哈蟆油基原物種DNA分子鑒定研究

高曉晨，劉 冬，白俊武，于江波，趙娜娜，宗 穎，崔麗娜，張 輝*，孫佳明*

(1.長春中醫(yī)藥大學，長春 130117;2.吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700)

哈蟆油(Ranaeoviductus)為我國常用中藥材，具有補腎益精，養(yǎng)陰潤肺的作用。據(jù)《中國藥典》2010年版1部記載其來源為蛙科動物中國林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得[1]。中國林蛙是中國東北長白山特有的珍稀野生動物。分布于遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、河北、山東、山西、陜西、河南、青海、四川等地[2]。黑龍江林蛙，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧等省[2]。目前，哈蟆油基原物種的鑒定方法主要為依據(jù)理化性狀、顯微特征等傳統(tǒng)鑒別方法[3]。但這些方法主要以形態(tài)學為基礎，不僅受到遺傳因素的影響，而且與中國林蛙的生長環(huán)境、生長發(fā)育階段有密切的關系。在鑒別過程中穩(wěn)定性較差，影響鑒定結果[4]?？梢姡瑐鹘y(tǒng)的形態(tài)學及理化性質鑒定難度大，現(xiàn)需要一種準確有效的方法來鑒定。 DNA條形碼(DNA Barcoding)是利用基因組中一段公認標準短序列來進行物種鑒定的分子診斷新技術[5]，由加拿大動物學家Hebert等[6]首次提出。近年來該技術在物種鑒定方面有廣泛的應用和迅速的發(fā)展，并且DNA條形碼技術簡便高效,不受樣品的形態(tài)性狀以及研究者的專業(yè)水平限制，可有效的鑒定中藥材[7]。本研究對哈蟆油基原物種進行COI序列研究，分析其藥材的物種變異,建立哈蟆油基原物種DNA分子鑒定方法,為其鑒定提供有效的手段。

1 材料與方法

1.1 材料 共收集樣本12份，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學張輝教授鑒定為中國林蛙和黑龍江林蛙。其中中國林蛙7份，采自吉林汪清(標本號SJM-RTC-1102)、黑龍江牡丹江(標本號SJM-RTC-1103)、遼寧新賓(標本號SJM-RTC-1105)、內(nèi)蒙古通遼(標本號SJM-RTC-1106)、山東青島膠南區(qū)(標本號SJM-RTC-1107)、山東青島嶗山區(qū)(標本號SJM-RTC-1108)。黑龍江林蛙5份，采自吉林集安(標本號SJM-RA-1101)、黑龍江五常(標本號SJM-RA-1104)、遼寧新賓(標本號SJM-RA-1105)、內(nèi)蒙古通遼(標本號SJM-RA-1106)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用滅菌后的手術剪把樣品(哈蟆油或肌肉組織)剪成小塊,取30 mg樣品，用液氮研碎后，使用動物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及電泳 擴增引物為COI序列通用引物:正向為LCO1490 5’-GGTCAACAAATCATAAAGA-

TATTGG-3’，反向為HCO2198 5’-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’[8]。PCR反應體積為20 μL，體系內(nèi)含Taq Master Mix 10 μL，引物對各1.0 μL(2.5 mol/L)、雙蒸水7 μL、DNA提取液1 μL(約30 ng)[9]。擴增程序為94 ℃，1 min；94 ℃，1 min，45 ℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5 cycles；94 ℃，1 min，50 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，35 cycles；72 ℃，5 min[10]。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，上4 μL的PCR產(chǎn)物，條件為135 V電壓20 min。DL2000 Marker從上至下為2 000、1 000、750、500、250和100 bp(Takara公司)。結果，實驗樣品在500～750 bp間出現(xiàn)亮帶，條帶清晰，DNA擴增成功，進行測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 PCR擴增產(chǎn)物使用ABI 3730XL測序儀(華大基因公司)雙向測序。測序后得到正反兩向峰圖,利用Codon Code Aligner V4.2.7(Codon Code Co.)校對拼接,去除引物區(qū)，獲得長度為658 bp的樣品序列。對于從Genbank獲得的COI序列，采用Codon Code Aligner V4.2.7軟件，與拼接好的樣品序列比對后，去除與樣品序列相對應的658 bp以外的區(qū)段，最后保留長度≥550 bp的網(wǎng)上序列。將所有序列用MEGA(Molecular evolutionary genetics analysis)6.0軟件比對并進行遺傳距離等分析。

2 結果與分析

2.1 哈蟆油基原物種DNA提取與PCR擴增 用COI序列對哈蟆油基原物種樣品進行分析,實驗樣本均可以進行PCR擴增并成功測序，瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴增電泳圖，擴增效果良好，條帶較亮，無拖尾現(xiàn)象。

2.2 哈蟆油基原物種的種內(nèi)變異

2.2.1 中國林蛙 中國林蛙12條序列比對后序列長度為662 bp,GC含量為47.7%～49.9%，平均GC含量49.0%。種內(nèi)平均K2P距離為0.042，種內(nèi)最大K2P距離為0.058。有34個堿基變異位點，其中346位點既有A-G變異又有A-T、T-G變異，見表1。

表1 中國林蛙種內(nèi)堿基變異情況表

2.2.2 黑龍江林蛙 黑龍江林蛙8條序列比對后序列長度為658 bp，GC含量為45.2%～46.1%，平均GC含量45.8%。

有2個堿基變異位點分別為169位點的C-A變異和499位點的C-T變異。種內(nèi)平均K2P距離為0.003，種內(nèi)最大K2P距離為0.005。

2.3 物種鑒定結果 PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后得到正反向峰圖,采用CodonCode Aligner V2.06校對拼接獲得長度為658 bp的樣品序列，原始圖譜為清晰的單峰圖譜，干擾信息低于正常信號的10%。樣品序列經(jīng)BLAST比對，為基原物種。

3 討論

目前，DNA條形碼已成為物種鑒定和分類研究的熱點[7,11]。COI序列通用性高[12]，操作不當，可能會將異源污染的COI序列擴增出來，因此在DNA提取樣時要進行表面清潔，以避免異源污染對樣品鑒定的影響。在DNA提取過程中發(fā)現(xiàn),若完全按照試劑盒操作說明進行操作，得到的DNA含量低。筆者結合本實驗情況對操作流程進行如下改良:1)適當延長水浴時間，有利于樣品細胞消化，重復實驗表明56 ℃水浴2 h效果最好。2)動物肌肉組織蛋白質含量較多,影響樣品DNA的提取效果，故加入氯仿-異戊醇(24∶1)抽提2次，每次10 min，除去溶液中的蛋白質。

本實驗運用改良后的試劑盒，對哈蟆油基原物種進行DNA提取,COI序列引物及PCR擴增，獲得哈蟆油基原物種序列。由結果可知:所建立的哈蟆油基原物種DNA分子鑒定方法可靠、穩(wěn)定，為其鑒定提供有效的手段。

[1]國家藥典委員會.中國藥典：1部[M].北京:化學工業(yè)出版社,2010:147.

[2]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海:上?？茖W技術出版社,1999:421.

[3]劉娟,劉爽,劉程誠.哈蟆油的真?zhèn)舞b別[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2009,32(2):20-21.

[4]陳麗娟.哈蟆油PCR鑒別方法的建立[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學,2012.

[5]陳士林,宋經(jīng)元,姚輝,等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關鍵技術分析[J].中國天然藥物,2009,7(5):322-327.

[6]Hebert P D N,Cywinska A,Ball S L,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc R Soc Lond B Biol Sci,2003,270:313-321.

[7]陳士林,姚 輝,宋經(jīng)元,等.基于DNA barcoding(條形碼)技術的中藥材鑒定[J].世界科學技術——中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2007,9(3):7-12.

[8]Folmer O,Black M,Hoeh W,et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Mol Mar Biol Biotechnol,1994(3):294-299.

[9]羅盤,陳士林,陳科力,等.基于蕓香科的植物通用DNA條形碼研究[J].中國科學(生命科學),2010,40(4):342-351.

[10]Hebert P D N,Cywinska A,Ball S L,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc R Soc Lond B Biol Sci,2003(270):313-321.

[11]陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[J].中國中藥雜志,2013,38(2):141-148.

[12]陳士林,龐曉慧,姚輝,等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向[J].世界科學技術——中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,13(5):747-754.