• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合維生素E對(duì)急性腎損傷炎癥反應(yīng)的抑制作用*

    2014-08-13 12:12:34馮業(yè)童周余來(lái)劉朋飛
    中國(guó)病理生理雜志 2014年10期
    關(guān)鍵詞:造模干細(xì)胞腎臟

    趙 雷, 馮業(yè)童, 董 超, 周余來(lái), 劉朋飛△

    (1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院麻醉科,廣東 深圳 518020; 2吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系,吉林 長(zhǎng)春 130021)

    急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是臨床常見(jiàn)腎臟疾病,該疾病發(fā)病率在普通人群中約為0.5%~1%,在住院患者中增長(zhǎng)為2%~7%,而在ICU及術(shù)后患者中為4%~25%,在上述這些人群中,死亡率為28%~90%[1-2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,人類(lèi)的許多疾病均得到了有效控制,但是至今尚未發(fā)展出對(duì)AKI的有效治療方法,該疾病相關(guān)的死亡率也沒(méi)有得到明顯改善,其發(fā)病率甚至有逐年增高的趨勢(shì)。近年來(lái)的研究表明,氧自由基損傷及并發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)可能與AKI有重要的聯(lián)系,因此,如何降低AKI中的氧自由基和某些炎癥介質(zhì)造成的損傷成為了現(xiàn)階段人們的研究重點(diǎn)[3-5]。

    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓中存在的一類(lèi)成體干細(xì)胞,具有多向分化潛能,而且在體外增殖能力強(qiáng),性能穩(wěn)定,目前,研究人員已經(jīng)證實(shí)BMSCs在腎衰竭治療方面有著重要的作用[6-8];維生素E是一種脂溶性維生素,在眾多種類(lèi)的維生素中,維生素E是最主要的抗氧化劑之一,因?yàn)檠踝杂苫呤菍?dǎo)致腎細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一,所以,維生素E對(duì)急性腎衰竭也有一定的治療治療效果[9-10]。本課題組已經(jīng)證實(shí)BMSCs聯(lián)合維生素E對(duì)AKI具有一定的治療作用,而且治療效果優(yōu)于單一的治療模式,但是,相關(guān)治療機(jī)制尚不明確[11]。在本課題中,從炎癥蛋白抑制的角度進(jìn)一步分析治療機(jī)制,評(píng)價(jià)治療效果,從而進(jìn)一步促進(jìn)這種聯(lián)合治療模式在臨床腎臟疾病治療方面的應(yīng)用。

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物

    清潔級(jí)Wistar大鼠,雄性,體重250~310 g,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK-(吉)2007-0003。

    2 主要試劑和儀器

    DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco;Percoll分離液購(gòu)自Pharmacia;維生素E購(gòu)自Sigma;Trizol RNA提取液購(gòu)自Invitrogen;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa;所有引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成;大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor,RANTES)、白細(xì)胞介素-10(interleukin 10,IL-10)以及巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(macrophage inflammatory protein 2,MIP-2)ELISA試劑盒均購(gòu)自ASSAY;IX-70倒置相差顯微鏡及正置生物學(xué)顯微鏡均購(gòu)自O(shè)lympus;EXL-808酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)寶特公司;PCR儀購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;real-time Quality PCR儀購(gòu)自MJ Research。

    3 方法

    3.1大鼠BMSCs的分離培養(yǎng) 從雄性Wistar大鼠的股骨和脛骨中分離骨髓,并進(jìn)一步用1 073 g/L的Percoll分離液分離骨髓中的BMSCs,用含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)BMSCs的特異蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定,同時(shí),利用成骨分化培養(yǎng)基和成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)BMSCs定向分化,結(jié)果表明所獲得的BMSCs具有正常的間充質(zhì)細(xì)胞表型,而且具有向成骨和成脂方向分化的潛能,具體鑒定結(jié)果可參考本課題組前期文章[11]。

    3.2大鼠AKI動(dòng)物模型的制備與治療 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分6組,即空白對(duì)照組、造模組、造模+陽(yáng)性藥物組、造模+維生素E組、造模+BMSCs組和造模+BMSC+維生素E組,每組6只大鼠。造模時(shí)大鼠每天給予腹腔注射慶大霉素140mg/kg,連續(xù)注射6d,造模結(jié)束后第1天開(kāi)始進(jìn)行治療。本研究的陽(yáng)性藥物選用地塞米松,劑量為每天0.08mg/kg,維生素E劑量為每天80mg/kg,BMSCs劑量為每天每只大鼠1×106cells,均為尾靜脈注射,空白對(duì)照組和模型組給予等量溶劑,此階段各個(gè)實(shí)驗(yàn)組均連續(xù)注射6d。

    3.3炎癥蛋白mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 治療結(jié)束后第1天,處死各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,收集每組腎臟組織,各取40 mg的腎臟組織用1 mL Trizol 裂解液裂解,提取RNA后,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn),并以反轉(zhuǎn)后的cDNA為底物,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的操作,具體的反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作過(guò)程及反應(yīng)程序均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,引物序列見(jiàn)表1。

    表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的引物

    3.4炎癥介質(zhì)的蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 在治療結(jié)束后,收集各實(shí)驗(yàn)組大鼠血液,離心后分離血漿成分,用于炎癥蛋白的分析。同時(shí),收集各實(shí)驗(yàn)組的腎臟組織,每組取0.2 g 腎臟組織用于組織研磨,離心后進(jìn)一步收集組織研磨液,用于檢測(cè)炎癥蛋白。通過(guò)ELISA法從蛋白水平評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)組血漿和腎臟組織中炎癥蛋白的表達(dá)量,具體的操作過(guò)程按ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析,各組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 BMSCs的分離培養(yǎng)結(jié)果

    采用密度梯度離心法分離的大鼠BMSCs,用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),可以見(jiàn)到分離培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)(圖1A)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),可以見(jiàn)到細(xì)胞的生長(zhǎng)密度逐漸增大(圖1B),一般4~6 d后,即可見(jiàn)到細(xì)胞的密集生長(zhǎng)狀態(tài)(圖1C)。由此可見(jiàn),本研究分離的大鼠BMSCs具有一定的體外增殖能力。

    2 炎癥蛋白基因在腎臟組織中的表達(dá)結(jié)果

    單一的維生素E不能顯著改變MCP-1和IL-10的表達(dá),但是對(duì)于RANTES以及MIP-2的表達(dá)具有一定的抑制作用;另外,經(jīng)過(guò)陽(yáng)性藥物、BMSCs以及BMSCs聯(lián)合維生素E治療后,各種炎癥蛋白均有不同程度的下降,而且BMSCs聯(lián)合維生素E治療對(duì)RANTES以及MIP-2的抑制作用要明顯優(yōu)于干細(xì)胞或維生素E單一治療組,見(jiàn)圖2。

    Figure 1. The morphological characteristics of BMSCs. A: BMSCs cultured for 24 h; B: BMSCs cultured for 96 h; C: BMSCs cultured for 120 h. Scale bar = 200 μm.

    Figure 2. The mRNA expression of inflammatory proteins in the kidney tissues.Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

    3 各實(shí)驗(yàn)組血漿中炎癥蛋白的含量變化

    結(jié)果顯示,AKI大鼠血漿中的炎癥蛋白顯著增加;隨著治療的進(jìn)行,除IL-10以外,各實(shí)驗(yàn)組炎癥蛋白含量均有一定程度的下降,但是下降程度普遍較小,而且,維生素E組未見(jiàn)顯著療效;在MIP-2的調(diào)控方面,BMSCs聯(lián)合維生素E體現(xiàn)出最佳抑制效果,見(jiàn)圖3。

    4 各實(shí)驗(yàn)組腎臟中炎癥蛋白的含量變化

    對(duì)腎臟組織中的炎癥蛋白相對(duì)含量的檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn),各實(shí)驗(yàn)組的變化趨勢(shì)與實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)趨勢(shì)基本一致,但也略有不同。單一維生素E治療僅對(duì)MCP-1和MIP-2有一定的降低作用,而對(duì)于IL-10和RANTES沒(méi)有明顯作用。陽(yáng)性藥物對(duì)于MIP-2的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響,這一結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR中的結(jié)果一致。同時(shí),BMSCs聯(lián)合維生素E進(jìn)行治療對(duì)腎臟組織的RANTES以及MIP-2的調(diào)控存在抑制作用,也明顯優(yōu)于干細(xì)胞或維生素E的單一治療,見(jiàn)圖4。

    Figure 3. The protein levels of inflammatory proteins in the plasma of each group.Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

    Figure 4. The protein levels of inflammatory proteins in the kidney tissues.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

    討 論

    本課題從炎癥蛋白抑制的角度,進(jìn)一步評(píng)價(jià)BMSCs聯(lián)合維生素E對(duì)AKI的治療效果,分別檢測(cè)了血漿和腎臟組織中的MCP-1、IL-10、RANTES和MIP-2的表達(dá)水平,其中MCP-1、RANTES和MIP-2均屬于正性炎癥蛋白分子,即增強(qiáng)炎細(xì)胞活性作用,而IL-10則屬于負(fù)性炎癥蛋白分子,即抑制炎細(xì)胞活性作用。隨著炎癥反應(yīng)程度的增強(qiáng),正性炎癥蛋白分子的表達(dá)量會(huì)逐漸升高,由于機(jī)體的代償作用,負(fù)性炎癥蛋白分子也會(huì)隨之上調(diào)。在經(jīng)過(guò)一系列治療后,炎癥反應(yīng)得到緩解,正性炎癥蛋白分子的表達(dá)量也會(huì)逐漸下降,同時(shí),負(fù)性炎癥蛋白分子在達(dá)到一定程度后也會(huì)逐漸下降,恢復(fù)到正常水平。所以,正性炎癥蛋白分子與負(fù)性炎癥蛋白分子在本研究中體現(xiàn)了較為相似的變化趨勢(shì)。

    在本課題中,選取地塞米松作為陽(yáng)性藥物對(duì)急性腎損傷進(jìn)行治療,而且取得了一定療效。作為一種糖皮質(zhì)激素,地塞米松被廣泛用于腎損傷的臨床治療。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究方面,地塞米松也可用于多種類(lèi)型腎損傷(缺血再灌注損傷、環(huán)孢素A腎毒性損傷、硝酸雙氧鈾損傷和慶大霉素?fù)p傷等)的治療,而且均取得了一定療效[12]。所以,本課題選用地塞米松作為陽(yáng)性藥物,雖然與造模組相比發(fā)揮了一定的治療效果,對(duì)某些炎癥蛋白分子有一定的調(diào)控作用,但地塞米松并非對(duì)所有的炎性蛋白都具有調(diào)節(jié)作用,本課題中,該藥物對(duì)腎臟組織中的MIP-2沒(méi)有明顯的調(diào)控作用,而對(duì)血漿中的MIP-2有一定的調(diào)節(jié)。

    維生素E作為一種抗氧化劑,對(duì)氧自由基造成的損傷具有較強(qiáng)的保護(hù)作用,但是并不能直接起到抑制炎癥反應(yīng)的作用,所以,本課題中的維生素E治療組在炎癥抑制方面并未表現(xiàn)出明顯的抑制作用,對(duì)很多炎癥蛋白的抑制強(qiáng)度與其它治療組相比,仍然具有較大的差距。BMSCs在腎損傷治療方面的作用也被多個(gè)課題組證實(shí)[6-8,13],而且,間充質(zhì)細(xì)胞本身就具有分泌多種調(diào)控蛋白,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的功能,所以,本課題中的BMSCs治療組也有較好的療效,而且,對(duì)某些炎癥蛋白分子的調(diào)控作用優(yōu)于陽(yáng)性藥物組。

    目前,課題組已經(jīng)證實(shí):維生素E對(duì)BMSCs的增殖、分泌功能均無(wú)明顯的影響,二者聯(lián)合的優(yōu)化作用可能是單獨(dú)作用結(jié)果的疊加,而非二者的協(xié)同作用[11]。同時(shí),在炎癥抑制方面,維生素E只能通過(guò)抗氧自由基途徑緩解腎損傷癥狀,對(duì)炎癥反應(yīng)無(wú)直接作用;而B(niǎo)MSCs則可以通過(guò)多種途徑參與腎臟損傷修復(fù),并可直接抑制炎癥反應(yīng),緩解炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的腎損傷。由于作用途徑的不一致,BMSCs聯(lián)合維生素E的治療模式在某些炎癥介質(zhì)的抑制方面,效果優(yōu)于單一的干細(xì)胞或維生素E的治療模式,但是,尚無(wú)直接研究結(jié)果表明二者在炎癥抑制方面存在協(xié)同作用,本文中的聯(lián)合優(yōu)化效果仍然可能是二者單獨(dú)作用的結(jié)果,對(duì)此,尚有待進(jìn)一步的驗(yàn)證和分析。

    總的來(lái)講,本課題從抑制炎癥介質(zhì)的角度,評(píng)價(jià)了BMSCs聯(lián)合維生素E對(duì)AKI的治療效果。結(jié)果表明,與單一的治療模式相比,BMSCs聯(lián)合維生素E對(duì)某些炎癥蛋白具有更強(qiáng)的抑制效果。但是,本課題中所用干細(xì)胞和維生素E的劑量還比較單一,最佳的作用劑量和作用模式以及深入的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索和研究。

    [參 考 文 獻(xiàn)]

    [1]BellomoR,KellumJA,RoncoC.Acutekidneyinjury[J].Lancet, 2012, 380(9843):756-766.

    [2] Bonventre JV, Yang L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury[J]. J Clin Invest, 2011, 121(11):4210-4221.

    [3]RameshG,ReevesWB.Inflammatorycytokinesinacuterenalfailure[J].KidneyIntSuppl, 2004, (91):S56-S61.

    [4] Muniz-Junqueira MI, Braga Lopes C, Magalhaes CA, et al. Acute and chronic influence of hemodialysis according to the membrane used on phagocytic function of neutrophils and monocytes and pro-inflammatory cytokines production in chronic renal failure patients[J]. Life Sci, 2005, 77(25):3141-3155.

    [5]TogelF,HuZ,WeissK,etal.Administeredmesenchymalstemcellsprotectagainstischemicacuterenalfailurethroughdifferentiation-independentmechanisms[J].AmJPhysiolRenalPhysiol, 2005, 289(1):F31-F42.

    [6] Reis LA, Borges FT, Simoes MJ, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells repaired but did not prevent gentamicin-induced acute kidney injury through paracrine effects in rats[J]. PLoS One, 2012, 7(9):e44092.

    [7]LiuN,TianJ,ChengJ,etal.Effectoferythropoietinonthemigrationofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellstotheacutekidneyinjurymicroenvironment[J].ExpCellRes, 2013, 319(13):2019-2027.

    [8] Liu N, Tian J, Cheng J, et al. Migration of CXCR4 gene-modified bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the acute injured kidney[J]. J Cell Biochem, 2013, 114(12):2677-2689.

    [9] Ajith TA, Abhishek G, Roshny D, et al. Co-supplementation of single and multi doses of vitamins C and E ameliorates cisplatin-induced acute renal failure in mice[J]. Exp Toxicol Pathol, 2009, 61(6): 565-571.

    [10]SalehipourM,MonabbatiA,SalahiH,etal.ProtectiveeffectofparenteralvitaminEonischemia-reperfusioninjuryofrabbitkidney[J].Urology, 2010, 75(4): 858-861.

    [11] Liu P, Feng Y, Dong C, et al. Study on therapeutic action of bone marrow derived mesenchymal stem cell combined with vitamin E against acute kidney injury in rats[J]. Life Sci, 2013, 92(14-16):829-837.

    [12]LiuP,FengY,DongC,etal.AdministrationofBMSCswithmusconeinratswithgentamicin-inducedAKIimprovestheirtherapeuticefficacy[J].PLoSOne, 2014, 9(5):e97123.

    [13] 萬(wàn)建新, 郭 琦, 王敬瀚, 等. 細(xì)胞因子在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)小鼠急性腎衰竭中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2009, 25(8):1628-1634.

    猜你喜歡
    造模干細(xì)胞腎臟
    干細(xì)胞:“小細(xì)胞”造就“大健康”
    保護(hù)腎臟從體檢開(kāi)始
    中老年保健(2022年3期)2022-08-24 02:58:10
    3種冠狀病毒感染后的腎臟損傷研究概述
    腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型建立方法及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展
    脾腎陽(yáng)虛型骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型造模方法及模型評(píng)價(jià)
    濕熱證動(dòng)物模型造模方法及評(píng)價(jià)研究
    造血干細(xì)胞移植與捐獻(xiàn)
    哪些藥最傷腎臟
    憑什么要捐出我的腎臟
    特別健康(2018年9期)2018-09-26 05:45:46
    干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的春天來(lái)了?
    久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产成人影院久久av| 亚洲人成电影观看| 日韩欧美在线二视频| 成人精品一区二区免费| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久精品成人免费网站| 国产精品永久免费网站| 亚洲色图av天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产一区二区激情短视频| 久久久久九九精品影院| 最新美女视频免费是黄的| 一本大道久久a久久精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 久久午夜综合久久蜜桃| 在线观看免费视频日本深夜| 免费在线观看影片大全网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 婷婷六月久久综合丁香| 日韩三级视频一区二区三区| 又大又爽又粗| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美乱色亚洲激情| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲熟妇熟女久久| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美大码av| 日韩精品中文字幕看吧| 国产成人系列免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久伊人香网站| 美女国产高潮福利片在线看| 国产主播在线观看一区二区| 日韩大码丰满熟妇| 欧美久久黑人一区二区| 999精品在线视频| 99热只有精品国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久青草综合色| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精华国产精华精| 老司机福利观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人精品无人区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 色播在线永久视频| 日本五十路高清| 免费高清在线观看日韩| av片东京热男人的天堂| 欧美性长视频在线观看| 久久亚洲精品不卡| 黄片大片在线免费观看| 成人欧美大片| av中文乱码字幕在线| 大陆偷拍与自拍| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 香蕉久久夜色| 国产真人三级小视频在线观看| 大陆偷拍与自拍| 免费不卡黄色视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| av天堂在线播放| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲专区字幕在线| 欧美在线黄色| 亚洲五月天丁香| √禁漫天堂资源中文www| 激情在线观看视频在线高清| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久久久久久久久大奶| svipshipincom国产片| 国产精品免费视频内射| 91精品三级在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 久久久久久久久免费视频了| www.自偷自拍.com| 黄频高清免费视频| svipshipincom国产片| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲久久久国产精品| 好男人在线观看高清免费视频 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲免费av在线视频| 午夜福利影视在线免费观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产激情久久老熟女| 成年版毛片免费区| 宅男免费午夜| 国产av又大| 黄色毛片三级朝国网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 成年人黄色毛片网站| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 在线观看日韩欧美| 9191精品国产免费久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲色图综合在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 一区二区三区精品91| 精品国产乱子伦一区二区三区| 999精品在线视频| 国产三级黄色录像| 欧美中文日本在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 99在线人妻在线中文字幕| 中文字幕人妻熟女乱码| 天天一区二区日本电影三级 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 悠悠久久av| 视频区欧美日本亚洲| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品免费一区二区三区在线| 热99re8久久精品国产| 咕卡用的链子| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精华一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品国产美女av久久久久小说| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 高清毛片免费观看视频网站| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲精品一区av在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 涩涩av久久男人的天堂| 一区二区三区精品91| 丁香六月欧美| 国产高清激情床上av| 十八禁人妻一区二区| 九色国产91popny在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩av在线大香蕉| 啦啦啦韩国在线观看视频| av天堂在线播放| 国产成人精品久久二区二区91| 成人18禁在线播放| 嫩草影视91久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美中文综合在线视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩av在线大香蕉| 真人做人爱边吃奶动态| 在线观看免费视频网站a站| 久久九九热精品免费| 国产精品野战在线观看| 欧美黑人精品巨大| 免费在线观看亚洲国产| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产一区二区在线av高清观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 操出白浆在线播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲第一青青草原| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲成人免费电影在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲在线自拍视频| 国产男靠女视频免费网站| 国产成人精品久久二区二区91| 久久热在线av| 韩国精品一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频 | 麻豆国产av国片精品| 精品国产国语对白av| 午夜a级毛片| 制服诱惑二区| www日本在线高清视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 99国产精品一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 极品人妻少妇av视频| 成人国产综合亚洲| 国产一卡二卡三卡精品| 十分钟在线观看高清视频www| 午夜激情av网站| 免费高清视频大片| 久久伊人香网站| 久久精品91蜜桃| 90打野战视频偷拍视频| 91大片在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 色播亚洲综合网| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩成人在线观看一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 长腿黑丝高跟| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 日本 欧美在线| 脱女人内裤的视频| 婷婷六月久久综合丁香| 最新在线观看一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 青草久久国产| 老司机在亚洲福利影院| 天天添夜夜摸| 亚洲精品国产色婷婷电影| 乱人伦中国视频| 麻豆av在线久日| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日韩有码中文字幕| 精品不卡国产一区二区三区| 免费观看人在逋| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产男靠女视频免费网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 一二三四在线观看免费中文在| av有码第一页| 热99re8久久精品国产| 欧美成人免费av一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 99国产精品免费福利视频| 国产单亲对白刺激| www.自偷自拍.com| 国产成人影院久久av| 一本综合久久免费| 亚洲精品美女久久av网站| 婷婷丁香在线五月| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 禁无遮挡网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 亚洲自拍偷在线| 日韩视频一区二区在线观看| 日本三级黄在线观看| 精品电影一区二区在线| 久久久久九九精品影院| 老司机在亚洲福利影院| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 黄色 视频免费看| 久久久久久久精品吃奶| 欧美乱色亚洲激情| 成人亚洲精品一区在线观看| 看免费av毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 在线av久久热| 久久久久亚洲av毛片大全| 在线观看午夜福利视频| 成人国产综合亚洲| 黄频高清免费视频| 咕卡用的链子| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 成年女人毛片免费观看观看9| 悠悠久久av| 一级,二级,三级黄色视频| 91在线观看av| videosex国产| 精品国产乱子伦一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 免费在线观看亚洲国产| 大型黄色视频在线免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美不卡视频在线免费观看 | 高清在线国产一区| 欧美性长视频在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 视频区欧美日本亚洲| 国产成人影院久久av| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品免费视频内射| 欧美av亚洲av综合av国产av| 99在线人妻在线中文字幕| 大型av网站在线播放| svipshipincom国产片| 曰老女人黄片| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 美女国产高潮福利片在线看| 国产欧美日韩一区二区三| 国产麻豆69| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美一级a爱片免费观看看 | 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产区一区二久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲中文字幕日韩| 国产不卡一卡二| 亚洲精华国产精华精| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 性欧美人与动物交配| 老司机福利观看| 国产成人av激情在线播放| 老汉色∧v一级毛片| 美女午夜性视频免费| av有码第一页| 性欧美人与动物交配| 色老头精品视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成人三级做爰电影| 激情视频va一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| svipshipincom国产片| 久久久久久人人人人人| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 99香蕉大伊视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲国产精品成人综合色| 9191精品国产免费久久| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲久久久国产精品| 色尼玛亚洲综合影院| av在线播放免费不卡| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久国产成人精品二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品国产一区二区久久| 亚洲专区中文字幕在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产区一区二久久| 免费少妇av软件| 女人被狂操c到高潮| 精品人妻1区二区| aaaaa片日本免费| 好男人电影高清在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 91字幕亚洲| 精品熟女少妇八av免费久了| 自线自在国产av| 欧美日韩福利视频一区二区| 男人舔女人的私密视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品影院久久| 久久久国产成人精品二区| 精品久久久久久,| 国产亚洲欧美98| 精品人妻1区二区| 两人在一起打扑克的视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 99久久精品国产亚洲精品| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲熟女毛片儿| 久久久久国内视频| 欧美日韩黄片免| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 女警被强在线播放| 国产男靠女视频免费网站| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲av电影不卡..在线观看| av欧美777| www.精华液| 国产av一区二区精品久久| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲第一电影网av| 岛国视频午夜一区免费看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 在线天堂中文资源库| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产一区二区在线av高清观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲国产欧美网| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黄色 视频免费看| 日本一区二区免费在线视频| 村上凉子中文字幕在线| www.精华液| 成人三级黄色视频| 欧美中文综合在线视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 中文字幕人妻熟女乱码| 免费看a级黄色片| 热99re8久久精品国产| 最好的美女福利视频网| 99久久综合精品五月天人人| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产激情久久老熟女| 国产精品久久久人人做人人爽| 校园春色视频在线观看| 午夜免费观看网址| 色av中文字幕| 久久精品国产清高在天天线| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 国产99久久九九免费精品| 久久精品人人爽人人爽视色| 怎么达到女性高潮| 亚洲性夜色夜夜综合| 免费观看精品视频网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 韩国av一区二区三区四区| 一个人免费在线观看的高清视频| 99国产精品一区二区三区| 一级片免费观看大全| 色婷婷久久久亚洲欧美| 麻豆av在线久日| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日本 欧美在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲天堂国产精品一区在线| 波多野结衣av一区二区av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日韩欧美三级三区| 两个人看的免费小视频| 国产成人精品在线电影| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品九九99| 91九色精品人成在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲专区字幕在线| 国产精品 国内视频| 曰老女人黄片| 男人操女人黄网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 后天国语完整版免费观看| 乱人伦中国视频| 久久久国产成人精品二区| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品一区二区在线不卡| 免费av毛片视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 91成年电影在线观看| 国产精品野战在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 精品久久久精品久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲色图综合在线观看| 免费观看人在逋| 麻豆成人av在线观看| 亚洲精华国产精华精| 伦理电影免费视频| 一二三四社区在线视频社区8| 成人精品一区二区免费| 亚洲七黄色美女视频| 免费无遮挡裸体视频| 香蕉国产在线看| 乱人伦中国视频| 亚洲欧美激情综合另类| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精华一区二区三区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 在线观看日韩欧美| 国产一区在线观看成人免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 高清黄色对白视频在线免费看| 成人特级黄色片久久久久久久| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲精品在线观看二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人精品一区二区免费| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲全国av大片| av福利片在线| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国内精品久久久久久久电影| 亚洲 国产 在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久香蕉国产精品| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av熟女| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品欧美国产一区二区三| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 91老司机精品| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久香蕉激情| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 成人免费观看视频高清| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久久国产精品麻豆| 欧美激情久久久久久爽电影 | 激情视频va一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲avbb在线观看| 变态另类丝袜制服| 窝窝影院91人妻| 日日干狠狠操夜夜爽| 老司机靠b影院| 一区在线观看完整版| 久久国产乱子伦精品免费另类| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 高清在线国产一区| 久久中文看片网| 99精品在免费线老司机午夜| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品一区二区三区av网在线观看| 变态另类丝袜制服| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 91成年电影在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产av一区二区精品久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费看美女性在线毛片视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | xxx96com| 久久久精品欧美日韩精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| av在线天堂中文字幕| 超碰成人久久| 亚洲人成电影免费在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 两个人视频免费观看高清| 午夜福利高清视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品国产美女av久久久久小说| 色综合婷婷激情| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产高清videossex| 国产精品精品国产色婷婷| 妹子高潮喷水视频| 国内精品久久久久久久电影| 午夜福利,免费看| 岛国在线观看网站| 久久九九热精品免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 看黄色毛片网站| 丝袜人妻中文字幕| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 妹子高潮喷水视频| 久久久国产成人精品二区| 在线天堂中文资源库| 少妇 在线观看| 成人手机av| 色在线成人网| 成人欧美大片| 又大又爽又粗| 老汉色∧v一级毛片| 多毛熟女@视频| 天天添夜夜摸| 丝袜在线中文字幕| 午夜老司机福利片| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| 美女 人体艺术 gogo| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 中文字幕久久专区| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲成国产人片在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 一级a爱视频在线免费观看| aaaaa片日本免费| 久久狼人影院| 咕卡用的链子| 69精品国产乱码久久久| 嫩草影视91久久| 淫妇啪啪啪对白视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| www.精华液| 日本免费a在线|