丙戊酸孤獨癥大鼠腦中經(jīng)典Wnt信號通路的變化*

張應(yīng)花， 鄧曉慧， 王中平， 崔衛(wèi)剛,， 文小軍， 李瑞錫

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，上海 200032；3九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，江西 九江 332000)

孤獨癥是一種廣泛的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，臨床上患兒有以下三大核心特征：語言發(fā)育延遲、社交行為障礙、重復(fù)呆板樣行為[1]，嚴重影響了患兒的語言形成、社交行為及情緒認知。然后，孤獨癥的病因還是一個謎。孤獨癥病因不明，目前普遍認為是遺傳和環(huán)境因素在腦發(fā)育關(guān)鍵時期共同作用的結(jié)果。非遺傳因素可能與干擾胚胎腦發(fā)育的正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，而遺傳因素可能是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常導(dǎo)致的基因突變所致。

經(jīng)典Wnt通路又稱為 Wnt/β-catenin 通路, 其主要成員有Wnt、Frizzled 受體、Dvl/Dsh、糖原合成酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、Axin、APC、β-catenin及TCF/LEF等等，其中β-catenin是關(guān)鍵分子。在存在Wnt 配體的情況下，Dvl抑制 APC、Axin和GSK3β等組成的破壞復(fù)合體。抑制破壞復(fù)合體導(dǎo)致β-catenin在胞漿中聚集，β-catenin 越聚越多，隨后移位至胞核。在細胞核內(nèi)，β-catenin 與 TCF/LEF轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，激活Wnt下游靶基因cyclin D1、c-myc等的轉(zhuǎn)錄。在沒有Wnt信號情況下，GSK-3β磷酸化β-catenin，磷酸化的β-catenin被蛋白酶體降解，從而使細胞內(nèi)游離的β-catenin保持在極低的水平，這時TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子在細胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合，從而抑制Wnt靶基因的表達[2]。

經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)控細胞的增殖、遷移、分化、細胞的凋亡、突觸的形成與聯(lián)系，調(diào)控細胞、組織及器官正常有序的分化和生長發(fā)育。經(jīng)典Wnt信號通路在個體發(fā)育尤其是神經(jīng)發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的的作用。然而Wnt通路作用猶如雙刃劍，既是調(diào)控神經(jīng)細胞正常分化發(fā)育的重要通路，又是神經(jīng)發(fā)育疾病發(fā)生的成因之一，通路中任何蛋白分子表達異常，都將引起信號傳遞錯誤，導(dǎo)致細胞命運的改變，進而引發(fā)神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的發(fā)生，如孤獨癥。

Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常導(dǎo)致孤獨癥患者腦形態(tài)和功能異常。如β-catenin過度表達，能使神經(jīng)前體細胞增殖，可能與孤獨癥腦早期的過度增生有關(guān)，而β-catenin的失活會導(dǎo)致腦發(fā)育畸形和顱面發(fā)育不全。此外，研究發(fā)現(xiàn)，孤獨癥模型鼠存在β-catenin及其靶基因表達上調(diào)[3]，而且 β-catenin時空表達存在明顯異常。經(jīng)典Wnt信號通路一個基因的突變，如Wnt1，增加下游信號通路的激活可能會導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育及行為學(xué)表現(xiàn)異常。最近研究結(jié)果顯示，Wnt1反義突變導(dǎo)致Wnt信號通路激活，可能增加了孤獨癥的易感性[4]。這些研究強烈提示W(wǎng)nt通路與孤獨癥的發(fā)病密切相關(guān)。故研究該信號通路及其通路中蛋白基因與孤獨癥的發(fā)病關(guān)系，對揭示孤獨癥的分子病因和發(fā)病機制，具有重要的理論和實踐意義。

丙戊酸(valproic acid，VPA)具有抑制γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性而增強突觸內(nèi)γ-氨基丁酸能神經(jīng)傳遞的作用，是臨床用于治療癲癇、雙向情感障礙及偏頭痛的常規(guī)藥物。然而，近10年來流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，孕婦在懷孕早期服用 VPA，大大增加了子代患孤獨癥的風(fēng)險。通過在懷孕早期運用 VPA 處理孕鼠，能較好地在子代幼鼠上復(fù)制出類似孤獨癥患者表現(xiàn)出的某些癥狀，也在子代幼鼠腦區(qū)檢測出一些類似的組織結(jié)構(gòu)及生化異常。VPA動物模型是目前公認的較成熟的孤獨癥動物模型[5]。為此，本實驗擬用VPA孤獨癥動物模型研究經(jīng)典Wnt信號通路活性變化，以揭示孤獨癥發(fā)生的可能機制，為孤獨癥的分子病因提供有力的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1主要材料和試劑 VPA購自Sigma；兔抗GSK-3β、phospho-GSK-3β和phospho-β-catenin抗體購于Cell Signaling Technology；兔抗β-catenin抗體購于Santa Cruz；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購于康成公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG購于Jackson；Western Ⅰ抗稀釋液、蛋白裂解緩沖液、蛋白濃度測定BCA試劑盒購于碧云天；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa，2×PCR mix購自Invitrogen，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2動物 健康成年雄性(300～350 g)及雌性(200～250 g) Wistar大鼠，購自中國科學(xué)院(上海)實驗動物部，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系專用動物房，給予充分的飼料和飲水。所有實驗動物喂養(yǎng)及實驗程序均嚴格遵照復(fù)旦大學(xué)實驗動物保護條款。

2 方法

2.1孤獨癥大鼠模型建立 Wistar大鼠在周期性光照(7:00 AM～7:00 PM)、恒溫 25 ℃和恒濕 55%條件下飼養(yǎng)數(shù)天，使之適應(yīng)環(huán)境。然后，按雌∶雄 2∶1合籠過夜。第2天早晨，檢查到陰栓的雌鼠記為E1 d， 然后分籠單獨飼養(yǎng)。參照Schneider等[6]使用的方法，將受孕母鼠隨機分成2組：模型組在 E12.5 d時給予母鼠600 mg/kg VPA (ip)，VPA粉末用0.85%生理鹽水(normal saline，NS)配成 250 g/L的溶液。對照組母鼠給予同等量的 NS (ip)。模型組母鼠產(chǎn)下的仔鼠記為VPA 孤獨癥模型鼠(VPA組)；對照組母鼠產(chǎn)下的仔鼠記為正常對照組(control組)。仔鼠在出生后23 d (postnatal day 23, PND23)斷乳。VPA 組仔鼠和control 組仔鼠分別取 8只進行后續(xù)實驗研究。

2.2孤獨癥模型動物生長發(fā)育和行為學(xué)檢測 為觀察PND7～10幼鼠的方向趨向性機能，分別取6只 VPA組及control組子代鼠，將幼鼠頭朝下放置在 25°光滑傾斜平面上，觀察幼鼠轉(zhuǎn)動180°的活動情況，記錄比較VPA組及control組子代鼠完成轉(zhuǎn)動所花費的時間平均值。這項實驗反映了幼鼠方向感覺及運動機能等的總體發(fā)育水平。PND23的幼鼠進行熱平板實驗，幼鼠測試前適應(yīng)環(huán)境30 min。使用GJ-8402型熱板測痛儀致痛，準確調(diào)節(jié)熱板溫度在(55.0±0.5)℃，并用水銀溫度計校對。以放入幼鼠開始計時，至鼠翹起后足或舔后足為止，所經(jīng)歷的時間作為痛反應(yīng)的指標，此時間即為痛閾值。22 s為最大刺痛閾值，以避免對組織造成損傷。每只動物重復(fù) 3 次，間隔時間為 15 min。每次由不同的檢測者進行測試，記錄比較VPA組及control組子代鼠平均痛閾值。

2.3Western blotting檢測經(jīng)典Wnt信號通路信號分子蛋白水平的表達 用蛋白裂解液提取大鼠前額葉皮質(zhì)與海馬腦組織總蛋白質(zhì)，用BCA法測定樣品的蛋白濃度。加入5×loading buffer后，100 ℃加熱變性3 min。進行12%SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白TBST搖床常溫封閉2 h。加Ⅰ抗，4 ℃搖床過夜；加Ⅱ抗和GAPDH搖床常溫1 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，然后將PVDF膜置于Bio-Rad的顯影機上，獲取反應(yīng)條帶的數(shù)字圖并將條帶進行灰度測定，以目的蛋白和內(nèi)參照GAPDH蛋白的灰度比值代表目的蛋白的相對表達量。

2.4半定量RT-PCR檢測經(jīng)典Wnt信號通路信號分子mRNA水平的表達 用Trizol提取大鼠前額葉皮質(zhì)與海馬腦組織總RNA。A260/A280比值在1.8～2.0之間。根據(jù)GenBank提供的基因序列使用Primer Design軟件進行引物設(shè)計。引物序列參照表1。RT-PCR按照說明書進行操作,反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min變性，然后95 ℃，30 s,57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,擴增30個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖(溶于1×TBE)凝膠電泳分離，在Runone DNA電泳系統(tǒng)中進行，用數(shù)字成像系統(tǒng)分析圖像，以目的基因灰度與內(nèi)參照基因灰度比值代表目的基因的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件處理，兩組間比較用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孤獨癥模型動物生長發(fā)育及行為學(xué)檢測比較

當把大鼠頭朝下放置在傾斜平面時，大鼠有自動轉(zhuǎn)身 180°而頭保持朝上的本能。轉(zhuǎn)身過程所用時間的長短反映了大鼠前庭感覺及運動機能的發(fā)育情況。在檢測的各年齡段，孤獨癥模型組仔鼠轉(zhuǎn)身所用時間較對照組顯著增加，見圖1A，表明VPA處理對子代鼠的前庭感覺及活動造成不利影響。熱平板實驗結(jié)果顯示，孤獨癥模型組痛閾值比正常對照組明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1B，說明孤獨癥模型組痛覺明顯比對照組遲鈍，逃避傷害性刺激動作遲緩，對傷害性知覺不敏感。以這些模型動物為實驗對象，做后續(xù)實驗是可靠的。

表1 半定量RT-PCR引物序列

Figure 1. Geotaxis and thermal hyperalgesia in autistic and control rats. A: geotaxis; B: pain threshold. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2 孤獨癥大鼠經(jīng)典Wnt信號通路GSK-3β及β-catenin mRNA表達變化

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，孤獨癥模型組GSK-3β mRNA表達低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2A，而β-catenin mRNA表達高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2B。

Figure 2. Expression of GSK-3β (A) and β-catenin (B) mRNA in prefrontal cortex (PFC) and hippocampus formation (HF) of control and autism rats. Mean ±SD.n=8.*P<0.05 vs control.

3 孤獨癥大鼠經(jīng)典Wnt信號通路GSK-3β及β-catenin 蛋白及磷酸化表達變化

Western blotting結(jié)果顯示，孤獨癥模型組GSK-3β磷酸化表達明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3A，而β-catenin 磷酸化表達明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3B。

Figure 3. Expression of GSK-3β (A) and β-catenin (B) proteins in PFC and HF of control and autism rats. p-GSK-3β：phosphorylated GSK-3β (Ser 9); T-GSK-3β: total GSK-3β; p-β-catenin: phosphorylated β-catenin (ser33/37/Thr41); T-β-catenin: total β-catenin. Mean±SD. n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

4 孤獨癥大鼠經(jīng)典Wnt信號通路下游c-Myc及cyclin D1 mRNA表達變化

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，孤獨癥模型組c-Myc及cyclin D1 mRNA表達明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

Figure 4. Expression of c-Myc (A) and cyclin D1 (B) mRNA in PFC and HF of control and autism rats.Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

討 論

為探討經(jīng)典Wnt信號通路在孤獨癥發(fā)病中的作用，本實驗檢測了孤獨癥模型大鼠PFC和HF腦區(qū)內(nèi)經(jīng)典Wnt信號通路的活性變化。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，孤獨癥模型大鼠腦內(nèi)經(jīng)典Wnt通路的活性增強，基于GSK-3β mRNA減少，失活的GSK-3β磷酸化表達增加；β-catenin mRNA增加，抑制性的β-catenin磷酸化減少；下游c-Myc和cyclin D1 mRNA增加。這些結(jié)果提示經(jīng)典Wnt信號通路活性增加可能是孤獨癥發(fā)病的原因之一，其活性增強可能促進對孤獨癥的易感性。

研究顯示，影響個體發(fā)育的環(huán)境危險因素與孤獨癥發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)。妊娠早期即在神經(jīng)管閉合時期VPA暴露大大增加子代罹患孤獨癥的風(fēng)險。孤獨癥在個體發(fā)育早期表現(xiàn)為腦過度增長，這可能與參與胚胎發(fā)育調(diào)控的 Wnt 信號通路傳導(dǎo)障礙有關(guān)[5]。

經(jīng)典Wnt 信號通路調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞增殖、分化、遷移、凋亡、突觸的形成與聯(lián)系及胚胎的發(fā)育，參與孤獨癥的發(fā)生[3, 7]。但是，迄今為止，經(jīng)典的 Wnt信號通路如何參與孤獨癥發(fā)生的分子機制并不完全清楚。我們課題組以前研究結(jié)果顯示，VPA 暴露上調(diào)Wnt1 和 Wnt2表達，增加下游靶基因engrailed-1和 cyclin D1表達[3]。這可能與Wnt1和 Wnt2 表達增加激活經(jīng)典Wnt信號通路，導(dǎo)致下游信號分子β-catenin表達增加，從而激活 Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VPA 暴露顯著減少抑制性的β-catenin(Ser33/37/Thr41)磷酸化水平，增加失活的GSK-3β(Ser9)磷酸化水平，導(dǎo)致經(jīng)典Wnt 信號通路活性增加。GSK-3β是β-catenin上游的負性調(diào)節(jié)因子，參與磷酸化β-catenin，與β-catenin胞漿降解緊密相關(guān)， 故在孤獨癥發(fā)病機理中起著至關(guān)重要的作用[8]。GSK-3β受N 末端絲氨酸(Ser9)負性調(diào)節(jié)，磷酸化Ser9 則GSK-3β失活；相反，磷酸化其酪氨酸(Tyr216)則GSK-3β活性增加[9]。我們實驗結(jié)果表明，VPA暴露增加了失活的GSK-3β(Ser9)磷酸化，表現(xiàn)在 GSK-3β底物β-catenin表達增加，β-catenin 磷酸化減少。這一結(jié)果與以前的報道結(jié)果是一致的，即孤獨癥的發(fā)生與GSK-3β活性增強有關(guān)[8]。顯然，GSK-3β(Ser9)磷酸化增加、β-catenin(Ser33/37/Thr41)磷酸化減少表明經(jīng)典Wnt信號通路活性增加，暗示經(jīng)典Wnt信號通路參與孤獨癥的發(fā)生。我們前期結(jié)果顯示，經(jīng)典Wnt信號通路特異性抑制劑舒林酸處理以后，傷害性知覺、重復(fù)刻板樣、學(xué)習(xí)記憶能力等孤獨癥樣行為均有所改善[5]，該結(jié)果進一步證實了我們的推斷，即Wnt/β-catenin信號通路活性增加促進了對孤獨癥的易感性。

綜上所述，我們認為，VPA暴露通過誘導(dǎo)腦組織Wnt/β-catenin通路活性增加，使腦內(nèi)經(jīng)典Wnt信號通路功能增強，可能影響神經(jīng)元正常發(fā)育和聯(lián)系，阻礙了正常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成，從而可能引起社會交往、情緒和語言等行為方面的異常，最終導(dǎo)致孤獨癥的發(fā)病。

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