葡萄多酚對雨蛙肽誘導的急性胰腺炎胰腺組織的保護作用*

魚毛毛， 劉金姣， 王雨楠， 連 冠， 王宇輝， 劉國慶， 祁 榮

(北京大學心血管研究所，分子心血管學教育部重點實驗室，北京 100191)

急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是由于胰腺分泌的消化酶自我消化胰腺及其周圍組織而導致的嚴重的急性炎癥反應[1]，并可能繼發(fā)一系列的多器官功能障礙，是臨床上危急重癥中較難治療的疾病之一[2]。AP的發(fā)病機制非常復雜，其發(fā)生發(fā)展受多種因素影響[3]，其中胰酶活化以及炎癥介質(zhì)、細胞因子和氧自由基大量產(chǎn)生引發(fā)機體超強的炎癥反應是造成AP早期病理損害的主要機制。此外，AP時細胞膜的結構和功能遭到損害，引起和(或)加重細胞內(nèi)游離Ca2+水平的增高，從而導致胰腺腺泡細胞凋亡也是AP發(fā)展的一個重要機制[4]。

In following years, many of the original colonists celebrated the autumn harvest with a feast of thanks.

雨蛙肽(caerulein)是膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)的類似物，小鼠腹腔過量給予雨蛙肽刺激，可以引起類似于人類急性胰腺炎疾病時的生化及病理生理改變[5-6]。因此，雨蛙肽誘導的急性胰腺炎小鼠模型對臨床研究急性胰腺炎的發(fā)病機制、病理過程、診斷及藥物干預治療效果等方面有重要意義。

葡萄多酚(grapepolyphenol,GP)是從葡萄中提取的天然植物多酚類活性物質(zhì)，廣泛存在于葡萄的皮、籽、果肉中，主要成分包括表兒茶酸等酚酸類、黃烷醇類、花色苷類、黃酮醇類和縮聚單寧等物質(zhì)；其中含量最高的為原花色苷，可達80%～85%[7]。在眾多植物多酚中，以葡萄多酚清除自由基能力最強，其有效成分的抗氧化能力為維生素E的 50倍，是維生素C的20倍左右，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最高效的抗氧化劑之一[8]。葡萄多酚還有保護心肌細胞[9]、降低血清膽固醇[10]、保護血管內(nèi)皮不受損傷[11]、防癌抗癌[12]、抗疲勞、抗炎、抗突變等生物活性。本研究旨在研究葡萄多酚對雨蛙肽誘導的小鼠急性胰腺炎的保護作用，并探討可能的機制。

材 料 和 方 法

1 動物

2月齡雌性ICR小鼠，體重約25 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物部提供。所有小鼠均在12 h光照、12 h 黑暗的標準周期下，于無菌設備中飼養(yǎng)，自由進食及飲水。實驗方案經(jīng)北京大學醫(yī)學部實驗動物倫理管理委員會批準。

2 主要試劑

葡萄多酚由新疆石河子西部牧業(yè)提供；Caerulein、TMB 和DEPC 購自Sigma；α-淀粉酶測定試劑盒購自北京中生北控生物科技股份有限公司；動物組織總RNA Trizol提取液購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；TransScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix購自北京全式金生物技術有限公司；Eva Green qPCR Master Mix購自ABM；引物由北京諾賽基因組研究中心合成；Mac-2抗體(rabbit polyclonal IgG)購自Santa Cruz；兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

我國歷史上設置時間最長的圖書管理機構為秘書監(jiān)或秘書省。據(jù)史料記載，我國自東漢延熹二年（公元159年）開始，設置專門掌管朝廷典籍與藏書整理、編校工作的機構秘書監(jiān)或秘書省，至洪武十三年（1380年），明太祖撤銷秘書監(jiān)為止，歷代沿襲了1200余年。

3 主要方法

夏天一身汗、冬天一身霜，晴天一身土、雨天一身泥。簡短幾句話道出了養(yǎng)路工作的艱辛。他雖然身在中層領導崗位，仍然保持著養(yǎng)路工人的作風。為了保證公路通暢，他同養(yǎng)路工人們一樣，冬天，不畏嚴寒，除雪保暢；夏天，不懼酷暑，奮戰(zhàn)一線，真心守護著公路，揮灑著青春和汗水。夏季工作，他迎著初升的太陽，上路巡檢，安排工人處置病害。中午氣溫達到零上30多度，汗水浸透了橘黃色的工作服,艱難困苦并沒有嚇倒他，他帶領工人們以苦為樂、以路為業(yè)，用忘我的奉獻精神戰(zhàn)勝了困難，鋪平了道路。工作帶給他無盡的歡樂，豐富了他奮進的心靈，鞭策他更加奮進、更加執(zhí)著。

由表3可知，“小葉茼蒿”葉片的SPAD值x與葉綠素b含量y（單位：mg/g，下同）之間的相關性均表現(xiàn)為極顯著性差異，“大葉茼蒿”葉片SPAD值x與葉綠素b含量y(單位：mg/g，下同）之間的相關性則較差。其中“小葉茼蒿”的最佳函數(shù)模型是對數(shù)函數(shù)y=.5596Ln(x)-1.8316（r=0.845**），“大葉茼蒿”的最佳函數(shù)模型是線性函數(shù) y=0.0009x+0.2058（r=0.065）。

3.1.2 加大資金投入，豐富產(chǎn)品結構。在旅游業(yè)還沒發(fā)展的時候，張家界主要以發(fā)展第一產(chǎn)業(yè)為主，第二三產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢。在工業(yè)基礎薄弱的背景下，資金不足、基礎設施落后，導致第三產(chǎn)業(yè)的發(fā)展缺乏保障。生態(tài)旅游產(chǎn)品從規(guī)劃設計到投入實施都需要強有力的資金支持，城市化發(fā)展水平滯后成為制約張家界生態(tài)旅游業(yè)發(fā)展的一個瓶頸因素。同時，由于資金的短缺，導致旅游區(qū)基礎設施發(fā)展滯后，高品質(zhì)旅游接待設施數(shù)量少、餐飲業(yè)缺乏本地特色、購物環(huán)境不良、旅游公共服務不達標。以上綜合因素導致旅游產(chǎn)品缺乏良好的孵化環(huán)境，高品質(zhì)的生態(tài)產(chǎn)品沒有扎根的土壤。

3.2急性胰腺炎小鼠模型的建立 在藥物預處理小鼠的第7 d開始造模。造模前，所有實驗小鼠自由飲水條件下禁食12 h。AP組以及GP預處理AP組小鼠腹腔注射caerulein(50 μg/kg)的生理鹽水溶液，每 h 1次，連續(xù)注射7次。NC組小鼠同法注射生理鹽水。予第1次注射后24 h處死小鼠，取胰腺組織，分別用于病理形態(tài)學及炎癥因子、氧化應激標志分子表達的研究。取肺組織，用于髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的測定。

與NC組相比，AP組小鼠的胰腺組織HO-1、SOD-1、SOD-2和NOX-2 mRNA表達上調(diào)，其中SOD-1和NOX-2的上調(diào)有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，見圖5。GP預處理AP組小鼠的胰腺組織氧化應激分子SOD-1、SOD-2和NOX-2 mRNA表達較AP模型組有明顯的下調(diào)(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。結果表明，葡萄多酚能夠明顯下調(diào)AP時氧化應激水平。

各組小鼠的胰腺組織病理切片HE染色結果見圖2。NC組小鼠胰腺形態(tài)結構完好，無炎癥改變。與NC組相比，AP組小鼠胰腺組織有明顯的水腫改變，小葉間隙增寬、結構紊亂，腺泡細胞局限性或廣泛性壞死，小葉間及壞死灶內(nèi)均有大量炎癥細胞浸潤； GP預處理AP組小鼠胰腺組織的水腫，腺泡細胞的空泡、壞死，以及炎癥細胞浸潤較AP模型組明顯減輕。

3.5胰腺組織巨噬細胞浸潤的觀察 用免疫組化法檢測胰腺組織中巨噬細胞的浸潤情況，選擇Mac-2分子作為巨噬細胞表達的標志分子。3%H2O2封閉胰腺切片的內(nèi)源性過氧化物酶，10%正常羊血清孵育1h封閉。滴加抗Mac-2 Ⅰ抗(1∶200)，4 ℃冰箱中過夜。PBS緩沖液振蕩清洗切片3次后，滴加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)封片。顯微鏡下觀察，棕染的細胞即為浸潤的巨噬細胞。

表1 胰腺組織病理評分標準

HPF: high-power field.

3.6肺臟組織MPO活性的測定 參照文獻[15]的方法，采用分光光度分析法測量MPO的活性。將小鼠冰凍肺組織勻漿，應用BCA法測量不同勻漿樣品的蛋白濃度。將勻漿樣品離心(16 000×g，15 min)，收集得到的沉淀物用磷酸鹽(pH 5.4，含0.5% HETAB和10 mmol/L EDTA)重懸，再次離心后得到上清。以TMB為底物，加入工作液，于650 nm處讀取吸光度(A)值，得到的結果用蛋白濃度校正，即為 MPO的活性。

4 統(tǒng)計學處理

各組小鼠胰腺組織巨噬細胞浸潤情況見圖3。與NC組相比，AP組小鼠胰腺組織的小葉間隙以及壞死灶內(nèi)有大量的巨噬細胞浸潤。GP預處理AP組小鼠的胰腺組織均未見明顯的巨噬細胞浸潤。結果表明，葡萄多酚能夠減輕AP時巨噬細胞對胰腺組織的浸潤。

結 果

1 胰腺相對重量

對各組小鼠的胰腺切片進行病理評分，結果顯示：與NC組相比，AP模型組水腫、炎癥、壞死、空泡等指標的評分以及總分均顯著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.05, P<0.01，P<0.01)，見圖2，提示造模成功。與AP組相比，GP預處理AP組小鼠的胰腺組織的水腫、炎癥以及空泡的評分明顯降低(P<0.05)，但壞死和病理總評分沒有明顯變化。結果表明，GP能夠顯著改善AP時胰腺的病理損傷，表現(xiàn)在減輕胰腺水腫、空泡，減少炎癥細胞對胰腺的浸潤。

Figure 1. Changes of relative pancreas weight of mice from each group.Mean±SD.n=7.

2 胰腺病理損傷

3.4胰腺組織炎癥因子和氧化應激標志物表達測定 取小鼠胰腺組織約50 mg，于2 mL RNA Trizol提取液中勻漿，提取胰腺組織總RNA。利用TransScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix試劑盒將總RNA 反轉錄，獲得cDNA。實時定量PCR(real-time quantitative PCR)測定各胰腺組織中的IL-1β、TNF-α、MCP-1 和TGF-β1等炎癥因子以及NOX-4、SOD-1 mRNA 表達水平。每個樣品重復3 次，并以SYBR Green 作為熒光劑，結果以18S rRNA 的表達水平標準化。

現(xiàn)在，社會正處于一種“后買方時代”，在這種消費環(huán)境中，消費者的觀念一定會對企業(yè)的生產(chǎn)產(chǎn)生一定的影響力。從環(huán)保的角度看，很多高污染、高消耗、高排放的產(chǎn)品會被消費者拒絕，這樣的產(chǎn)品在市場上自然沒有需求。[3]企業(yè)在這一大背景下，想要在市場上占據(jù)較大的市場份額就必須通過科技創(chuàng)新，替換掉不具備競爭力的產(chǎn)品，同時，升級整個產(chǎn)業(yè)鏈，主動尋求合作伙伴，力求將手頭的各種資源進行優(yōu)化配置和有效利用。另外，企業(yè)還可以通過自身產(chǎn)品的影響力，借助新聞媒體的宣傳手段，積極引導消費者改變原有的消費習慣和模式，適應時代的變化。

各組小鼠的胰腺相對重量見圖1。與NC組相比，AP組和GP預處理AP組的小鼠胰腺相對重量有增加趨勢，但2組間沒有顯著差異，表明GP并不影響AP時胰腺的相對重量。

所以從這個角度講，我就覺得這部戲格局確實小了。就是說我們一定要把歷史上的改革、工業(yè)革命與今天中國所面臨的現(xiàn)實（這個現(xiàn)實既有國際的形勢，也有國內(nèi)工業(yè)發(fā)展存在的問題）和今天改革開放工業(yè)革命所肩負的使命聯(lián)系起來。不見得寫得那么直白，但是這個精神一定要有，要站在今天這個歷史高度來看當年的改革開放?，F(xiàn)在多少還有一點就當年的改革開放寫那一段歷史現(xiàn)實的局限的問題，我覺得思路還要打開。

Figure 2. Morphology and pathological scores of pancreatic tissues of the mice with different treatments (HE staining,×100). Mean±SEM.n=7.*P<0.05,**P<0.01 vs NC; #P<0.05 vs AP.

3 胰腺組織巨噬細胞浸潤情況

采用SPSS統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。組間差異比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。組織學評分數(shù)據(jù)的組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

Figure 3. Macrophage infiltration in the pancreatic tissues of mice from each group (Mac-2 immunohistochemical staining, ×100).

4 胰腺組織炎癥因子的表達

與NC組相比， AP組小鼠的胰腺組織炎癥因子MCP-1、TNF-α和IL-1β的mRNA表達上調(diào)，其中MCP-1和TNF-α的上調(diào)有顯著差異(P<0.05)，見圖4。GP預處理AP組小鼠的胰腺組織炎癥因子MCP-1和TNF-α mRNA表達較AP組有明顯的下調(diào)(P<0.05)。結果表明，葡萄多酚能夠明顯下調(diào)AP時炎癥因子的升高。

Figure 4. The expression of inflammatory factors, TNF-α (A), MCP-1 (B) and IL-1β (C), in the pancreatic tissues of the mice with different treatments.Mean±SEM.n=7.*P<0.05, **P<0.01 vs NC; #P<0.05, ##P<0.01 vs AP.

5 胰腺組織氧化應激分子的表達

3.3胰腺組織病理學評分 對取得的各組小鼠胰腺組織進行福爾馬林緩沖液固定、石蠟包埋和切片。對切片進行HE染色。按照病理學評分標準[13-14](表1)，對各胰腺組織的切片進行雙人、雙盲的病理評分。對評分結果進行統(tǒng)計學分析。

3.1藥物預處理 ICR雌性小鼠共21只，隨機分為正常對照組(NC組)、AP模型組(AP組)和藥物處理AP組(GP預處理AP組)，每組7只。各組小鼠給予相應的處理：GP預處理AP組灌胃給予GP水溶液1.5 g/kg, NC組和AP組同法給予生理鹽水。各組均每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d。同時給予普通飼料(chow diet)喂飼。

Figure 5. The expression of oxidative stress markers, SOD-1 (A), SOD-2 (B), NOX-2 (C) and HO-1 (D), in the pancreatic tissues of the mice with different treatments.Mean±SEM. n=7.*P<0.05,**P<0.01 vs NC; #P<0.05,##P<0.01 vs AP.

6 肺臟的MPO活性變化

與NC組相比，AP組小鼠肺臟組織MPO的活性明顯升高(P<0.05)。GP預處理AP組小鼠肺臟組織MPO的活性較AP組顯著降低(P<0.01)，見圖6。結果表明，葡萄多酚能夠明顯降低AP時中性粒細胞對遠端組織的浸潤。

討 論

AP 是發(fā)生在胰腺組織的急性炎癥性疾病，有時亦累及胰腺臨近臟器和遠隔器官，其病理生理過程與許多因素有關，包括胰腺消化酶的激活、炎癥介質(zhì)、細胞因子的大量產(chǎn)生等[16]。Caerulein是CCK的類似物，有研究揭示它可與胰腺細胞的CCK-A低親和受體結合，引起胰酶分泌，大劑量時可誘導AP 發(fā)生，被廣泛應用于AP的實驗研究中[17]。本實驗研究結果表明，經(jīng)caerulein誘導建立的AP模型，胰腺組織出現(xiàn)明顯的病理改變，包括水腫，腺泡細胞的空泡、壞死，以及炎癥細胞浸潤等，與人類急性胰腺炎發(fā)病時胰臟組織病理改變相似。此外，caerulein誘導的AP模型小鼠胰腺組織炎癥因子MCP-1、TNF-α和氧化應激分子SOD-1、SOD-2、HO-1、NOX-2的表達水平明顯升高。雖然SOD-1、SOD-2以及HO-1被廣泛認為是抗氧化分子，對多種疾病具有保護作用。但是我們的研究發(fā)現(xiàn)，在caerulein誘導的AP模型上，上述3個分子的表達都是顯著上調(diào)的，這可能是由于AP時大量活性氧物質(zhì)產(chǎn)生，抗氧化分子的表達代償性增加。同時我們的研究結果顯示NOX-2的表達顯著增加，而NOX-2是活性氧產(chǎn)生過程中一個重要的NADPH氧化酶，這意味著AP時活性氧的大量產(chǎn)生是確定的，這也支持了抗氧化分子代償性增加的結論。

Figure 6. MPO activity in the lung tissues of the mice with different treatments.Mean±SEM.n=7.*P<0.05 vs NC; ##P<0.01 vs AP.

炎癥在AP發(fā)生發(fā)展的過程中起著非常關鍵的作用，也是影響預后的重要指標。AP時，細胞因子通過相互交叉、相互代償?shù)难装Y信號轉導網(wǎng)絡作用，觸發(fā)炎癥介質(zhì)的級聯(lián)效應，進而引起炎癥擴布，引起全身炎癥反應，胰腺組織受損，病情加重。在眾多細胞因子中，TNF-α處于核心地位，主要由免疫細胞產(chǎn)生，是炎癥反應的始動因子，作為關鍵促炎因子與NF-кB相互作用，可在體內(nèi)啟動連鎖反應，募集中性粒細胞，產(chǎn)生過量的炎癥因子及氧自由基，在AP的病理生理發(fā)展過程中起到重要作用[18]。MCP-1作為AP 早期的主要炎癥介質(zhì)之一，由腺泡細胞和浸潤的白細胞產(chǎn)生，同時在血清中有顯著升高，不僅能夠募集單核巨噬細胞到胰腺局部加重炎癥，而且也能使巨噬細胞移行，損傷肺臟等遠隔器官，在AP的炎癥損傷和肺損傷中起著重要的作用[19]。文獻研究表明，將MCP-1阻斷、敲除或給予MCP-1的抑制劑后，都可以有效改善AP的各項病理指標，包括胰腺病變，肺損傷等方面[20-22]。因此，通過對炎癥反應通路中關鍵細胞因子(TNF-α和MCP-1)的調(diào)控，遏制炎癥介質(zhì)進一步激活，理論上能夠減輕AP引起的炎癥反應。多酚類物質(zhì)因其獨特的結構成為非常理想和有效的抗炎物質(zhì)。有實驗研究表明[23]，茶多酚作為抑制NF-κB 活化的抗氧化劑，通過調(diào)控前炎癥因子的活化，抑制炎癥細胞因子的分泌，發(fā)揮抗炎作用，進而改善和減輕AP的嚴重程度。本研究所應用的葡萄多酚也起到了類似的作用。治療組TNF-α以及MCP-1 mRNA表達水平較AP模型組均顯著降低，表明葡萄多酚能夠明顯抑制AP時炎癥因子TNF-α、MCP-1的產(chǎn)生，從而減輕機體的炎癥，達到抑制AP進展的作用。我們的實驗結果還表明，葡萄多酚預處理組胰腺組織的巨噬細胞浸潤較AP模型組明顯減少。這和MCP-1的結果是一致的，趨化因子的表達減少，導致胰腺組織局部的巨噬細胞浸潤也減少。

AP時，浸潤的炎癥細胞和腺泡細胞產(chǎn)生過量的活性氧物質(zhì)，其中過氧化氫、超氧化物是造成細胞損害的主要因素?；钚匝醪坏赏ㄟ^破壞細胞膜，裂解蛋白質(zhì)及核酸導致細胞壞死，而且可以損傷毛細血管內(nèi)皮，增加血管通透性，還可激活補體，促進白細胞黏附、活化和遷移，引起微循環(huán)障礙，加重胰腺損傷。此外，活性氧物質(zhì)可以通過誘導IκB-α磷酸化激活NF-κB，上調(diào)炎癥介質(zhì)表達[24]，發(fā)揮協(xié)同作用，觸發(fā)共同的信號轉導通路，導致炎癥的級聯(lián)放大，最終加重胰腺組織和遠隔器官的損傷。研究表明，抗氧化劑能保護細胞核DNA、膜脂質(zhì)、胞質(zhì)蛋白等生物大分子免受氧化損傷，能有效地清除多種自由基，減輕多種物質(zhì)誘導的多種組織的氧化應激反應[25]，因此能夠有效地抑制AP時的氧化應激水平，從而保護胰腺組織不受損傷。葡萄多酚中的有效成分具有超強的抗氧化能力，在很多領域都有廣泛的應用，比如抗衰老、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、改善視覺功能等。本研究結果顯示，與AP模型組相比，葡萄多酚能夠顯著降低氧化應激分子SOD-1、SOD-2和NOX-2的mRNA表達水平。由此可見，葡萄多酚的抗氧化活性是其減輕AP病理程度的一個重要方面。

遠隔器官的損傷，例如肺損傷，是急性胰腺炎非常危險的并發(fā)癥，也是影響AP結局和預后的關鍵因素。肺損傷主要是由于中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞的激活和移行，引發(fā)炎癥介質(zhì)和氧化應激分子大量產(chǎn)生而導致的。本研究結果表明，給予葡萄多酚預處理后，小鼠肺臟組織的MPO活性較AP模型組顯著降低，提示肺部中性粒細胞的浸潤減少，炎癥減輕，肺損傷程度較輕。這一結果也與炎癥因子、氧化應激分子表達水平降低的結果是一致的。

本研究所采用的葡萄多酚劑量為1.5 g/kg。該劑量的確定是基于本研究組前期對葡萄多酚降脂和抗動脈粥樣硬化作用的研究結果。我們發(fā)現(xiàn)該劑量條件下，葡萄多酚對于小鼠不僅安全，而且降脂和抗動脈粥樣硬化的效果最為顯著。因而，在本研究中我們采用該劑量研究葡萄多酚對雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎的作用。結果表明，葡萄多酚能夠明顯減輕雨蛙素誘導的急性胰腺炎時小鼠胰腺組織的損傷。

綜上所述，葡萄多酚具有抗炎和抗氧化作用，通過下調(diào)炎癥因子和氧化應激分子的表達，減輕AP時胰腺的病理改變程度，減少胰腺組織巨噬細胞的浸潤，降低肺組織MPO活性等，最終達到急性胰腺炎時對胰腺組織的保護作用。

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