針刀、電針和圓利針對(duì)實(shí)驗(yàn)性膝骨關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨病理和超微結(jié)構(gòu)的影響

黃怡然,李文迅,張 茜,李 娜,余 飛,金英利,雷林丹,李玉波,郭長青

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京100029)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是臨床常見致殘率較高的關(guān)節(jié)疾病，其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)周圍軟組織損傷，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)生，最終累及整個(gè)關(guān)節(jié)，形成關(guān)節(jié)軟骨退變、纖維化、斷裂、潰瘍及整個(gè)關(guān)節(jié)面的損害。膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)以膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和肌肉運(yùn)動(dòng)功能障礙為主要臨床表現(xiàn)。研究結(jié)果認(rèn)為,KOA是由于一系列作用而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)異常性塑形重建產(chǎn)生的[1]，軟骨體內(nèi)平衡的維持與骨相似,當(dāng)發(fā)生KOA時(shí)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的喪失包括關(guān)節(jié)軟骨減壓區(qū)域的軟骨鈣化和增壓區(qū)的軟骨細(xì)胞壞死[2]。相關(guān)研究還認(rèn)為，關(guān)節(jié)軟骨的纖維化和剝脫大于其塑形重建，僅在關(guān)節(jié)面不同部位的基底鈣化軟骨上才有纖維化和塑形重建同時(shí)存在。塑形重建主要發(fā)生在非負(fù)重區(qū)，而纖維化則在負(fù)重區(qū)特別明顯[3]。這一過程較為復(fù)雜，但已經(jīng)明確的是,關(guān)節(jié)軟骨的塑形重建是形成進(jìn)行性KOA病理過程的重要原因。中醫(yī)骨傷科文獻(xiàn)提出“骨正筋柔”“筋骨并重”等概念，針刀、圓利針等松解法以“調(diào)筋治骨”為基本原則，通過對(duì)膝關(guān)節(jié)周圍軟組織的松解，降低軟骨基質(zhì)退變及骨質(zhì)硬化、增生等現(xiàn)象，即通過“調(diào)筋”改善和恢復(fù)了關(guān)節(jié)的“筋”“骨”平衡，達(dá)到了“治骨”的效果。因此，與電針對(duì)照，開展針刀、圓利針?biāo)山夥▽?duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨形態(tài)學(xué)的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料 健康新西蘭大白兔45只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由北京金牧陽實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(京)2013-0022。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守國家科技部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。動(dòng)物自由飲水和攝食，光照與黑暗為12 h交替，室溫為20～22 ℃。按隨機(jī)原則將動(dòng)物分為5組，正常對(duì)照組、模型組、針刀組、電針組、圓利針組，每組9只，其中每組1只用于造模成功的病理檢測(cè)，其余8只用于其他指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 試劑：4%多聚甲醛、100%乙醇、碘伏、蘇木素伊紅染色試劑、EDTA-2Na、石蠟、磷酸緩沖液、二甲苯等試劑均采購自北京百諾威生物科技有限公司；2.5%戊二醛、丙酮、醋酸鈾、枸櫞酸鉛、餓酸(美國SPI)、環(huán)氧樹脂618(E51)包埋劑、150目帶膜銅網(wǎng)等均購自北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司。儀器:石蠟切片機(jī)(Leitz 1410型，德國)，BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)及冷凍臺(tái)(中國)，H8-202型尼康顯微鏡(日本Nikon)，奧林巴斯全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)(日本)，超薄切片機(jī)(瑞典LKB)，Quanta 250掃描電子顯微鏡(捷克FEI，北京中醫(yī)藥大學(xué)電鏡室)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法 改良后的Videman法左后肢伸直位固定制動(dòng)法[4]：造模前動(dòng)物禁食10～16 h，以3%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉，剪去左后肢踝關(guān)節(jié)以上兔毛，牽拉使其處于完全伸直位，速干型石膏繃帶經(jīng)65～85 ℃熱水浸泡軟化后，從腹股溝到趾頭固定(膝關(guān)節(jié)伸直180°，踝關(guān)節(jié)背屈60°),留出足趾觀察血供，石膏繃帶外用彈力醫(yī)用繃帶固定防止兔撕咬，共制動(dòng)6周[5]。如足趾有壞死傾向，立刻拆除石膏繃帶,待腫脹消退后再重新固定。若石膏繃帶松動(dòng)或脫落及時(shí)重新固定。造模滿6周(造模后6周)時(shí)從各組動(dòng)物隨機(jī)抽取1只處死，取關(guān)節(jié)軟骨作病理觀察，可見病變關(guān)節(jié)軟骨淺表區(qū)粗糙或有炎性腫脹，產(chǎn)生裂隙，深達(dá)輻射區(qū)，深層細(xì)胞數(shù)目異常，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目減少或簇聚，造模成功后將所有動(dòng)物石膏固定拆除。

2.2 干預(yù)處理與取材 1)干預(yù)處理。空白組：正常飼養(yǎng)。模型組：造模后正常飼養(yǎng)。電針組：造模后6周起，電針KOA兔左側(cè)“正極：陽陵泉，負(fù)極：陰陵泉”和“正極：內(nèi)膝眼，負(fù)極：外膝眼”。取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》并結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法，根據(jù)比較解剖取穴法結(jié)合模擬骨度取穴法，選取膝關(guān)節(jié)上述腧穴進(jìn)行治療。以韓氏穴位神經(jīng)刺激儀行電針刺激治療，分別連接陽陵泉和陰陵泉，內(nèi)膝眼和外膝眼。波形疏密波，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度3 mA，每次20 min。隔日治療1次，1周3次，共6周。針刀組：造模后6周起,兔膝關(guān)節(jié)左側(cè)針刀進(jìn)針部位,以龍膽紫定位，常規(guī)備皮、消毒，然后刺入針刀，出針并按壓片刻止血。每周1次，共6次。選用HZ系列一次性針刀，各進(jìn)針點(diǎn)具體操作如下。①內(nèi)、外側(cè)副韌帶進(jìn)針點(diǎn)操作:針刀于韌帶中點(diǎn)前緣進(jìn)針，刀口線與韌帶方向平行，刀體與皮膚切面垂直刺入，向韌帶起、止點(diǎn)方向分別松解5次，出刀并加壓片刻。②髕韌帶進(jìn)針點(diǎn)操作:刀口線與髕韌帶縱軸平行，刀體和髕韌帶皮膚切面垂直，快速剌入達(dá)髕韌帶下,由上而下松解5次，出刀并加壓片刻。圓利針組：造模后6周起，常規(guī)備皮、消毒，進(jìn)針點(diǎn)與針刀組相同，松解5次。一次性圓利針，每周1次，共6次。2)取材。所有干預(yù)結(jié)束1周后,采用空氣栓塞法處死動(dòng)物，打開膝關(guān)節(jié)腔，肉眼觀察KOA兔膝關(guān)節(jié)周圍韌帶、滑膜、關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)液等一般表現(xiàn),并以彭太平法組織病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)[6],并迅速取矢狀位在股骨外側(cè)髁切取2 mm×3 mm×5 mm大小的帶有軟骨下骨質(zhì)的軟骨標(biāo)本2塊，一塊標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液進(jìn)行組織固定，用于HE染色光鏡觀察；另一塊標(biāo)本置于2.5%的戊二醛進(jìn)行組織固定,用于掃描電鏡檢測(cè)。3)數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析。采用光學(xué)顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)性KOA兔關(guān)節(jié)軟骨潮線及間隙、鈣化層及深層軟骨改變情況，并于掃描電鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨表面超微結(jié)構(gòu)變化。使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)各組之間進(jìn)行比較，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 彭太平法組織病理學(xué)分析結(jié)果 根據(jù)彭太平法組織病理學(xué)分級(jí)，大體觀察各組兔膝關(guān)節(jié)周圍韌帶、滑膜、關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)液的一般表現(xiàn)，結(jié)果見表1。

表1 各組兔彭太平關(guān)節(jié)軟骨分級(jí)法對(duì)各組兔膝關(guān)節(jié)評(píng)分

注：與正常組相比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.2 關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果 見圖1～5。

圖1 正常組

圖1為正常組兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見：關(guān)節(jié)軟骨厚度正常，軟骨表面光滑、連續(xù)，軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，均勻呈柱狀排列，潮線清晰完整，無血管翳生成。

圖2 模型組

圖2為模型組KOA兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見:關(guān)節(jié)軟骨層狀結(jié)構(gòu)消失，軟骨表面細(xì)胞破損嚴(yán)重、出現(xiàn)大量剝脫缺損深達(dá)潮線，表層軟骨細(xì)胞稀少，細(xì)胞排列呈無序狀，層次紊亂，軟骨細(xì)胞巢居，潮線模糊、斷裂、甚至消失，部分軟骨有少量血管翳生成。

圖3 針刀組

圖3為針刀組KOA兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見:關(guān)節(jié)軟骨厚度正常，軟骨表面較光滑、連續(xù)，軟骨細(xì)胞形態(tài)總體正常，均久呈柱狀排列，潮線較清晰完整，部分潮線模糊，有少量血管翳生成。

圖4 電針組

圖4為電針組KOA兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見:關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄，軟骨表面欠光滑、出現(xiàn)少量剝脫缺損，部分深達(dá)潮線，表層軟骨細(xì)胞較正常組增多，部分細(xì)胞排列呈無序狀，層次紊亂較嚴(yán)重，軟骨細(xì)胞巢居，部分潮線模糊、斷裂，有少量血管翳生成。

圖5 圓利針組

圖5為圓利針組KOA兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見:關(guān)節(jié)軟骨厚度接近正常，軟骨表面較光滑、出現(xiàn)少量剝脫缺損，部分深達(dá)潮線，表層軟骨細(xì)胞較正常組減少，部分細(xì)胞排列呈無序狀，層次稍紊亂，軟骨細(xì)胞巢居，部分潮線模糊、斷裂，有少量血管翳生成。

3.3 關(guān)節(jié)軟骨掃描電鏡觀察結(jié)果 見圖6～10。

圖6 正常組

圖6為正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見:軟骨表面光滑，有凝膠樣物質(zhì)無定形物質(zhì)均勻覆蓋，其下膠原纖維結(jié)合成束，呈波紋狀結(jié)構(gòu)與溝紋相間并規(guī)則排列，具有典型的拱形結(jié)構(gòu)，其壟部和溝部相互平行，波峰間距均等。

圖7 模型組

圖7為模型組KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見:軟骨表面破損嚴(yán)重，表面結(jié)構(gòu)改變最為明顯，裂隙增寬、加深，部分膠原纖維裸露，部分軟骨基質(zhì)丟失，壟溝排列基本消失，有大量裂縫，表面凝膠樣物質(zhì)大量剝脫并有巖石樣凝膠顆粒附著，大量膠原纖維暴露、斷裂撕脫呈網(wǎng)狀，部分翻起，并排列紊亂。

圖8 針刀組

圖8為針刀組KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見:軟骨表面欠光滑，壟溝排列變淺，壟溝狀排列尚隱約可見，表面小凹陷，無定形物部分消失，代之以纖維素樣物質(zhì)， 未見凝膠樣物質(zhì)剝脫掀起，膠原纖維尚未暴露，并出現(xiàn)微孔。

圖9 電針組

圖9為電針組KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見:軟骨表面粗糙，裂隙增寬、加深，部分膠原纖維裸露，部分軟骨基質(zhì)丟失，壟溝排列變淺，凝膠樣物質(zhì)剝脫掀起，部分膠原纖維裸露、松散，甚至斷裂，粗細(xì)不均，并出現(xiàn)微孔。

圖10 圓利針組

圖10為圓利針組KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見：軟骨表面欠光滑，壟溝排列變淺，壟溝狀排列尚隱約可見，表面小凹陷，無定形物部分消失，代之以纖維素樣物質(zhì)，少量凝膠樣物質(zhì)剝脫掀起，有細(xì)小淺表裂縫，或呈皮疹樣改變，并出現(xiàn)微孔。

4 討論

針刀療法、電針療法、溫針灸療法、火針療法、三棱針療法等療法在中醫(yī)臨床治療膝骨性關(guān)節(jié)炎療效顯著，但機(jī)理研究尚為薄弱[7-8]。綜合本實(shí)驗(yàn)關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)變化可得出，制動(dòng)的造模措施造成KOA模型兔關(guān)節(jié)軟骨大體解剖以及超微結(jié)構(gòu)的病理變化,印證了模型復(fù)制成功且穩(wěn)定。針刀、電針和圓利針3種干預(yù)治療措施能有效改善軟骨的損害，從彭太平關(guān)節(jié)軟骨評(píng)分、HE染色切片和掃描電鏡結(jié)果示針刀組治療效果優(yōu)于圓利針和電針組，電針組和圓利針組相比,圓利針組改善較佳。這與嵇波[9]、覃蔚嵐[10]等學(xué)者的研究結(jié)果一致，針刀松解術(shù)可減緩KOA軟骨的退變,可促進(jìn)軟骨表面形成新生纖維組織和骨祖細(xì)胞的形成，有形成軟骨母細(xì)胞的趨勢(shì)。從形態(tài)學(xué)指標(biāo)變化，可示針刀和圓利針以關(guān)節(jié)周圍阿是穴(主要是肌肉韌帶的起止點(diǎn))為主要刺激部位的松解針刺法的總體效果優(yōu)于以腧穴特異性指導(dǎo)下的電針取穴治療，進(jìn)一步印證了《靈樞·經(jīng)筋》提出的經(jīng)筋病“以痛為輸”的治療原則，也進(jìn)一步說明了針刀、圓利針通過松解病變關(guān)節(jié)周圍的肌肉、肌腱及韌帶等軟組織(即筋肉)，即通過“調(diào)筋治骨”恢復(fù)關(guān)節(jié)周圍的“筋骨平衡”，達(dá)到治療效果的科學(xué)性。

膝骨關(guān)節(jié)炎不僅發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨損傷，同時(shí)還累及整個(gè)關(guān)節(jié)，包括關(guān)節(jié)周圍肌肉、肌腱、韌帶、軟骨下骨、關(guān)節(jié)囊和滑膜，最終發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨退變、纖維化、斷裂、潰瘍及整個(gè)關(guān)節(jié)面的損害。KOA關(guān)節(jié)的病理變化可看做關(guān)節(jié)周圍軟組織以及骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)反應(yīng)性結(jié)構(gòu)損害與修復(fù)的過程，無論在病程發(fā)展還是干預(yù)治療的過程中，病變關(guān)節(jié)部位的退行性變與組織修復(fù)始終伴行。對(duì)此,國外近10年來進(jìn)行了卓有成效的研究，并初步提出肌肉功能障礙學(xué)說與KOA發(fā)生發(fā)展的關(guān)系問題。由于KOA破壞的終端在軟骨和骨組織，因此許多研究集中于軟骨的損害與修復(fù)，對(duì)于膝關(guān)節(jié)周圍軟組織的關(guān)注較少，但軟骨乃至骨病變發(fā)生于過度的機(jī)械負(fù)荷是關(guān)節(jié)受到的原有應(yīng)力平衡打破導(dǎo)致的最終結(jié)果。相關(guān)研究[11]認(rèn)為,針刀療法可使KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞破壞程度和膠原纖維的紊亂程度明顯減少，對(duì)動(dòng)物中樞水平的β-內(nèi)啡呔及血清的炎性細(xì)胞因子有良性調(diào)節(jié)作用。目前實(shí)驗(yàn)研究大多集中于軟骨損害卻忽視了KOA早期的肌肉、韌帶損傷等病理基礎(chǔ)，或者可以說，肌肉等軟組織的損傷是膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的前提和原因，也就是說中醫(yī)學(xué)所說的“筋”即肌肉、韌帶等軟組織的損傷發(fā)生于KOA早期。

“膝為筋之府”,根據(jù)中醫(yī)骨傷科文獻(xiàn)提出的“筋骨并重”等相關(guān)理論，針刀松解法對(duì)KOA的治療以調(diào)筋治骨為基本原則。有學(xué)者認(rèn)為膝關(guān)節(jié)炎與“筋傷”關(guān)系密切，急、慢性損傷性應(yīng)力造成膝關(guān)節(jié)周圍軟組織(經(jīng)筋)損傷，引起勞損點(diǎn)黏連進(jìn)而引發(fā)軟骨退變、關(guān)節(jié)囊肥厚、骨贅增生等病變。因“傷筋而損骨”，并形成二者之間的惡性循環(huán)，破壞了膝關(guān)節(jié)的力學(xué)平衡，也就是改變了經(jīng)筋“束骨而利機(jī)關(guān)”的作用，使膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)力學(xué)平衡失調(diào)，從而使關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)功能發(fā)生退變，最終導(dǎo)致KOA的發(fā)生。因此，膝部經(jīng)筋的力學(xué)因素在KOA的發(fā)病中起著非常重要的作用，故以針刀松解法為代表的“調(diào)筋治骨”思路的作用機(jī)制值得探討。

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