‘熱研2 號’柱花草對不同親緣植物根系分泌物的生長響應(yīng)

王俐媛，王 堅(jiān)，趙元辰，許 超，李雪楓

（1. 熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 海南大學(xué)林學(xué)院，海南 ?？?70228；2. 海南大學(xué)動物科技學(xué)院，海南 海口 570228）

在生態(tài)系統(tǒng)中，植物以種群或群落狀態(tài)共存，意味著周圍存在著同種或異種植物個體，導(dǎo)致相鄰植物間因共同利用光、溫度、水分和養(yǎng)分等而產(chǎn)生資源競爭。植物與異株植物之間的競爭強(qiáng)度和競爭方式會因鄰株植物具體身份的不同而不同。根據(jù)植物與鄰近植物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近來調(diào)整自身生長發(fā)育，從而調(diào)整競爭策略的能力被稱為植物的親緣識別或植物的身份識別[1-2]。通過對鄰近植株的身份識別，植物可以辨別自我/非自我以及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，從而產(chǎn)生相應(yīng)的響應(yīng)策略，獲得最佳適合度[3]。然而，不同植物的響應(yīng)策略存在著明顯的物種差異，如豌豆(Pisum sativum)朝向非我鄰株一側(cè)生長的側(cè)根長度顯著大于朝向自我鄰株一側(cè)的側(cè)根長度[4]；裂葉牽牛(Ipomoea hederacea)與產(chǎn)自同母株的實(shí)生苗伴生時的根系生物量顯著小于異母株實(shí)生苗伴生的根系生物量[5]；美洲海灘芥(Cakile edentula)與同母株實(shí)生苗伴生時的根生物量比異母株實(shí)生苗伴生的根生物量少[6]。研究表明，根系分泌物是植物通過根系進(jìn)行親緣識別的關(guān)鍵影響因素[2-3,7]。通過根系分泌物的介導(dǎo)，植物能夠探測鄰近植物的身份，進(jìn)而調(diào)整生物量分配、根系行為和根系構(gòu)型等，以最佳生長反應(yīng)來緩和與近親緣個體之間的競爭[1-2,7]。近年來，牧草的親緣識別與響應(yīng)方面的研究已證明一年生黑麥草(Lolium multiflorum)能夠識別親緣鄰居身份，通過減少根系分配量來減弱與親緣鄰居之間的地下競爭，提高群組適合度[8]；白三葉(Trifolium repens)在較高密度時也表現(xiàn)出顯著的親緣識別響應(yīng)，鄰株為近親時的生物量分配和比葉面積與鄰株為非親屬種時相比差異顯著[9]。

柱花草(Stylosanthes guianensis)是刈牧兼用型優(yōu)質(zhì)豆科牧草，具有抗旱、耐高溫、保持水土、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。中國自20 世紀(jì)80 年代初大量引進(jìn)柱花草種質(zhì)資源，現(xiàn)已培育出多個優(yōu)良品種[12]，被廣泛用于我國熱帶、亞熱帶地區(qū)栽培草地建植、天然草地改良、果園與經(jīng)濟(jì)林下綠肥[13-15]。目前，人們對于柱花草的研究主要體現(xiàn)在其產(chǎn)量與品質(zhì)[14]、高效固氮根瘤菌的篩選[16]、與常見雜草的競爭[17]以及遺傳進(jìn)化關(guān)系分析[18-19]等方面。在柱花草生產(chǎn)利用中主要著眼于某品種與另一種植物間混作[13,15]，忽視了因親屬識別而產(chǎn)生的生物量分配策略及其他生長響應(yīng)結(jié)果，忽視了柱花草種/品種組合效應(yīng)的應(yīng)用。親屬識別支配的生物量分配策略所減少的無意義競爭與人們對牧草生物量的需求緊密相關(guān)，明晰柱花草的親屬識別效應(yīng)對通過構(gòu)建適宜的種/品種組合來發(fā)展草地混播栽培新技術(shù)具有重要意義。因此，本研究以適應(yīng)性強(qiáng)、在我國南方地區(qū)大面積推廣種植的‘熱研2 號’柱花草為研究對象，采取根系分泌物營養(yǎng)液處理的方法，研究‘熱研2 號’柱花草幼苗對不同親緣植物根系分泌物的生長響應(yīng)，以期為探索柱花草的根系識別與響應(yīng)機(jī)制，構(gòu)建高產(chǎn)、可持續(xù)的柱花草混播栽培新模式提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究對象‘熱研2 號’柱花草是從柱花草屬中起源最早、分支最多、分布最廣的圭亞那柱花草中選育出的一個品種[20]。根據(jù)種/品種選育來源，以來自同一親本的‘熱研2 號’柱花草作為自我品種，以同屬于圭亞那柱花草的‘熱研5 號’柱花草、‘熱研21 號’柱花草和‘熱研24 號’柱花草為種內(nèi)近緣親屬品種(簡稱近親)，以柱花草屬內(nèi)屬于其他種的‘大葉’柱花草(S. grandifolia)、‘細(xì)莖’柱花草(S.gracilis)、‘有鉤’柱花草(S. hamata)和‘西卡’柱花草(S. scabra)為種間遠(yuǎn)緣親屬種(簡稱遠(yuǎn)親)。8 種柱花草的種子均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供，其中‘熱研5 號’、‘熱研21 號’、‘熱研24 號’、‘有鉤’和‘西卡’柱花草均為經(jīng)國家草品種審定委員會審定通過、在南方地區(qū)已經(jīng)具有良好適應(yīng)性的柱花草品種，而‘大葉’和‘細(xì)莖’柱花草為近年經(jīng)引種選育表現(xiàn)良好、正在試行推廣的新草種。所選物種的編號及親緣關(guān)系如表1 所列。

表1 試驗(yàn)材料編號與親緣關(guān)系Table 1 Number and kin relationship of plant species and varieties used in the study

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考魏嘉禾和陳斌[21]、黃冬芬等[22]的試驗(yàn)方法，用含有親緣植物根系分泌物的營養(yǎng)液處理替代鄰近種植植物進(jìn)行水培試驗(yàn)。將‘熱研2 號’柱花草-自我、‘熱研2 號’柱花草-近親、‘熱研2 號’柱花草-遠(yuǎn)親分別配對，共組成8 個處理對，每個處理對設(shè)6個重復(fù)。先將不同種柱花草幼苗種植在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中收集柱花草種/品種的根系分泌物[22]，然后將‘熱研2 號’柱花草幼苗置于相對應(yīng)的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，生長7 d 后測定其生長指標(biāo)。營養(yǎng)液的主要成分 為Ca(NO3)2·4H2O 472.50 mg·L-1， KNO3253.00 mg·L-1，NH4NO340.00 mg·L-1，KH2PO468.00 mg·L-1，MgSO4246.50 mg·L-1， FeSO4·7H2O 27.80 mg·L-1，EDTA-Na237.30 mg·L-1， H3BO332.86 mg·L-1，MnSO4·4H2O 2.13 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.08 mg·L-1， (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02 mg·L-1。

1.2.2 試驗(yàn)方法與指標(biāo)測定

種子預(yù)處理：分別選取大小一致、顆粒飽滿的8 種柱花草種子，每種柱花草種子先用75%的酒精表面消毒10 min，洗凈酒精后再用無菌水漂洗3～4 次，然后80 ℃水浴5～6 min 去除硬實(shí)[14]，攤開自然冷卻、晾干。

種子預(yù)萌發(fā)：將預(yù)處理后的各柱花草種子分別均勻放置在鋪有雙層濾紙、直徑90 mm 的培養(yǎng)皿中，每皿50 粒，用無菌水浸潤濾紙后，放入人工氣候箱，在光照/黑暗10 h/14 h、25 ℃、相對濕度75%的條件下萌發(fā)，待胚根突破種皮0.5 cm 即可用于水培試驗(yàn)。

根系分泌物收集：選取已萌發(fā)的每種柱花草種子，移植至盛有1/2 Hoagland 營養(yǎng)液(pH 為5.8)、液面覆雙層脫脂紗布的15 mL 玻璃管中，每管1 株柱花草，玻璃管放入上蓋帶孔的培養(yǎng)箱各孔洞中，使浸入營養(yǎng)液的根系避光生長。培養(yǎng)箱置于與種子萌發(fā)條件一致的人工氣候箱內(nèi)，每天定時向玻璃管內(nèi)補(bǔ)充營養(yǎng)液，使水培溶液保持在恒定水平。待各柱花草植株生長10 d (處于三葉一心期)，各玻璃管內(nèi)的營養(yǎng)液中均濃集了柱花草的根系分泌物后，將原生長植株取出，試管中含根系分泌物的營養(yǎng)液即可用于根系分泌物影響試驗(yàn)。

根系分泌物影響試驗(yàn)：選取同期萌發(fā)、長勢一致的‘熱研2 號’柱花草。以根系置入另一收集有‘熱研2 號’柱花草根系分泌物的營養(yǎng)液中培養(yǎng)為自我處理，即對照組；以根系置入收集有近親柱花草(‘熱研5 號’、‘熱研21 號’、‘熱研24 號’)根系分泌物的營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)為近親處理組；以根系置入收集有遠(yuǎn)親柱花草(‘大葉’、‘細(xì)莖’、‘有鉤’、‘西卡’)根系分泌物的營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)為遠(yuǎn)親處理組。為消除位置間的光照不均對生長的影響，每天隨機(jī)調(diào)整試管位置。在根系分泌物營養(yǎng)液中生長7 d 后，測量每株‘熱研2 號’柱花草幼苗的根長和株高，計(jì)數(shù)其側(cè)根數(shù)，然后用吸水紙吸干各柱花草植株表面的水分，分離莖葉和根，用感量0.1 mg 天平測定其莖葉生物量與根生物量(鮮重)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0 對各生長指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan 法在P＜ 0.05 水平進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，其中根長、側(cè)根數(shù)量、根生物量、莖葉生物量、總生物量和根冠比指標(biāo)方差齊性檢驗(yàn)合適，株高因方差齊性檢驗(yàn)不合適采用log 函數(shù)轉(zhuǎn)化后再檢驗(yàn)。用灰色關(guān)聯(lián)法評判‘熱研2 號’柱花草對7 種親緣柱花草根系分泌物的生長響應(yīng)程度[23]。采用GraphPad Prism 8.0 制圖，所有數(shù)據(jù)用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同親緣植物根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草株高的影響

遠(yuǎn)親處理組的平均株高為43.78 mm，比自我處理組降低了10.52%，且處理間差異顯著(P＜ 0.05)，近親處理組的平均株高與自我處理組之間無顯著差異(P＞ 0.05) (圖1)?！疅嵫? 號’柱花草在‘熱研24 號’、‘有鉤’和‘細(xì)莖’柱花草的根系分泌物營養(yǎng)液中生長時，其株高分別為41.27、39.20 和40.55 mm，比自我處理分別顯著降低了15.67%、19.89%和17.13% (P＜ 0.05)；‘熱研5 號’、‘熱研21 號’、‘大葉’和‘西卡’柱花草根系分泌物營養(yǎng)液中生長時，其株高均與自我處理無顯著差異(P＞ 0.05)。

圖1 不同親緣植物根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草株高的影響Figure 1 Effects of root exudates from different relatives on plant height of Stylosanthes guianensis ‘Reyan No. 2’

2.2 不同親緣植物根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草根系生長的影響

2.2.1 不同親緣植物根系分泌物對根長的影響

遠(yuǎn)親處理組的平均根長為46.64 mm，分別比近親處理組和自我處理組的平均根長顯著增加了14.14%和21.35% (P＜ 0.05)，近親處理組和自我處理組的平均根長之間無顯著差異(P＞ 0.05) (圖2)。在‘熱研5 號’、‘熱研21 號’和‘熱研24 號’柱花草的根系分泌物營養(yǎng)液中生長時，與‘熱研2 號’柱花草的根長之間無顯著差異(P＞ 0.05)；在‘西卡’柱花草的根系分泌物營養(yǎng)液中生長時，‘熱研2 號’柱花草的根長為48.73 mm，分別比自我和‘大葉’柱花草根系分泌物處理下顯著增加了26.80%和10.76% (P＜0.05)，但與‘細(xì)莖’、‘有鉤’柱花草根系分泌物處理間無顯著差異。

圖2 不同親緣植物根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草根長的影響Figure 2 Effects of root exudates from different relatives on root length of Stylosanthes guianensis ‘Reyan No. 2’

2.2.2 不同親緣植物根系分泌物對側(cè)根數(shù)量的影響

近親處理組的平均側(cè)根數(shù)量為3.61，遠(yuǎn)親處理組的平均側(cè)根數(shù)量為4.89，分別比自我處理組顯著增加了2.50 和3.75 倍(P＜ 0.05)，近親處理組與遠(yuǎn)親處理組的平均側(cè)根數(shù)量之間無顯著差異(P＞ 0.05)(圖3)。除‘熱研21 號’和‘大葉’柱花草根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草的側(cè)根數(shù)量無顯著影響(P＞0.05)外，其他親緣柱花草的根系分泌物處理均使其側(cè)根數(shù)量顯著增加(P＜ 0.05)，其中‘西卡’、‘有鉤’、‘熱研24 號’柱花草根系分泌物營養(yǎng)液處理的側(cè)根數(shù)量分別比自我處理增加了6.00、4.33 和3.17 倍。

圖3 不同親緣植物根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草側(cè)根數(shù)量的影響Figure 3 Effects of root exudates from different relatives on lateral root numbers of Stylosanthes guianensis ‘Reyan No. 2’

2.3 不同親緣植物根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草生物量積累和分配的影響

2.3.1 不同親緣植物根系分泌物對生物量的影響

近親處理組的平均總生物量(32.95 mg)、平均莖葉生物量(29.73 mg)和平均根生物量(3.22 mg)分別比自我處理組顯著增加了15.38%、13.13%和41.85%(P＜ 0.05)，遠(yuǎn)親處理組的平均總生物量(31.69 mg)和平均根生物量(3.14 mg)比自我處理組分別顯著增加了11.00%和38.33% (P＜ 0.05)；遠(yuǎn)親處理組和近親處理組的各平均生物量之間均無顯著差異(P＞0.05) (圖4)。

圖4 不同親緣植物根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草生物量的影響Figure 4 Effects of root exudates from different relatives on the biomass of Stylosanthes guianensis ‘Reyan No. 2’

‘熱研5 號’和‘大葉’柱花草根系分泌物處理下，‘熱研2 號’柱花草的莖葉生物量比自我處理顯著增加了24.73%和18.42% (P＜ 0.05)，但‘熱研21 號’、‘熱研24 號’、‘細(xì)莖’、‘西卡’和‘有鉤’柱花草的根系分泌物對其莖葉生物量無顯著影響(P＞ 0.05)。除‘熱研5 號’柱花草之外，其他親緣柱花草根系分泌物處理下，‘熱研2 號’柱花草的根生物量均比自我處理顯著增加(P＜ 0.05)，其中在‘熱研24 號’柱花草根系分泌物處理下達(dá)4.15 mg，增長了82.82%，‘細(xì)莖’柱花草根系分泌物處理次之(49.78%)。

2.3.2 不同親緣植物根系分泌物對根冠比的影響

遠(yuǎn)親處理組的平均根冠比(0.11 : 1)比自我處理組顯著增加了29.14% (P＜ 0.05)，近親處理組的平均根冠比與自我處理組間無顯著差異(P＞ 0.05) (圖5)。除‘熱研5 號’和‘大葉’柱花草根系分泌物處理對‘熱研2 號’柱花草的根冠比無顯著影響(P＞ 0.05)外，其他親緣植物的根系分泌物處理均使‘熱研2 號’柱花草的根冠比顯著增大(P＜ 0.05)，其中‘熱研24 號’柱花草根系分泌物處理的增長率最大，達(dá)74.42%，‘細(xì)莖’柱花草根系分泌物處理次之(47.67%)。

圖5 不同親緣植物根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草根冠比的影響Figure 5 Effects of root exudates from different relatives on root-shoot ratio of Stylosanthes guianensis ‘Reyan No. 2’

2.4 綜合分析

為準(zhǔn)確評判‘熱研2 號’柱花草對不同種/品種柱花草的親緣識別能力大小，采用灰色關(guān)聯(lián)法對‘熱研2 號’柱花草在不同親緣植物根系分泌物處理下的生長響應(yīng)進(jìn)行了綜合量化分析。首先將7 個指標(biāo)(株高、根長、側(cè)根數(shù)量、總生物量、根生物量、莖葉生物量和根冠比)進(jìn)行無量綱化處理，然后以‘熱研2 號’自我處理的對應(yīng)指標(biāo)作為“參考值”(母序列)，分辨系數(shù)取0.5，計(jì)算7 個親緣柱花草與‘熱研2 號’柱花草的關(guān)聯(lián)關(guān)系(關(guān)聯(lián)度)。通過灰色關(guān)聯(lián)度得出，‘熱研21 號’柱花草的關(guān)聯(lián)度最高(0.689)，其次是‘熱研5 號’柱 花 草(0.688)，‘有 鉤’柱 花 草 的 關(guān) 聯(lián) 度 最 低(0.524)，‘熱研24 號’柱花草的關(guān)聯(lián)度居于倒數(shù)第2 位(0.567) (表2)。

表2 各指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)及關(guān)聯(lián)度Table 2 Grey correlation coefficients and correlation degrees from each index

3 討論與結(jié)論

動物主要依靠個體間血緣關(guān)系的遠(yuǎn)近來界定親緣關(guān)系，但植物由于無性繁殖和自體受精導(dǎo)致種群的相似度較高，親緣關(guān)系的界定比動物更為復(fù)雜。經(jīng)過人為馴化培育而成的植物品種高度純化，品種內(nèi)的個體間沒有親屬和非親屬差異，其親屬識別只能發(fā)生在近緣品種之間[3]。本研究結(jié)果與目前對植物親緣識別生長響應(yīng)的研究結(jié)論基本一致，即植物與近親植物共存時植株間的生長影響相對較小，與遠(yuǎn)親植物共存時植株間的生長影響相對激烈[24]，但同一處理組內(nèi)各柱花草品種/種根系分泌物對‘熱研2 號’柱花草幼苗生長的影響情況并不完全一致。由生長影響情況得到的4 種遠(yuǎn)緣親屬與‘熱研2 號’柱花草的親緣距離為‘有鉤’ ＞ ‘細(xì)莖’ ＞ ‘西卡’ ＞ ‘大葉’，這一結(jié)論與蘇慶祥[25]的‘大葉’、‘細(xì)莖’和圭亞那柱花草為遺傳關(guān)系較近的同一類型，‘有鉤’和‘西卡’柱花草分別屬于其他類型的結(jié)論不吻合，原因可能是現(xiàn)有的柱花草遺傳關(guān)系和親緣關(guān)系的研究結(jié)果存在爭議，需要對各種質(zhì)的遺傳關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步分析；在試驗(yàn)過程中，對1/2 Hoagland 營養(yǎng)液只進(jìn)行了量的補(bǔ)充，沒有精細(xì)考慮每種柱花草對其養(yǎng)分吸收的差異，影響了試驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)還將對其進(jìn)行驗(yàn)證。3 種近緣親屬中‘熱研24 號’與‘熱研2 號’柱花草的關(guān)聯(lián)程度較差，原因可能在于‘熱研24 號’柱花草是‘熱研2 號’柱花草經(jīng)太空誘變育成的品種[26]，其基因型已經(jīng)發(fā)生了顯著變化?！疅嵫? 號’、‘熱研21 號’與‘熱研2 號’柱花草關(guān)聯(lián)緊密，特別是‘熱研5 號’柱花草根系分泌物處理使其莖葉生物量顯著增加。由此可推測出，在生產(chǎn)中將親緣關(guān)系相近的‘熱研5 號’、‘熱研21 號’與‘熱研2 號’柱花草混播可以減少競爭消耗，從而提高牧草產(chǎn)量。

現(xiàn)有植物親屬識別研究主要表現(xiàn)為調(diào)整生長、繁殖和防御策略[3]。本試驗(yàn)僅對生長調(diào)整情況進(jìn)行了研究，具體生長指標(biāo)的變化規(guī)律與其他植物的相關(guān)研究結(jié)果并不完全一致。如：近親處理對‘熱研2 號’柱花草的株高無顯著影響，遠(yuǎn)親處理使其株高顯著降低。裂葉牽牛(Pharbitis nil)的株高在近親伴生時也無顯著變化，在遠(yuǎn)親伴生時卻顯著增加[5]；硬粒小麥(Triticum turgidum)的株高與伴生鄰居的親緣遠(yuǎn)近無依賴關(guān)系[27]。遠(yuǎn)親處理使‘熱研2 號’柱花草的根長和側(cè)根數(shù)量均顯著增加，近親處理對其根長無影響。這種變化與美洲海灘芥(Cakile edentula)[6]、大豆(Glycine max)[28]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[29]等的親緣響應(yīng)情況基本一致，與鹽草(Distichlis spicata)[30]的親緣響應(yīng)規(guī)律相反。遠(yuǎn)親處理顯著增加‘熱研2 號’柱花草的根生物量和根冠比，近親處理下的根冠比無顯著變化，莖葉生物量和根生物量均顯著增大。伴生植物親緣遠(yuǎn)近對鹽草的生物量和根冠比均無影響[30]，但遠(yuǎn)親伴生使水稻(Oryza sativa)的根生物量增加而不影響其莖生物量[31]。說明植物的親緣識別與響應(yīng)機(jī)制非常復(fù)雜，根系分泌物誘導(dǎo)的身份識別反應(yīng)雖然避免了鄰居存在產(chǎn)生其他信號的干擾[22,30]，但摒除了根系分泌物在土壤中的變化對響應(yīng)情況的影響，也缺少對植物生理響應(yīng)情況和整個生命周期相關(guān)指標(biāo)的研究與分析。因此，在柱花草的親緣識別研究方面還需要對其土培條件下的響應(yīng)情況進(jìn)行進(jìn)一步的研究，但由此卻可以推測親緣識別是柱花草與其鄰近植物競爭和相互作用的重要機(jī)制。

綜上，‘熱研2 號’柱花草在近親處理組中的株高、根長和根冠比與自我處理間無顯著差異，總生物量和莖葉生物量顯著增加，而遠(yuǎn)親處理組的株高顯著降低，根長、側(cè)根數(shù)量、根生物量和根冠比均顯著增加。這些指標(biāo)的變化表明，‘熱研2 號’柱花草能通過根系分泌物識別出親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，從而與近親間的競爭相對較弱，與遠(yuǎn)親間的競爭較為激烈。因此，利用親緣識別效應(yīng)選擇柱花草品種組合混播是提高牧草產(chǎn)量的可能途徑。