圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性測(cè)定

茍亞峰等

摘 要 采用液-液分配法對(duì)圓滑番荔枝葉乙醇提取物進(jìn)行萃取分離，得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯等不同萃取組分。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑制作用。結(jié)果表明：乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑制作用最強(qiáng)，其中20 mg/mL乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到74.43%，具有較好的抑菌效果。

關(guān)鍵詞 圓滑番荔枝葉 ；萃取組分 ；胡椒瘟病菌 ；抑菌活性

分類(lèi)號(hào) S667.9 ；S435.72

Determination of the Antifungal Activity of Ethanol Extracts from

Annona glabra Leaf against Phytophthora capsici

GOU Yafeng1，2） SUN Shiwei1，2） GAO Shengfeng1，2） SANG Liwei1，2） LIU Aiqin1，2）

（1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533；

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for

Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533）

Abstract Annona glabra leaf ethanol extracts were extracted by liquid - liquid partition method. Getting different petroleum ether， trichloromethane， ethyl acetate extract components. Testing the different components antifungal activity against Phytophthora capsici with growth rate method. The results showed that the ethyl acetate extract components had high inhibition rate against Phytophthora capsici mycelium growth. When the concentration was 20 mg/mL， the inhibition rate reached to 74.43%.

Keywords Annona glabra leaf ； extract components ； Phytophthora capsici ； antifungal activity 胡椒瘟病是一種由疫霉屬病原菌（Phytophthora capsici）引起的傳染力很強(qiáng)的土傳病害，常在雨季時(shí)發(fā)生[1]。胡椒瘟病是胡椒生產(chǎn)中災(zāi)難性病害，病害發(fā)生輕微時(shí)，可使胡椒產(chǎn)量損失5%-30%；感病嚴(yán)重的胡椒可整株萎蔫枯死，損失達(dá)90%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。目前國(guó)內(nèi)防治胡椒瘟病主要以化學(xué)防治技術(shù)為主[4-6]。國(guó)外Kasim R研究了甲霜靈、疫霜靈等對(duì)胡椒瘟病的室內(nèi)和大田防治效果[7]。由于長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅容易引起抗藥性，而且容易破壞胡椒園的生態(tài)環(huán)境和降低胡椒產(chǎn)品品質(zhì)。

圓滑番荔枝（Annona glabra Linn.）是番荔枝科番荔枝屬植物。番荔枝科植物具有抗病毒、蟲(chóng)、抗癌等多種生理活性。早在1982年由M.Leboeuf等報(bào)道番荔枝科植物中含有各種生物堿、糖類(lèi)、脂肪酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、多酚類(lèi)、揮發(fā)油、帖類(lèi)及各式芳香性化合物。田娟[8]、志明[9]等從圓滑番荔枝中分離得到萜烯類(lèi)、生物堿等化合物，該類(lèi)化合物已報(bào)道具有很強(qiáng)的抗癌作用。有研究報(bào)道圓滑番荔枝乙醇提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)有較好的抑制作用[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)以胡椒瘟病菌為供試病原菌，測(cè)定圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性，為進(jìn)一步分離抑制胡椒瘟病菌的活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物

圓滑番荔枝（Annona glabra Linn.）采于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所。將新鮮的圓滑番荔枝葉充分陰干，磨碎過(guò)40目篩后置通風(fēng)、避光處儲(chǔ)藏備用。

1.1.2 病原菌

胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所病蟲(chóng)害防控研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 圓滑番荔枝提取物的制備

冷浸法：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 kg的圓滑番荔枝葉干粉裝入廣口瓶中，加入干粉5倍量的乙醇浸提48 h并將濾液減壓濃縮，依次重復(fù)3次，合并3次的濃縮液放置4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 圓滑番荔枝提取物不同萃取物的制備

液-液萃取法：準(zhǔn)確稱(chēng)取圓滑番荔枝葉乙醇提取物浸膏5 g加入10倍量的蒸餾水，裝入分液漏斗中混勻，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯各萃取3次，每次50 mL。分別合并各溶劑萃取液，減壓濃縮分別得圓滑番荔枝葉乙醇提取物石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分浸膏，備用（圖1）。

1.2.3 圓滑番荔枝提取物不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的影響

菌絲生長(zhǎng)速率法：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同萃取物浸膏，先用1 mL無(wú)水乙醇助溶，再用無(wú)菌蒸餾水定容至20 mL，制成20 mg/mL的萃取物母液。采用倍半稀釋法用無(wú)菌蒸餾水稀釋?zhuān)来沃瞥蓾舛葹?0、5、2.5、1.25 mg/mL藥液。然后將培養(yǎng)基融化并冷卻至50℃左右時(shí)，把1 mL不同濃度的圓滑番荔枝萃取組分分別與9 mL/皿的PDA培養(yǎng)基混合，搖勻待其凝固后，取菌落直徑為6 mm、培養(yǎng)好的胡椒瘟病菌的外層菌塊放置于培養(yǎng)皿中央，以加入等體積萃取溶劑滅菌水的PDA培養(yǎng)平板為對(duì)照，每個(gè)處理做3個(gè)皿重復(fù)。接種后，在人工氣候培養(yǎng)箱（25～28℃）下培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法分別測(cè)量菌落直徑，求其平均值，按下式計(jì)算抑菌率。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 圓滑番荔枝葉提取率

供試植物采用冷浸提的方法提取，并減壓濃縮至浸膏，得圓滑番荔枝葉提取率為17.15%。

2.2 圓滑番荔枝葉提取物不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌活性測(cè)定

圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同溶劑萃取組分分別用倍半稀釋法配成5個(gè)梯度濃度（20、10、5、2.5、1.25 mg/mL），對(duì)胡椒瘟病菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2中可以看出，在供試濃度下，乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌率均高于石油醚和三氯甲烷萃取組分。當(dāng)供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分的抑菌率最高，達(dá)到74.43%，具有較好的抑菌效果。

3 討論與結(jié)果

從植物中尋找新型、具抑菌活性的天然化合物，并對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾，以篩選出活性更高的新化合物，是當(dāng)前植物源殺菌劑研究的重點(diǎn)。從以上的結(jié)果可以得出，石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取圓滑番荔枝葉乙醇提取物各組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性具有較大差異。當(dāng)供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最高，達(dá)到74.43%。由此可見(jiàn)，從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中分離對(duì)胡椒瘟病菌具有抑菌作用的活性成分具有廣闊前景，為進(jìn)一步研發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好型的植物源殺菌劑奠定了基礎(chǔ)，對(duì)胡椒安全生產(chǎn)和胡椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 桑利偉，譚樂(lè)和，劉愛(ài)勤，等. 海南省胡椒主要病害現(xiàn)狀初步調(diào)查[J]. 植物保護(hù)，2010，36（5）：133-138.

[2] 桑利偉，劉愛(ài)勤，譚樂(lè)和，等. 胡椒瘟病田間發(fā)生規(guī)律觀察[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2010，31（11）：1 996-1 999.

[3] 崔昌華，鄭服叢，賀春萍，等. 海南胡椒主要真菌病害調(diào)查與病原鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：3 355-3 358.

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[7] Kasim R. The control of foot rot disease of pepper caused by Phytophthora palmivora using fungicides[J]. Edisi Khusus Penelitian Tanaman Rempah dan Obat， 1986， 11（2）： 63-66.

[8] 田麗娟，楊念云，孟正木，等. 圓滑番荔枝的化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（4）：258-260.

[9] 畢志明，蒯玉花，李 萍，等. 圓滑番荔枝樹(shù)皮中的化學(xué)成分[J]. 江蘇：藥學(xué)與臨床研究，2006，14（1）：38-39.

[10] 茍亞峰，劉愛(ài)勤，孫世偉，等. 23種植物提取物對(duì)胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 2010，36（6）：128-131.endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 圓滑番荔枝葉提取率

供試植物采用冷浸提的方法提取，并減壓濃縮至浸膏，得圓滑番荔枝葉提取率為17.15%。

2.2 圓滑番荔枝葉提取物不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌活性測(cè)定

圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同溶劑萃取組分分別用倍半稀釋法配成5個(gè)梯度濃度（20、10、5、2.5、1.25 mg/mL），對(duì)胡椒瘟病菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2中可以看出，在供試濃度下，乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌率均高于石油醚和三氯甲烷萃取組分。當(dāng)供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分的抑菌率最高，達(dá)到74.43%，具有較好的抑菌效果。

3 討論與結(jié)果

從植物中尋找新型、具抑菌活性的天然化合物，并對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾，以篩選出活性更高的新化合物，是當(dāng)前植物源殺菌劑研究的重點(diǎn)。從以上的結(jié)果可以得出，石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取圓滑番荔枝葉乙醇提取物各組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性具有較大差異。當(dāng)供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最高，達(dá)到74.43%。由此可見(jiàn)，從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中分離對(duì)胡椒瘟病菌具有抑菌作用的活性成分具有廣闊前景，為進(jìn)一步研發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好型的植物源殺菌劑奠定了基礎(chǔ)，對(duì)胡椒安全生產(chǎn)和胡椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

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[10] 茍亞峰，劉愛(ài)勤，孫世偉，等. 23種植物提取物對(duì)胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 2010，36（6）：128-131.endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 圓滑番荔枝葉提取率

供試植物采用冷浸提的方法提取，并減壓濃縮至浸膏，得圓滑番荔枝葉提取率為17.15%。

2.2 圓滑番荔枝葉提取物不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌活性測(cè)定

圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同溶劑萃取組分分別用倍半稀釋法配成5個(gè)梯度濃度（20、10、5、2.5、1.25 mg/mL），對(duì)胡椒瘟病菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2中可以看出，在供試濃度下，乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌率均高于石油醚和三氯甲烷萃取組分。當(dāng)供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分的抑菌率最高，達(dá)到74.43%，具有較好的抑菌效果。

3 討論與結(jié)果

從植物中尋找新型、具抑菌活性的天然化合物，并對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾，以篩選出活性更高的新化合物，是當(dāng)前植物源殺菌劑研究的重點(diǎn)。從以上的結(jié)果可以得出，石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取圓滑番荔枝葉乙醇提取物各組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性具有較大差異。當(dāng)供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最高，達(dá)到74.43%。由此可見(jiàn)，從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中分離對(duì)胡椒瘟病菌具有抑菌作用的活性成分具有廣闊前景，為進(jìn)一步研發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好型的植物源殺菌劑奠定了基礎(chǔ)，對(duì)胡椒安全生產(chǎn)和胡椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定促進(jìn)作用。

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[5] 邢谷楊. 胡椒無(wú)公害生產(chǎn)及其主要病蟲(chóng)害防治[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)， 2004（6）：34-35.

[6] 黃家峰. 胡椒瘟病的觀察及其防治[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，1986（2）：44-45.

[7] Kasim R. The control of foot rot disease of pepper caused by Phytophthora palmivora using fungicides[J]. Edisi Khusus Penelitian Tanaman Rempah dan Obat， 1986， 11（2）： 63-66.

[8] 田麗娟，楊念云，孟正木，等. 圓滑番荔枝的化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（4）：258-260.

[9] 畢志明，蒯玉花，李 萍，等. 圓滑番荔枝樹(shù)皮中的化學(xué)成分[J]. 江蘇：藥學(xué)與臨床研究，2006，14（1）：38-39.

[10] 茍亞峰，劉愛(ài)勤，孫世偉，等. 23種植物提取物對(duì)胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 2010，36（6）：128-131.endprint