低氧復合運動對大鼠骨骼肌線粒體含量的影響*

薄 海， 彭 朋， 秦永生， 張 勇

(1天津武警后勤學院軍事訓練醫(yī)學教研室，天津 300309； 2天津體育學院天津市運動生理學與運動醫(yī)學重點實驗室，天津 300381)

低氧是心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病、貧血等疾病的主要病理生理特征，也是高原醫(yī)學和航天醫(yī)學的重要研究命題。骨骼肌是機體主要的工作器官和氧耗器官，低氧導致骨骼肌形態(tài)與功能異常，表現(xiàn)為肌肉萎縮及工作能力降低，嚴重影響機體生活質量。線粒體是細胞主要的能量供應和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的來源。研究表明，慢性低氧暴露導致骨骼肌線粒體含量及呼吸鏈復合體表達進行性降低，伴隨肌肉質量及耐力進行性降低[1]。保護線粒體數(shù)量和質量是提高骨骼肌低氧耐受能力的有效措施[2]。

線粒體含量(mitochondrial content)與線粒體新生和降解的動態(tài)平衡相關，主要取決于線粒體生物合成(mitochondrial biogenesis)和線粒體自噬(mitophagy)兩個相反生物學機制的協(xié)同。兩者生物效應失衡導致?lián)p傷線粒體積累增加或線粒體增殖障礙，從而影響線粒體功能及細胞穩(wěn)態(tài)，與衰老、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等的發(fā)生相關[3]。研究表明，低氧復合運動可增加骨骼肌血管內皮生長因子表達及毛細血管密度，提高低氧狀態(tài)下肌組織氧的運輸和攝取[4]。我們前期也證明低氧復合運動可促進大鼠低氧習服，提高骨骼肌線粒體呼吸鏈氧化磷酸化效率及能量輸出水平[5]。本研究中，我們擬探討低氧及低氧復合運動對線粒體生物合成和自噬的調控，及其對線粒體含量的影響。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠32只，體重191～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證書為SCXK(京)2009-0004。大鼠隨機分為4組，每組8只，即常氧對照(normoxia control, NC)組、常氧運動(normoxia+training, NT)組、低氧對照(hypoxia control, HC)組和低氧復合運動(hypoxia+ training, HT)組。HC和HT組大鼠飼養(yǎng)于常壓低氧帳篷(Hypoxic System)，模擬11.3%氧濃度(相當于海拔5 000 m氧濃度)，持續(xù)低氧暴露4周。HT組大鼠于低氧帳篷內的動物跑臺上進行跑臺訓練(5°，15 m/min)，60 min/d，每周5 d，共4周。低氧及運動訓練條件與我們前期工作一致[5]。NC與NT組大鼠于常氧環(huán)境飼養(yǎng)，NT組大鼠于常氧環(huán)境跑臺訓練，運動訓練條件與HT組相同。各組動物均于末次低氧后即刻斷頭處死，快速分離雙側股四頭肌，部分于-80 ℃凍存?zhèn)溆?，其余即時制備線粒體。

2 骨骼肌線粒體提取

采用差速離心法提取骨骼肌線粒體[6]。肌肉組織剪碎、勻漿。加入提取介質(1 mmol/L EDTA，0.12 mol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，20 mmol/L HEPES，pH 7.4)，600×g離心10 min，取上清液于17 000×g離心10 min。取沉淀懸浮于20 mL提取介質中，7 000×g離心10 min。取沉淀懸浮于1 mL提取介質中。線粒體蛋白定量用考馬斯亮藍法檢測。

3 線粒體膜電位測定

采用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位[7]。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，此時JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。將線粒體加入0.9 mL JC-1染色工作液(碧云天生物技術研究所)，37 ℃避光水浴10 min。加入3 mmol/L蘋果酸和8 mmol/L谷氨酸啟動態(tài)4呼吸(不存在ADP時線粒體緩慢攝氧建立跨膜膜電位的呼吸態(tài))，熒光分光光度計測定紅色熒光(激發(fā)波長525 nm，發(fā)射波長590 nm)與綠色熒光(激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm)，以紅色熒光強度/綠色熒光強度表示線粒體膜電位。

4 線粒體ATP合成能力測定

采用螢光素-螢光素酶發(fā)光法[8]。在反應介質(0.5 μmol/L EDTA，3.0 μmol/L HEPES, 0.25 mol/L 蔗糖，0.1 mmol/L蘋果酸，1 mmol/L谷氨酸)中順序加入0.05 mg線粒體和20 μmol/L螢光素酶(Sigma)，記錄本底發(fā)光強度，繼而加入4 μmol/L ADP啟動反應，記錄發(fā)光強度的變化。

5 蛋白表達測定

Western blotting法檢測骨骼肌相關蛋白表達量，包括調控線粒體生物合成的過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma cofactor 1 alpha, PGC-1α)和線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A, Tfam)、調控線粒體自噬的Bcl-2/腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kD-interacting protein 3，Bnip3)和芐氯素1(beclin-1)、反映線粒體含量的細胞色素C氧化酶亞基IV(cytochrome C oxidase IV, COXIV)和電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1, VDAC-1)，以β-微管蛋白(β-tubulin)作為內參照。將提取蛋白樣品加入2× SDS上樣緩沖液，混合液 100 ℃加熱5 min，冰浴冷卻。在垂直電泳儀上用10 μg蛋白質樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉移致PVDF膜上。Ⅰ抗(Abcam)4 ℃靜置孵育過夜，洗滌3次，再以1∶1 000辣根過氧化物酶標記的對應Ⅱ抗(中杉金橋生物技術公司)室溫孵育1 h，充分洗滌后，使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，X光膠片壓片曝光，掃描定量各條帶的相對灰度值。各組以NC組條帶灰度值為100%，其灰度值與NC組條帶灰度值的比值，即為其相對表達量(%)。

6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，采用雙因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 低氧復合運動對骨骼肌線粒體膜電位和ATP合成能力的影響

與NC組比較，HC組中線粒體膜電位和ATP合成能力顯著降低(P<0.05，P<0.01)，NT組和HT組中線粒體ATP合成能力顯著升高(P<0.05)。HT組與HC組比較，線粒體膜電位和ATP合成能力顯著升高(P<0.05，P<0.01)，見圖1。

Figure 1. Mitochondrial membrane potential (A) and ATP synthesis capacity (B) in skeletal muscle. NC: normoxia control; NT: normoxia+training; HC: hypoxia control; HT: hypoxia+training.Mean±SD. n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs NC group; #P<0,05, ##P<0.01 vs HC group.

2 低氧復合運動對骨骼肌線粒體含量的影響

與NC組比較，NT組中COXIV 和VDAC-1蛋白表達顯著升高(P<0.01)，HC組中COXIV 和VDAC-1蛋白表達顯著降低(P<0.05)。HT組與HC組比較，COXIV 和VDAC-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. COXIV (A) and VDAC-1 (B) protein expression in skeletal muscle.Mean±SD. n=8.*P<0.05, **P<0.01 vs NC group; #P<0.05 vs HC group.

3 低氧復合運動對骨骼肌線粒體生物合成的影響

與NC組比較，NT組和HT組中Tfam蛋白表達顯著升高(P<0.05或P<0.01)，NT組中PGC-1α蛋白表達顯著升高(P<0.01)，HC組中PGC-1α和Tfam蛋白表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)。HT組與HC組比較，PGC-1α和Tfam蛋白表達顯著升高(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. PGC-1α (A) and Tfam (B) protein expression in skeletal muscle.Mean±SD. n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs HC group.

4 低氧復合運動對骨骼肌線粒體自噬的影響

與NC組比較，NT組、HT組和HC組中Bnip3和beclin-1蛋白表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。HT組與HC組比較，Bnip3和Beclin-1蛋白表達顯著升高(P<0.05或P<0.01)，見圖4。

Figure 4. Bnip3 (A) and beclin-1 (B) protein expression in skeletal muscle.Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs NC group; #P<0.05,##P<0.01 vs HC group.

討 論

為了更客觀地反映線粒體含量變化，我們分別選取線粒體呼吸鏈標志蛋白COXIV和線粒體外膜標志蛋白VDAC-1表達量作為衡量指標。結果表明，4周低氧暴露后骨骼肌COXIV和VDAC-1蛋白表達均明顯降低，提示慢性低氧減少了骨骼肌線粒體含量。Gamboa等[9]利用形態(tài)學研究表明，伴隨低氧暴露時間延長，小鼠膈肌線粒體數(shù)密度和體密度進行性降低。此外，低氧狀態(tài)下線粒體分布更趨向于肌膜下，以減少毛細血管氧擴散距離，這可能是對線粒體含量減少的代償機制之一[9]。

PGC-1α是線粒體生物合成最主要調控因子。我們發(fā)現(xiàn)4周低氧暴露后，PGC-1α及其下游Tfam蛋白表達均顯著降低。Levett等[10]報道世居平原人群移居高原，骨骼肌PGC-1α表達和線粒體密度均進行性降低，且二者顯著正相關,提示PGC-1α表達降低是低氧抑制線粒體生物合成的重要機制。PPARγ是PGC-1α重要的結合配體，并正性調控后者表達。Regnault等[11]報道，低氧暴露各時程PPARγ和PGC-1α表達同時降低，PPARγ激動劑羅格列酮可抑制低氧對PGC-1α表達的下調作用。這可能是慢性低氧抑制線粒體生物合成的機制之一。

線粒體損傷程度超過其修復能力時，線粒體自噬啟動以清除異常線粒體，是細胞的一種保護機制。本研究中4周低氧誘導線粒體自噬增加，表現(xiàn)為Bnip3和beclin-1蛋白表達顯著升高。Bnip3蛋白通過羧基端跨膜區(qū)錨定于線粒體外膜，并減少Bcl-2對Beclin-1的抑制作用，從而激活線粒體自噬。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)慢性低氧可誘導小鼠胚胎成纖維細胞中線粒體自噬，低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)誘導的Bnip3和beclin-1表達是這個進程的必要條件。值得注意的是，本研究中低氧明顯抑制線粒體膜電位和ATP合成能力，表明線粒體損傷明顯。以上提示，4周低氧造成線粒體功能障礙，雖啟動線粒體自噬但不足以清除受損線粒體，同時低氧抑制了線粒體生物合成，因而線粒體含量減少。

本研究中，4周低氧復合運動訓練提高了低氧環(huán)境中骨骼肌線粒體含量，同時線粒體生物合成中PGC-1α/Tfam通路明顯上調。研究表明，運動可提高慢性阻塞性肺疾病患者骨骼肌PPARγ表達[13]。這可能是低氧復合運動上調PGC-1α及其調控的線粒體生物合成的機制之一。此外，我們前期證明低氧復合運動通過一氧化氮途徑提高激活轉錄因子 1(activating transcription factor 1, ATF-1)表達及活性[14]。ATF-1可與HIF-1 DNA識別位點相互作用，與HIF-1協(xié)同調控多種低氧應答基因的表達。Akimoto等[15]利用活體基因成像技術證明，運動可通過ATF1途徑促進PGC-1α表達。提示ATF-1可能亦是低氧復合運動上調線粒體生物合成的潛在途徑。

我們還發(fā)現(xiàn)，4周低氧復合運動訓練后Bnip3和beclin-1蛋白表達進一步升高，伴隨線粒體膜電位和ATP合成能力明顯升高, 提示低氧復合運動促進了低氧誘導的Bnip3和beclin-1介導的線粒體自噬保護機制，有效清除損傷線粒體。He等[16]報道8周跑臺訓練可提高高脂飲食小鼠骨骼肌Bcl-2介導的線粒體自噬，抑制胰島素抵抗造成的血糖升高。Kim等[17]發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠骨骼肌線粒體自噬明顯減少，而8周跑臺訓練顯著提高了線粒體自噬水平。以上表明，線粒體自噬是實現(xiàn)運動健康效應的途徑之一。Hagan等[18]證明，低氧狀態(tài)下PGC-1α過表達可促進HIF-1α及其下游靶基因表達。我們推測，低氧復合運動可能通過上調PGC-1α表達，刺激HIF-1α依賴性Bnip3介導的線粒體自噬。

總之，慢性低氧暴露提高了線粒體自噬但抑制了線粒體生物合成，導致線粒體含量減少。低氧復合運動促進低氧狀態(tài)下骨骼肌線粒體自噬，以有效清除損傷線粒體，并促進線粒體生物合成，產(chǎn)生健康線粒體以維持線粒體數(shù)量閾值和功能。

[參 考 文 獻]

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