| av在线观看视频网站免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美亚洲日本最大视频资源| www.av在线官网国产| 中文欧美无线码| 我的亚洲天堂| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产成人精品久久二区二区91 | 欧美国产精品一级二级三级| 久久久久久免费高清国产稀缺| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 99热国产这里只有精品6| 看免费av毛片| 高清在线视频一区二区三区| 成人毛片a级毛片在线播放| 黑人猛操日本美女一级片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 大香蕉久久网| 亚洲av福利一区| 不卡av一区二区三区| 国产淫语在线视频| 日本色播在线视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 在线 av 中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看| 观看av在线不卡| 国产1区2区3区精品| 九九爱精品视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久久久国产欧美日韩av| 国产黄色免费在线视频| 久久 成人 亚洲| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲成人av在线免费| 在线观看三级黄色| 亚洲精品第二区| 熟女av电影| 黄色一级大片看看| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲国产日韩一区二区| 色网站视频免费| 免费人妻精品一区二区三区视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 黄色怎么调成土黄色| a级毛片黄视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产伦理片在线播放av一区| 国产福利在线免费观看视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 搡老乐熟女国产| av不卡在线播放| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美97在线视频| 国产在线视频一区二区| 1024视频免费在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| av国产精品久久久久影院| 一二三四在线观看免费中文在| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 午夜日本视频在线| 精品午夜福利在线看| 男男h啪啪无遮挡| 欧美亚洲日本最大视频资源| 18+在线观看网站| 精品福利永久在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 久久国产亚洲av麻豆专区| 婷婷色av中文字幕| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久99一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 大话2 男鬼变身卡| 视频区图区小说| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 日日啪夜夜爽| 亚洲中文av在线| 午夜av观看不卡| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜老司机福利剧场| 18禁观看日本| 精品少妇黑人巨大在线播放| 母亲3免费完整高清在线观看 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产在视频线精品| 熟女av电影| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 精品少妇黑人巨大在线播放| 狂野欧美激情性bbbbbb| 麻豆乱淫一区二区| 高清在线视频一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| videosex国产| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲综合色网址| 国产成人a∨麻豆精品| 少妇 在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久精品国产自在天天线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 黄色 视频免费看| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品av久久久久免费| 99热网站在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 妹子高潮喷水视频| 99国产精品免费福利视频| 国产精品一国产av| 国产精品女同一区二区软件| 久久午夜福利片| 国产精品国产三级国产专区5o| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久女婷五月综合色啪小说| 日本免费在线观看一区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲av免费高清在线观看| 精品亚洲成国产av| 久久女婷五月综合色啪小说| 少妇人妻 视频| 国产1区2区3区精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 一区在线观看完整版| 天美传媒精品一区二区| 老汉色∧v一级毛片| 成年人免费黄色播放视频| 69精品国产乱码久久久| 美女福利国产在线| 18禁观看日本| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲,欧美精品.| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 热re99久久精品国产66热6| 日本免费在线观看一区| 午夜福利视频精品| 国产探花极品一区二区| 精品一区在线观看国产| 国产xxxxx性猛交| 免费在线观看黄色视频的| 久久国内精品自在自线图片| 久久久久久人人人人人| 国产乱来视频区| 亚洲精品久久午夜乱码| 我要看黄色一级片免费的| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美精品一区二区免费开放| 久久热在线av| 亚洲成人一二三区av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 婷婷色av中文字幕| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 午夜日韩欧美国产| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲av日韩在线播放| 国产成人精品婷婷| 韩国av在线不卡| 黄色一级大片看看| 一级毛片 在线播放| 精品少妇久久久久久888优播| 黄片播放在线免费| 咕卡用的链子| 亚洲人成网站在线观看播放| 色吧在线观看| 乱人伦中国视频| 久久99蜜桃精品久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品酒店卫生间| 丰满乱子伦码专区| 欧美av亚洲av综合av国产av | av国产精品久久久久影院| 人妻 亚洲 视频| 十分钟在线观看高清视频www| 久热久热在线精品观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产欧美亚洲国产| 精品少妇久久久久久888优播| 两个人免费观看高清视频| 亚洲av男天堂| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 99久久精品国产国产毛片| 精品酒店卫生间| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 丝袜在线中文字幕| 久久99精品国语久久久| 一二三四在线观看免费中文在| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 午夜91福利影院| 在线天堂中文资源库| www.熟女人妻精品国产| 日韩电影二区| av网站在线播放免费| 国产日韩欧美亚洲二区| 一区二区av电影网| 黄色 视频免费看| 最新的欧美精品一区二区| 99久国产av精品国产电影| 亚洲成色77777| 黄色怎么调成土黄色| 久久久欧美国产精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久精品夜色国产| 麻豆av在线久日| 老司机影院成人| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黄色毛片三级朝国网站| 不卡视频在线观看欧美| 久久99热这里只频精品6学生| 少妇的逼水好多| 国产亚洲欧美精品永久| 男人添女人高潮全过程视频| 在线观看三级黄色| 国产日韩欧美亚洲二区| 桃花免费在线播放| 老女人水多毛片| 精品国产一区二区久久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 又大又黄又爽视频免费| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品无大码| 秋霞在线观看毛片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 午夜激情av网站| 满18在线观看网站| 国产精品久久久久久精品电影小说| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品国产av成人精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 大片免费播放器 马上看| 亚洲国产日韩一区二区| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利,免费看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产极品天堂在线| 久久久精品区二区三区| 香蕉国产在线看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产日韩欧美视频二区| 黄片无遮挡物在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲久久久国产精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲av在线观看美女高潮| 999精品在线视频| 一级a爱视频在线免费观看| 99热全是精品| 国产精品国产av在线观看| 99国产综合亚洲精品| 日本wwww免费看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 在线天堂最新版资源| 91久久精品国产一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲人成网站在线观看播放| 视频区图区小说| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产成人精品福利久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品av久久久久免费| 中国国产av一级| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 一区二区三区激情视频| 大话2 男鬼变身卡| 毛片一级片免费看久久久久| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲天堂av无毛| 亚洲精品av麻豆狂野| 成年动漫av网址| 婷婷色综合大香蕉| 五月天丁香电影| 国产成人精品福利久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 97在线人人人人妻| 亚洲人成电影观看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 美女视频免费永久观看网站| 精品人妻偷拍中文字幕| av电影中文网址| 国产毛片在线视频| 青草久久国产| 人成视频在线观看免费观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av在线老鸭窝| 国产精品无大码| 亚洲四区av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一级片'在线观看视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 永久免费av网站大全| 精品少妇内射三级| 亚洲男人天堂网一区| 国产亚洲欧美精品永久| 99久久人妻综合| 国产精品成人在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产成人精品在线电影| 欧美精品av麻豆av| 老女人水多毛片| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 天堂中文最新版在线下载| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产一区亚洲一区在线观看| www.自偷自拍.com| 视频在线观看一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 久热这里只有精品99| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费人妻精品一区二区三区视频| 毛片一级片免费看久久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 久久免费观看电影| 午夜免费鲁丝| 考比视频在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 久久久久久久国产电影| 亚洲精品视频女| av不卡在线播放| 午夜福利在线免费观看网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产av一区二区精品久久| 男男h啪啪无遮挡| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 夫妻性生交免费视频一级片| 国产激情久久老熟女| 免费黄网站久久成人精品| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久精品夜色国产| 男女免费视频国产| 国产免费视频播放在线视频| a级片在线免费高清观看视频| 多毛熟女@视频| 人妻 亚洲 视频| 女人精品久久久久毛片| 热re99久久精品国产66热6| 国产福利在线免费观看视频| 精品少妇内射三级| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产人伦9x9x在线观看 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 少妇人妻 视频| 乱人伦中国视频| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品一国产av| 老司机影院成人| 久久ye,这里只有精品| 国产xxxxx性猛交| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 999久久久国产精品视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久久精品性色| 国产av精品麻豆| 老司机亚洲免费影院| 国产黄色免费在线视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 高清av免费在线| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 妹子高潮喷水视频| av免费在线看不卡| 考比视频在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 老司机亚洲免费影院| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜91福利影院| 伦理电影大哥的女人| 欧美少妇被猛烈插入视频| av线在线观看网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久精品夜色国产| 老鸭窝网址在线观看| 老司机影院成人| 制服丝袜香蕉在线| 一本久久精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 香蕉国产在线看| 老汉色∧v一级毛片| 制服诱惑二区| 国产一级毛片在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲综合色网址| 国产xxxxx性猛交| 亚洲成国产人片在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲av男天堂| 国产成人午夜福利电影在线观看| 好男人视频免费观看在线| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人欧美| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲精品一二三| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久精品夜色国产| 国产国语露脸激情在线看| 国产xxxxx性猛交| 久久综合国产亚洲精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 午夜激情av网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 中国国产av一级| 日韩欧美一区视频在线观看| 女人精品久久久久毛片| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品国产三级专区第一集| 美女国产高潮福利片在线看| 国产高清不卡午夜福利| 免费观看无遮挡的男女| 欧美激情极品国产一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 国产在线视频一区二区| xxxhd国产人妻xxx| 在线天堂中文资源库| av国产精品久久久久影院| 久久久久国产网址| 国产免费视频播放在线视频| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲经典国产精华液单| 午夜福利视频精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产成人精品在线电影| 精品少妇内射三级| 色94色欧美一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久国产精品麻豆| 嫩草影院入口| 伊人亚洲综合成人网| 老汉色∧v一级毛片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 午夜日本视频在线| www.自偷自拍.com| 国产精品三级大全| www.av在线官网国产| 老司机影院成人| 日本午夜av视频| 国产毛片在线视频| 天堂8中文在线网| 国产免费福利视频在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品 欧美亚洲| 国产男女超爽视频在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 中文字幕制服av| 男女高潮啪啪啪动态图| 香蕉丝袜av| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费高清在线观看日韩| 亚洲精品在线美女| 国产男人的电影天堂91| 国产一区二区激情短视频 | 国产国语露脸激情在线看| 免费看不卡的av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 26uuu在线亚洲综合色| 另类亚洲欧美激情| av国产久精品久网站免费入址| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产成人免费观看mmmm| 一二三四中文在线观看免费高清| 成年动漫av网址| 在线观看国产h片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| 免费观看av网站的网址| 9热在线视频观看99| 国产黄频视频在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 中国三级夫妇交换| 少妇的逼水好多| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 美女午夜性视频免费|