柱花草AFLP反應(yīng)體系的建立與引物篩選

韓蓉蓉等

摘 要 以柱花草奧克雷品種為材料，采用改良的CTAB法提取基因組DNA，對影響AFLP反應(yīng)體系的主要因素進行了優(yōu)化，建立了柱花草的AFLP反應(yīng)體系。結(jié)果表明：20 μL為最佳反應(yīng)體系，酶切體系中DNA模板量為1 000 ng，用5 U EcoR I 37℃酶切2 h、5 U Mse I 65℃酶切2 h效果最佳；分別取5 μL酶切液、1 μL T4連接酶（5 μL/L）、1 μL EcoR I接頭、1 μL Mse I接頭、2 μL緩沖液（T4DNA酶自帶），于22℃下連接10 min效果最佳；預(yù)擴增體系中模板稀釋15倍、Mg2+濃度為0.75 mmol/L、Taq酶用量為1 U、dNTPs濃度為0.2 mmol/L、引物濃度為2 ng/μL效果最佳；選擇擴增體系中模板稀釋20倍、Mg2+濃度為1.25 mmol/L、Taq酶為1 U、dNTPs濃度為0.225 mmol/L、引物濃度為0.4 ng/μL效果最佳。利用熱研5號、奧克雷2個品種對8對引物組合進行篩選，篩選出46對引物組合，為利用AFLP標記對柱花草進行分子生物學(xué)研究及分子育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 柱花草 ；DNA ；AFLP ；引物篩選

分類號 S541

Establishment of AFLP Reaction System in Stylosanthes guianensias

and Its Primer Selection

HAN Rongrong1，2） ZENG Liqiong2） SHI Liangtao3）

LIU Guodao4） HE Guangxiong3） WEN Yifei1） JIN Jie3）

（1 College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201；

2 Biotechnology and Genetic Germplasm Institute / Yunnan Provincial Key Lab of Agricultural Biotechnology / Ministry of Agriculture Key Lab of Southwestern Crop Gene Resource and Germplasm Innovation，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming，Yunnan 650223；

3 Research Institute of Tropical Eco-agriculture Sciences，

Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yuanmou，Yunnan 651300；

4 Tropical Crop Genetic Resources Institute，CATAS， Danzhou，Hainan 571737）

Abstract Extract the total DNA of Stylosanthes guianensis using an improved method of CTAB. The Stylosanthes guianensis AFLP system was established and its primers were selected for analysis by optimizing the main factors affecting the AFLP system. The results indicate that the AFLP optimum conditions for restriction enzyme digestion of the Stylosanthes guianensis were as follows： 1 000 ng DNA template，5 U EcoR I at 37℃ for 2 h and 5 U Mse I at 65℃ for 2 h in 20 μL optimum reaction volume； the optimum ligation system （20 μL） was 5 μL the digestion product，1 μL T4 ligation enzyme（5 μL/L），1 μL EcoR I adapter and 1 μL Mse I adapter and 2 μLT4 Buffer reacting at 22℃ for 10 min；The preamplification reaction （20 μL） with 5μL the ligation fragment which was diluted 15 times， 0.75 mmol/L Mg2+，1 U Taq enzyme，0.2 mmol/L dNTPs，2ng/μL EcoR I and Mse I primer was the optimum condition；The selective amplification reaction （20 μL） with 5 μL preamplification product which was diluted 20 times， 1.25 mmol/L Mg2+， 1 U Taq enzyme， 0.225 mmol/L dNTP， 0.4 ng/μL EcoR I and Mse I primer was the optimum condition. Finally， 46 pairs of primers were screened out for the AFLP analysis of Stylosanthes guianensis. Lay a foundation of molecular biology research and molecular breeding of Stylosanthes guianensis by AFLP molecular marker.endprint

Keywords Stylosanthes guianensis ； DNA ； AFLP ； primer selection

AFLP（Amplified fragment length polymorphism）即擴增片段長度多態(tài)性，是由荷蘭科學(xué)家Vos等[1]提出的一種檢測DNA分子多態(tài)性的分子標記技術(shù)，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性。目前，該技術(shù)在植物遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析[2-3]、植物分子遺傳圖譜的構(gòu)建和重要性狀基因定位[4-5]、植物親緣關(guān)系鑒定[6-7]、分子標記輔助選擇育種[8]等方面得到廣泛應(yīng)用。柱花草（Stylosanthes guianensis）是多年生豆科植物，是世界上熱帶、亞熱帶地區(qū)最重要的放牧和刈割兼用型豆科牧草[9]。目前，有關(guān)柱花草的研究大都集中在病害、抗性以及逆境對其生長的影響方面，而關(guān)于柱花草分子標記方面的研究較少，目前有ISSR[10]、RAPD[11-12]、SRAP[13]、微衛(wèi)星標記[14]的相關(guān)報道。關(guān)于柱花草AFLP分子標記的報道，有感病與抗病柱花草遺傳多樣性的AFLP分析[15]，但是并沒有建立最佳的APLP反應(yīng)體系。本研究以奧克雷為材料，進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，從而建立柱花草AFLP分析的最佳體系，同時利用熱研5號、奧克雷柱花草進行引物篩選，為開展柱花草遺傳多樣性、圖譜構(gòu)建等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所實驗基地培育的熱研5號、奧克雷柱花草。

1.1.2 試劑

試驗使用的EcoR I酶，Mse I酶，T4 DNA連接酶，dNTPs，Taq聚合酶均購自Thermo公司；RNA酶購自Takara公司；引物接頭序列（表1）由上海生工公司合成。

1.1.3 主要儀器

DNA擴增儀（Biometra Tprofessional PCR儀），電泳儀（北京六一 DYY-6C型號），凝膠成像系統(tǒng)（Syngene），紫外分光光度計（Beckman Coulter DU730）。

1.2 方法

1.2.1 柱花草基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法，參考孫小武等[16]的西瓜根尖快速提取DNA方法，稍作改進。

1.2.2 柱花草AFLP反應(yīng)體系優(yōu)化

（1）酶切連接體系 采用20 μL反應(yīng)體系。酶切體系設(shè)模板濃度、酶切時間以及單酶切雙酶切3個變量。其中模板濃度設(shè)為800、1 000、1 200、1 400 ng 4個梯度；酶切時間設(shè)1、1.5、2、1.5 h 4個梯度。單酶切：分別在各模板中加入EcoR I酶（10 U/μL）0.5 μL， Buffer EcoR I 2.5 μL，加ddH2O補足20 μL，充分混合后瞬離，以37 ℃溫?。〞r間梯度1、1.5、2、2.5 h），再以65℃對酶滅活20 min；分別取上述EcoR I單酶切液15 μL，加入Buffer R 2 μL，Mse I酶（10 U/μL）0.5 μL，充分混合后瞬離，以65℃溫?。ㄔO(shè)與EcoR I酶切相應(yīng)的時間梯度）、80℃對酶滅活20 min；雙酶切：分別在各模板中加入EcoR I酶（10 U/μL）0.5 μL，Mse I酶（10 U/μL）0.5 μL，Buffer Tango 2 μL，模板DNA 1 000 ng ，加ddH2O補足20 μL，充分混合后瞬離，以37℃溫?。〞r間梯度1、1.5、2、2.5 h）、80℃對酶滅活20 min。

取終酶切液5 μL，T4 DNA連接酶（5 μL/L）1 μL，EcoR I接頭1 μL，Mse I接頭1 μL，緩沖液（T4 DNA連接酶自帶）2 μL，加ddH2O補足20 μL，按Thermo公司的T4 DNA連接酶說明書連接10min。

（2）預(yù)擴增體系 采用20 μL反應(yīng)體系。在其他參數(shù)不變的條件下，分別對連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、Mg2+用量、Taq聚合酶用量、dNTPs用量、引物用量進行優(yōu)化。連接產(chǎn)物分別稀釋5、10、15、20、25倍，總體系Mg2+濃度梯度設(shè)為0.25、0.5、0.75、1、1.25 mmol/L，Taq聚合酶用量梯度設(shè)為0.5、1、1.5、2、2.5 U，總體系dNTPs濃度梯度設(shè)為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L，引物濃度梯度設(shè)為1、1.5、2、2.5、3 ng/μL.反應(yīng)擴增條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min（25個循環(huán)）；72℃ 5 min。

（3）選擇擴增體系 采用20 μL反應(yīng)體系。在其他參數(shù)不變的條件下，分別對連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、Mg2+用量、Taq聚合酶用量、dNTPs用量、引物用量進行優(yōu)化。連接產(chǎn)物分別稀釋10、15、20、25、30倍，總體系Mg2+濃度梯度設(shè)為0.5、0.75、1、1.25、1.5 mmol/L，Taq聚合酶用量梯度設(shè)為0.5、1、1.5、2、2.5 U，總體系dNTPs濃度梯度設(shè)為0.175、0.2、0.225、0.25、0.275 mmol/L，引物濃度梯度設(shè)為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ng/μL。反應(yīng)程序為：94℃ 4 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min；94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min（12個循環(huán)）；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min（23個循環(huán)）。

1.2.3 引物篩選

利用優(yōu)化后的柱花草AFLP反應(yīng)體系，采用熱研5號、奧克雷2個品種對8對引物組合進行篩選，從中篩選出適合柱花草AFLP分析的譜帶清晰且多態(tài)性好的擴增引物。

2 結(jié)果與分析endprint

2.1 柱花草基因組DNA的質(zhì)量

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖 1）表明，DNA片段達到2 000 bp以上，能滿足AFLP分析要求。經(jīng)紫外分光光度計測定可知，所提取的柱花草基因組DNA OD260=0.101，OD280=0.051，OD260/280=1.98，說明提取的DNA可以滿足柱花草AFLP反應(yīng)的要求。稀釋DNA濃度為100 ng/μL。

2.2 柱花草AFLP反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1 酶切連接體系優(yōu)化

不同梯度用量的柱花草基因組DNA對酶切并無顯著影響，從連接DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖 2）可以看出，1 000、1 200、1 400 ng模板用量的連接DNA條帶亮度一致，較800 ng模板用量要亮。選取1 000 ng柱花草DNA進行不同時間（1、1.5、2、2.5 h）酶切處理后，同樣沒有顯著區(qū)別。由于所用緩沖液會影響EcoR I酶與Mse I酶的催化效率，2種酶用各自的緩沖液的催化效率要顯著高于共用緩沖液Buffer Tango，所以采用單酶切效果較好。綜上所述， 1 000 ng DNA為最佳模板用量，EcoR I酶5 U、Mse I酶5 U分別酶切2 h為宜。

連接體系為：雙酶切液5 μL，加入EcoR I 接頭 1 μL，Mse I接頭 1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，Buffer 2 μL，ddH2O 10 μL，22℃連接10 min。

2.2.2 預(yù)擴增體系優(yōu)化

對連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、Mg2+濃度、Taq聚合酶用量、dNTPs 濃度以及引物濃度進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)與Mg2+濃度對預(yù)擴增的影響不顯著（圖3、4）。當連接產(chǎn)物分別稀釋5、10、15、20、25倍時，擴增片段大小幾乎相同，因此，柱花草AFLP預(yù)擴增體系中連接產(chǎn)物稀釋5～25倍均可，本研究認為連接產(chǎn)物稀釋15倍較為適宜。Mg2+濃度為0.75 mmol/L時，擴增產(chǎn)物片段分散最好，是柱花草AFLP預(yù)擴增反應(yīng)體系的最佳Mg2+濃度。

從圖5可知，Taq聚合酶對預(yù)擴增影響較大。當Taq聚合酶為0.5 U時，擴增產(chǎn)物量較少；當酶量為1、1.5 U時，擴增產(chǎn)物量明顯增多，當酶量繼續(xù)增多時擴增產(chǎn)物量又有所減少。因此，確定柱花草AFLP預(yù)擴增反應(yīng)體系的最佳Taq聚合酶用量為1 U。

從圖6可知，dNTPs濃度對預(yù)擴增影響不明顯。當dNTPs濃度為0.1、0.15、0.2、0.3 mmol/L時，擴增產(chǎn)物量基本相同；當dNTPs濃度為0.25 mmol/L時，產(chǎn)物量略有增加，可能是PCR過程中局部溫度過高，PCR管內(nèi)蒸發(fā)量加大導(dǎo)致濃度上升。綜合考慮選取0.2 mmol/L為柱花草AFLP預(yù)擴增反應(yīng)體系的最佳dNTPs濃度。

從圖 7可知，引物濃度對預(yù)擴增的影響很大，從1 ng/μL到2 ng/μL，預(yù)擴增產(chǎn)物量明顯增多。引物濃度為2.5 ng/μL與2 ng/μL的預(yù)擴增產(chǎn)物量大致相同。而當引物濃度增加到3 ng/μL時，預(yù)擴增產(chǎn)物量過多。因此，選取2 ng/μL為柱花草AFLP預(yù)擴增反應(yīng)體系的最佳引物濃度。

2.2.3 選擇擴增體系優(yōu)化

從預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、Taq聚合酶用量、dNTPs 濃度、Mg2+濃度以及引物濃度5方面進行選擇擴增體系優(yōu)化。圖8～10表明，預(yù)擴增產(chǎn)物用量、Taq聚合酶用量和dNTPs 濃度對選擇擴增都沒有明顯影響。從圖11可知，Mg2+濃度對選擇擴增有較大影響。當Mg2+濃度為0.5、0.75 mmol/L時，擴增出的產(chǎn)物量較少，條帶亮度較低；但當濃度在1、1.25、1.5 mmol/L時，擴增出的產(chǎn)物量逐漸增加，但是增加幅度不明顯。圖 12顯示，引物濃度對選擇擴增有較大影響。當引物濃度為0.2 ng/μL時，選擇擴增產(chǎn)物量較少；隨著引物濃度的增大，選擇擴增產(chǎn)物逐漸增多并趨于穩(wěn)定?？紤]到節(jié)省樣品以及對后續(xù)銀染的影響，選擇預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍、1U Taq聚合酶用量、

2.2.4 柱花草AFLP反應(yīng)體系選擇擴增引物篩選

利用上述方法優(yōu)化出的柱花草AFLP反應(yīng)體系，對8對引物組合進行篩選，篩選出46對引物（表2）。其中15對引物的AFLP選擇擴增聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果（圖13）表明，擴增產(chǎn)物電泳譜帶清晰、分辨率高、重復(fù)性好、多態(tài)性強且2種柱花草之間有一定的差異性。因此，這些引物可用來開展柱花草的分子生物學(xué)研究。

3 討論與結(jié)論

3.1 柱花草基因組DNA的提取

柱花草富含多酚、多糖物質(zhì)。不同的發(fā)育時期其多酚、多糖的含量不同，且不同品種之間多酚、多糖含量也有所差異。唐燕瓊等[10]采用優(yōu)化后的CTAB柱花草DNA提取方法，得到的DNA純度較高，一致性好，含有雜質(zhì)較少。而本研究只需提取基因組DNA，不要求觀察植株后期生長發(fā)育狀況，故采用柱花草種子萌發(fā)的2片子葉提取DNA即可，縮短了材料的培育時間。采用改良的CTAB法提取柱花草子葉DNA，得到純度高質(zhì)量好的基因組DNA，可以滿足AFLP分子標記對DNA高質(zhì)量的要求。

3.2 AFLP反應(yīng)體系建立

酶切反應(yīng)是AFLP反應(yīng)的第一步反應(yīng)，也是反應(yīng)的關(guān)鍵步驟之一，酶切充分與否直接影響體系的最終反應(yīng)結(jié)果。蔣昌順[15]所用的EcoR I酶和Mse I酶購自NewEnglandBioLabs，Inc.，反應(yīng)體系為25 μL，采用了雙酶切，以37℃酶切2 h，70℃ 15 min終止反應(yīng)。本研究酶切反應(yīng)選用的是Thermo公司提供的EcoR I酶和Mse I酶，根據(jù)說明書，EcoR I酶與Mse I酶的最適反應(yīng)溫度與緩沖液均不一致，所以選取分步酶切，獲得的酶切條帶分布均勻，可以滿足后續(xù)實驗分析的要求。

建立的柱花草AFLP反應(yīng)的最佳體系及條件為：1 000 ng柱花草DNA模板量加0.5 μL EcoR I（10 U/μL），以37℃酶切2 h，再加0.5 μL Mse I（10 U/μL）以65℃酶切2 h；酶切液5 μL、T4連接酶（5 U/μL）1 μL、EcoR I接頭1 μL、Mse I接頭1 μL、緩沖液（T4 DNA連接酶自帶）2 μL，用無菌雙蒸水補足20 μL，在22℃下連接10 min；取稀釋15倍的連接產(chǎn)物5 μL、Mg2+（25 mmol/L）0.6 μL、Taq酶（5 U/μL）0.2 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL、EA00（50 ng/μL）0.8 μL、MC00（50 ng/μL）0.8 μL，以無菌雙蒸水補足20 μL后進行預(yù)擴增；取稀釋20倍的預(yù)擴增產(chǎn)物5 μL、Mg2+（25 mmol/L）1 μL、Taq酶（5 U/μL）0.25 μL、dNTPs 0.45 μL、選擇擴增引物（10 ng/μL）0.8 μL，用無菌雙蒸水補足20 μL后進行選擇擴增。endprint

3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

不同的引物組合選擇擴增后，對選擇擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。黃桂華等[17]在對木麻黃AFLP反應(yīng)選擇擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，提到每次電泳前最好重新變性。本研究中，在選擇擴增完成后立即變性一次，之后不再變性也能得到效果良好的電泳圖。

聚丙烯酰胺凝膠常規(guī)的銀染方法操作復(fù)雜、顯色時間長，而且PAGE膠的背景模糊，不易分清條帶[18]。本研究參考郭大龍等[19]的染色方法并稍作改進，電泳結(jié)束后直接把帶膠的長玻璃板放到白瓷盤中（白瓷盤中盛有1 L 0.1% AgNO3溶液和10 mL無水乙醇），輕輕搖動白瓷盤，染色10 min；取出長玻璃板，用蒸餾水沖洗不超過5 s，置于1 L顯影液（顯影液配方：1 L蒸餾水中加入NaOH 20 g、NaHCO3 0.58 g、Na2CO3 0.4 g完全溶解后加入5 ml甲醛）中，直至條帶完全顯色，取出玻璃板沖洗1 min。此方法省去了有刺激氣味的試劑乙酸和硫代硫酸鈉的使用，節(jié)省試劑用量，降低了成本；與常規(guī)染色方法相比，縮短了染色及顯色時間，且得到的染色凝膠背景清晰，條帶與背景區(qū)分明顯，達到了準確篩選條帶的目的。

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3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

不同的引物組合選擇擴增后，對選擇擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。黃桂華等[17]在對木麻黃AFLP反應(yīng)選擇擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，提到每次電泳前最好重新變性。本研究中，在選擇擴增完成后立即變性一次，之后不再變性也能得到效果良好的電泳圖。

聚丙烯酰胺凝膠常規(guī)的銀染方法操作復(fù)雜、顯色時間長，而且PAGE膠的背景模糊，不易分清條帶[18]。本研究參考郭大龍等[19]的染色方法并稍作改進，電泳結(jié)束后直接把帶膠的長玻璃板放到白瓷盤中（白瓷盤中盛有1 L 0.1% AgNO3溶液和10 mL無水乙醇），輕輕搖動白瓷盤，染色10 min；取出長玻璃板，用蒸餾水沖洗不超過5 s，置于1 L顯影液（顯影液配方：1 L蒸餾水中加入NaOH 20 g、NaHCO3 0.58 g、Na2CO3 0.4 g完全溶解后加入5 ml甲醛）中，直至條帶完全顯色，取出玻璃板沖洗1 min。此方法省去了有刺激氣味的試劑乙酸和硫代硫酸鈉的使用，節(jié)省試劑用量，降低了成本；與常規(guī)染色方法相比，縮短了染色及顯色時間，且得到的染色凝膠背景清晰，條帶與背景區(qū)分明顯，達到了準確篩選條帶的目的。

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3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

不同的引物組合選擇擴增后，對選擇擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。黃桂華等[17]在對木麻黃AFLP反應(yīng)選擇擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，提到每次電泳前最好重新變性。本研究中，在選擇擴增完成后立即變性一次，之后不再變性也能得到效果良好的電泳圖。

聚丙烯酰胺凝膠常規(guī)的銀染方法操作復(fù)雜、顯色時間長，而且PAGE膠的背景模糊，不易分清條帶[18]。本研究參考郭大龍等[19]的染色方法并稍作改進，電泳結(jié)束后直接把帶膠的長玻璃板放到白瓷盤中（白瓷盤中盛有1 L 0.1% AgNO3溶液和10 mL無水乙醇），輕輕搖動白瓷盤，染色10 min；取出長玻璃板，用蒸餾水沖洗不超過5 s，置于1 L顯影液（顯影液配方：1 L蒸餾水中加入NaOH 20 g、NaHCO3 0.58 g、Na2CO3 0.4 g完全溶解后加入5 ml甲醛）中，直至條帶完全顯色，取出玻璃板沖洗1 min。此方法省去了有刺激氣味的試劑乙酸和硫代硫酸鈉的使用，節(jié)省試劑用量，降低了成本；與常規(guī)染色方法相比，縮短了染色及顯色時間，且得到的染色凝膠背景清晰，條帶與背景區(qū)分明顯，達到了準確篩選條帶的目的。

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