恰麻古中總黃酮提取工藝*

海力茜·陶爾大洪，古娜娜·對山別克

(新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830054)

維藥恰麻古，又稱為蕪菁(Brassica rapaL.)，為十字花科植物蕪菁(Brassica rapaL.)的塊根。恰麻古在維吾爾醫(yī)藥中應用歷史悠久，療效肯定。據(jù)《維吾爾藥志》記載，該藥具有潤肺、開胸順氣、健胃消食、解毒的功效。用于胸悶腹胃脹痛、食欲不振等癥［1］。初步實驗研究發(fā)現(xiàn)，恰麻古藥材中含有皂苷、黃酮類、糖類及其苷、生物堿、內(nèi)酯、揮發(fā)油、酚類、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)等化學成分［2］。黃酮類化合物具有降低血糖、保護心腦血管、利膽保肝、抗炎、抗氧化等多種功效［3-4］。為合理開發(fā)利用資源，筆者采用回流提取和紫外-可見分光光度法優(yōu)選出恰麻古中總黃酮的最佳提取工藝，并對不同產(chǎn)地恰麻古中總黃酮的含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1102紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)，超聲波清洗機(200 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)，萬能粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1 mg)，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥 恰麻古采自新疆阿克蘇、喀什、托克遜、伊犁、博樂，秋季采摘，由新疆醫(yī)科大學藥學院生藥/天藥教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為十字花科植物蕪菁(Brassica rapaL.)的塊根。蘆丁對照品(批號:0080-9705)由中國食品藥品檢定研究院提供，純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 稱取恰麻古樣品1.0 g，加入75%乙醇50mL，于80℃水浴中回流提取2.5 h，將提取溶液濃縮置于50mL量瓶并定容搖勻，作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品10.00 mg精確稱定，置50mL量瓶中，加入60%乙醇30mL，放在水浴上微熱，使蘆丁完全溶解，并用60%乙醇溶液定容，搖勻，得 0.200 mg·mL－1的蘆丁對照品溶液。

2.3 測定波長的選擇 分別取對照品和供試品溶液，按“2.4”項標準曲線的繪制方法顯色，于400～600 nm波長范圍掃描，確定510 nm為最大吸收波長。

2.4 標準曲線的繪制 準確量取蘆丁對照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，分別置于 25mL量瓶，各依次加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，振搖后放置5min，加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻后放置6min，加4%氫氧化鈉溶液10mL，最后用60%乙醇定容至刻度，以60%乙醇作為空白對照，在510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁對照品溶液濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，得到蘆丁對照品溶液濃度與吸光度之間的回歸方程A=13.364C－0.008 6(濃度范圍為0.008 ～0.048 mg·mL－1)，r=0.999 3，表明線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實驗 精密量取蘆丁標準品溶液3.0mL，置25mL量瓶，按“2.4”項顯色處理并定容后于510 nm波長處重復測定吸光度6次，RSD=0.022%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 準確吸取供試品溶液5mL，共6份，置于25mL量瓶，按“2.4”項顯色處理后于 0，10，30，60，90min時在510 nm波長處測定吸光度，考察其顯色后的穩(wěn)定性，得穩(wěn)定性實驗的RSD=1.311%(n=6)，供試品溶液40min內(nèi)總黃酮的含量穩(wěn)定，須在40min內(nèi)盡快測定吸光度。

2.7 重復性實驗 取干燥的恰麻古粉末1.0 g準確稱定，共5份，按“2.1”項平行實驗，按“2.4”項方法顯色，在510 nm波長測定吸光度，結(jié)果RSD為1.601%。

2.8 加樣回收率實驗 取已知總黃酮含量的供試品溶液9份各2mL，置200mL量瓶，按低、中、高濃度分別加入蘆丁對照品 1.5，1.5，1.5，3.0，3.0，3.0，4.5，4.5，4.5 mg，定容至刻度。按“2.4”項顯色處理后于510 nm波長處測定吸光度。結(jié)果表明，平均加樣回收率為99.59%，RSD=0.376%(n=9)。見表1。

2.9 恰麻古總黃酮的提取及含量測定 取干燥的恰麻古粉末1.000 g精密稱定，置于圓底燒瓶，綜合考察提取溫度、乙醇濃度、提取時間和料液比4個因素，每個因素分別設(shè)計3個不同水平，采用L9(34)正交表進行實驗篩選，實驗因素水平表見表2。

將提取溶液濃縮置于50mL量瓶并定容搖勻，按“2.4”項顯色并在510 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算總黃酮的濃度，即得(表3)。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.1 Result of recovery

表2 正交實驗設(shè)計Tab.2 Design of orthogonal experiment

表3 正交實驗數(shù)據(jù)分析表Tab.3 Data analysis of orthogonal experiment

為了確定顯著性因子，對表2進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表4。

2.10 最佳條件的選擇 通過方差分析表可知，A、B、C、D因素均P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，按平均方差大小排列，各因素對實驗的影響大小為D＞B＞A＞C，該結(jié)果與直觀分析的結(jié)果一致，最優(yōu)條件為:乙醇濃度75%，提取時間2.5 h，提取溫度80℃，料液比1∶60。

2.11 工藝驗證實驗 精密稱取6份干燥的恰麻古粉末，每份1.000 g，按最佳工藝提取，按“2.4”項顯色處理后于510 nm波長處測定吸光度，結(jié)果3次測定提取溶液中黃酮含量分別為0.034 00，0.033 86，0.033 89 ng·mL－1。求得RSD=0.187%(n=6)，表明所選工藝合理可行。

表4 正交實驗結(jié)果的方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment

2.12 不同產(chǎn)地恰麻古總黃酮的含量測定 根據(jù)最佳提取工藝對阿克蘇、喀什、托克遜、伊犁、博樂這5個不同產(chǎn)地的恰麻古的總黃酮進行含量測定，結(jié)果總黃酮含量分別為 0.280% ，0.261%，0.237%，0.257%，0.264%。

3 討論

本實驗以回流提取法提取和紫外可見分光光度法測定恰麻古中黃酮含量，通過正交實驗優(yōu)選出最佳提取工藝為:乙醇濃度75%，提取時間2.5 h，提取溫度80℃，料液比1∶60。根據(jù)最佳工藝，提取并測定了新疆5個產(chǎn)地恰麻古中總黃酮的含量，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的恰麻古其總黃酮的含量有差異，其中阿克蘇產(chǎn)恰麻古中總黃酮含量最高。本實驗采用紫外可見分光光度法測定總黃酮含量的重復性、穩(wěn)定性能夠符合要求，方法簡單易行，適用于恰麻古中總黃酮含量的測定。

［1］劉勇民.維吾爾藥志(下冊)［M］.烏魯木齊:新疆科學技術(shù)出版社，1996:334－335.

［2］周芳，海力茜·陶爾大洪.維藥恰麻古化學成分預實驗［J］.海峽藥學，2009，21(6):100－102.

［3］李茂星.鐮形棘豆黃酮類成分提取工藝與體外抗氧化活性研究［J］.醫(yī)藥導報，2012，31(9):1195－1199.

［4］宋成英，黃俊懿.對生物黃酮生物活性的綜述［J］.化學工程與裝備，2013，(4):128－130.