表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉的制備*

周暉，賀霞，楊文濤，姜偉化，楊磊，王東凱

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥劑科，沈陽 110001;2.沈陽藥科大學藥學院，沈陽 110016)

表柔比星是一種高效、廣譜的抗腫瘤藥，單一用藥對多種腫瘤有廣譜抑制作用，主要應用于肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌和白血病的化學治療(化療)。雖然上市的表柔比星注射劑療效確切，但仍有不少毒副作用，目前人們已采用多種方法來減少該藥物的全身毒副作用，特別是心臟毒性，主要是應用藥物載體，改變表柔比星的生物分布，減少表柔比星在全身特別是心臟組織中的分布，提高其在局部腫瘤中的含量。這些藥物載體包括乳劑［1］、納米粒［2］、微球［3］、脂質(zhì)體等。脂質(zhì)體混懸液的物理化學穩(wěn)定性差，是脂質(zhì)體應用于臨床的主要困難，因為混懸液中磷脂不可避免地存在水解氧化，并且藥物也容易泄露，且粒子的聚集導致粒徑變大［4］。1978年，VANLEBERGHE等首次報道采用冷凍干燥法提高脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性，制成凍干脂質(zhì)體可以顯著降低磷脂和藥物的水解和氧化速度，同時，凍干保護劑也保持了脂質(zhì)體膜結構的完整性，克服脂質(zhì)體聚集、融合以及藥物滲漏等不穩(wěn)定因素，顯著提高貯存穩(wěn)定性。目前，該法已成為較有前途的改善脂質(zhì)體制劑長期穩(wěn)定性的方法之一［5］。吳燕等［6］選擇二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidyl choline，DPPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(distearoyl phosphatidyl glycerol，DSPG)、1-肉豆蔻?；?2-硬脂?；字Ｄ憠A(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine，MSPC)等材質(zhì)制備鹽酸表柔比星長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體，并對其體外釋放機制進行了研究。方瑜等［7］以四氧化三鐵(Fe3O4)為磁核，聚乙二醇單甲醚(methoxy polyethylene glycol，mPEG)為修飾劑制得鹽酸表柔比星長循環(huán)磁性脂質(zhì)體，結果表明脂質(zhì)體磁響應性和緩釋效果均良好。筆者前期制備了甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(methoxy polyethylene glycol 2000-2 stearyl phosphatidyl ethanolamine，PEG2000-DSPE)長循環(huán)脂質(zhì)體，筆者在本實驗中重點考察表柔比星脂質(zhì)體凍干粉針的制備及制劑的穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-10A高效液相色譜儀(日本島津株式會社)、色譜柱:Diamonsil ODS C18［250mm × 4.6mm，5 μm，迪馬科技(天津)有限公司］、COULTER LS230 粒徑分析儀(美國BECKMAN公司)、COULTER DELSA440 SX Zeta電位及粒徑測定儀(美國BECKMAN公司)、冷凍干燥機(北京四環(huán)科學儀器廠)。

1.2 試藥 表柔比星原料藥(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司提供，批號:110901，含量:99.7%)、蔗糖(天津市博迪化工有限公司，批號:20120302)、甘露醇(天津市博迪化工有限公司，批號:20120124)、海藻糖(廣西南寧中諾生物制品有限公司，批號:20120401)、葡萄糖(天津市大茂化學試劑廠，批號:20110902)、乳糖(美劑樂，批號:NT1008)、大豆磷脂(SPC，S100，純度 ＞95%，批號:DPC120406)(Lipoid)、PEG2000-DSPE(批號:110803)(Lipoid)、膽固醇(天津市博迪化工有限公司，批號:20111202)。

2 方法與結果

2.1 表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體的制備 稱取適量大豆磷脂、膽固醇及PEG2000-DSPE，按質(zhì)量比4∶1∶0.5混合，加入適量乙醇超聲溶解，水浴加熱揮去部分乙醇，注入預熱至相同溫度的250mmol·L－1的硫酸銨溶液，孵育30min，制得脂質(zhì)體初品。以超聲波細胞粉碎機在480 W超聲90 s處理所得脂質(zhì)體，依次通過孔徑0.45，0.22 μm 的微孔濾膜整粒，即得空白脂質(zhì)體。采用透析法(0.9%氯化鈉溶液4 L中透析2 h，重復3次)建立脂質(zhì)體跨膜硫酸銨梯度［8］，加入適量表柔比星溶液(藥脂比1∶10，W/W)，于50℃孵育30min即得載藥脂質(zhì)體。

2.2 脂質(zhì)體混懸液穩(wěn)定性考察 由于脂質(zhì)體中磷脂的不穩(wěn)定性，該脂質(zhì)體的預計儲存條件為冰箱4℃冷藏保存，將優(yōu)化的表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體置于西林瓶中，充氮密封，置于4℃條件下避光放置，分別于0，1，4，7，15，30 d 取樣，考察制劑的外觀、包封率、含量，以及光學顯微鏡下形態(tài)變化，結果見表1。

包封率(%)=C2/C1*100%。式中C1為不經(jīng)微柱離心脂質(zhì)體中表柔比星的濃度;C2為微柱離心后包封于脂質(zhì)體中表柔比星的濃度。

含量測定方法:精密稱取長循環(huán)脂質(zhì)體適量，置10mL量瓶，加入甲醇5mL，超聲破壞5min，加水稀釋至刻度，移取1mL 至10mL量瓶，以水定容，0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液，另準確配制20 μg·mL－1表柔比星對照溶液，分別取上述對照及供試品溶液20 μL進樣，測得表柔比星峰面積，連續(xù)5次，按外標法計算表柔比星含量。

含量(Cx)=Cr*(Ax/Ar)。Ax為供試品峰面積;Cr為對照品溶液的濃度;Ar為對照品的峰面積。

由脂質(zhì)體混懸液在4℃的穩(wěn)定性結果可見，長循環(huán)脂質(zhì)體4℃放置30 d時包封率略降低，為94.87%，外觀、藥物含量以及顯微鏡下形態(tài)無顯著變化。

2.3 表柔比星脂質(zhì)體冷凍干燥研究

2.3.1 凍干保護劑種類的篩選 一般而言，脂質(zhì)體的雙層膜結構對冷凍和干燥工藝敏感，加入適宜的凍干保護劑則可減弱或者消除凍干工藝對脂質(zhì)體造成的破壞［9］。為確定凍干保護劑對脂質(zhì)體凍干的影響，考察了葡萄糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖等保護劑對表柔比星脂質(zhì)體凍干的影響。固定凍干保護劑與脂質(zhì)比例為2∶1，以凍干產(chǎn)品的外觀、再分散性以及顯微形態(tài)為評價指標，評價凍干制品的質(zhì)量。實驗結果見表2。

表1 表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體在4℃條件下的穩(wěn)定性考察結果Tab.1 Stability results of long-circulation epirubicin liposomes at 4℃

表2 不同保護劑對凍干產(chǎn)品的影響Tab.2 Effect of various protective agent on freeze-dried products

由表2可知，保護劑對凍干品有明顯的保護作用，未加入凍干保護劑的處方外觀及復溶性均較差。以甘露醇作為凍干保護劑，凍干品的外觀較好，但復溶困難，復溶后有磷脂碎片;以蔗糖和葡萄糖、乳糖作為凍干保護劑，凍干品外觀差，且復溶后渾濁，粒徑變化較大，這可能是蔗糖和葡萄糖形成的樣品溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較低，凍干過程不能形成玻璃態(tài)，以致磷脂膜破裂［10］。以海藻糖作凍干保護劑，凍干品外觀好，重建容易，無粒子聚集，故初步確定海藻糖作為凍干保護劑。

2.3.2 凍干保護劑濃度的考察 初步確定以海藻糖作為凍干保護劑，考察不同保護劑和脂質(zhì)的比例時凍干產(chǎn)品的外觀、再分散性、再分散后粒徑大小，結果見表3。

由以上結果可知，當保護劑和脂質(zhì)的比例為3∶1時，凍干產(chǎn)品的外觀、再分散、再分散后粒徑大小及分布均達到理想的效果，繼續(xù)增加保護劑和脂質(zhì)的比例，效果不明顯，故選擇保護劑和脂質(zhì)的比例為3∶1。

表3 不同比例的凍干保護劑與脂質(zhì)體對凍干產(chǎn)品的影響Tab.3 Effect of the ratio of protective agent to liposome on freeze-dried products

2.3.3 凍干工藝的考察 將表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體的裝量定為每支2mL，各50支?？疾焖賰?將樣品直接放入－70℃冰箱中預凍)和慢凍(樣品隨冷卻溫度逐漸降低到－50℃)兩種預凍方式對凍干產(chǎn)品的影響，結果見表4。

表4 兩種預凍方式對產(chǎn)品的影響Tab.4 Effect of two precool ways on the product

實驗結果顯示，兩種預凍方式得到的產(chǎn)品性狀差異不大。預凍時間為5 h，產(chǎn)品收率較低?？赡苁且驗轭A凍時間短，制劑內(nèi)部未充分凍實。干燥過程中，首先上表面形成一層外殼，內(nèi)部水分較難揮發(fā)，達到一定溫度后內(nèi)部融化導致塌陷。預凍8，10 h產(chǎn)品收率較高，均＞90%。從便于實驗的角度，選擇速凍法進行預凍，預凍溫度為－70℃，預凍時間為8 h。

2.3.4 干燥時間考察 表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體的裝量定為每支2mL，各50支。本實驗所考察的干燥時間為兩個階段的總干燥時間，考察凍干時間分別為24，30，36 h時凍干產(chǎn)品的外觀及收率，結果見表5。

由表5可知，凍干時間為24 h時產(chǎn)品的合格率可達96%，再增加干燥時間對產(chǎn)品的收率影響不大，因此確定24 h為總干燥時間。

2.4 凍干產(chǎn)品的表征

2.4.1 粒徑 取表柔比星長循環(huán)凍干脂質(zhì)體凍干前后產(chǎn)品(凍干制劑用注射用水復溶后稀釋適當倍數(shù)，備用)，COULTER LS230粒徑分析儀測定其粒徑及粒度分布。見圖1。

表5 凍干時間對產(chǎn)品的影響Tab.5 Effect of freeze-drying time on the product

圖1 表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前樣品(A)和凍干后樣品(B)的粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of long-circulation epirubicin liposomes samples before(A)and after(B)freezedrying

結果表明表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前后粒徑分別為128和137 nm，均為單峰分布，凍干復溶后長循環(huán)脂質(zhì)體的粒徑及分布范圍變化不大。

2.4.2 透射電鏡 取表柔比星脂質(zhì)體混懸液與凍干后樣品溶解并適當稀釋后，用質(zhì)量分數(shù)1%磷鎢酸負染，于透射電鏡下觀察形態(tài)，見圖2。

圖2 表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前樣品(A)和凍干后樣品(B)的透射電鏡圖(×40 000)Fig.2 Transmission electron microscopy oflongcirculation epirubicin liposomes samples before(A)and after(B)freeze-drying(×40 000)

由透射電鏡照片可見，脂質(zhì)體呈球形或橢球形，凍干前后外觀基本無變化，脂質(zhì)體之間沒有相互粘連聚集現(xiàn)象。

2.4.3 Zeta電位 分別取表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前及凍干后產(chǎn)品，用BECKMAN公司的COULTER DELSA440 SX Zeta電位及粒徑測定儀測定其Zeta電位。結果表明表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前后的Zeta電位分別為－35.3 mV和－28.9 mV，復溶后長循環(huán)脂質(zhì)體的Zeta電位變化相對不大(圖3)。

圖3 表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前樣品(A)和凍干后樣品(B)的Zeta電位分布Fig.3 Zeta potential of long-circulation epirubicin liposomes samples before(A)and after(B)freeze-drying

2.4.4 包封率 分別取表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)凍干前后的制劑，顯微鏡鏡檢均未見聚集的大粒子，按照包封率測定方法測定3批樣品，結果見表6。表明表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前后包封率無明顯變化。

表6 表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)凍干前后樣品包封率測定結果Tab.6 Entrapment rate of long－ circulation epirubicin liposomes samples before(A)and after(B)freeze-drying%

2.4.5 含量 分別取表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前后樣品各一支(其中凍干制劑用水2mL振搖復溶，備用)，完全轉(zhuǎn)移至10mL量瓶加入適量甲醇破乳，用水稀釋至刻度，精密量取1mL所得混懸液，用水定量稀釋至10mL得透明澄清溶液，所得樣品溶液注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，按照外標法計算含量，分別測定3批樣品的含量。結果表明表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體凍干前后樣品的平均含量分別為1.97 mg·mL－1，1.98 mg·mL－1。由結果可知，凍干后藥物含量無明顯變化，凍干工藝不影響制劑含量。

2.4.6 與葡萄糖注射液的配伍穩(wěn)定性 凍干脂質(zhì)體應采用一定的介質(zhì)稀釋以滿足臨床應用，常用的臨床使用方法為采用5%葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注，故本實驗考察了表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體與5%葡萄糖注射液的配伍穩(wěn)定性，并以表柔比星普通脂質(zhì)體作為對照。取表柔比星普通及長循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉各5支，復溶后分別加入5倍量5%葡萄糖注射液，室溫25℃放置，分別于0，1，2，4，6 h 取樣，測定含量及包封率變化情況。結果表明6 h內(nèi)兩種脂質(zhì)體包封率均無明顯變化。兩種脂質(zhì)體藥物含量在配伍6 h后分別為99.78%和98.96%，含量無明顯變化。見圖4。

2.4.7 凍干脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察 以外觀、再分散性、藥物含量、包封率、粒徑為指標考察表柔比星凍干脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

外觀評定標準:桔紅色，無結塊，記作(－);桔紅色，變粘，記作(+);暗紫色，萎縮變粘，記作(++)。

粒徑評價方法:10×100倍油鏡下觀察多個視野，粗略觀察脂質(zhì)體的粒徑變化。

評價標準:視野均一，無粒徑 ＞1 μm粒子記作(－);視野基本均一，有粒徑＞1 μm的粒子，但不聚集記作(+);粒徑 ＞1 μm，有聚集(++)。

取3批凍干表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體，充氮加蓋密封，按照2010年版《中華人民共和國藥典》附錄XIX原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性實驗指導原則中的規(guī)定，選擇加速條件為(25±2)℃，相對濕度(60±10)%，定期取樣考察，結果見表7。

圖4 表柔比星長循環(huán)脂質(zhì)體及普通脂質(zhì)體與葡萄糖注射液的配伍結果Fig.4 The compatibility of epirubicin conventional liposome and long-circulation liposome with glucose injection

表7 表柔比星凍干脂質(zhì)體的加速穩(wěn)定性考察Tab.7 Accelerating stability teston lyophilized epirubicin liposomes

穩(wěn)定性結果表明，脂質(zhì)體的凍干粉在溫度(25±2)℃、相對濕度(60±10)%的條件下分別放置3個月比較穩(wěn)定。

3 討論

凍干是提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的一個有效途徑。然而，冷凍和干燥過程都會引起脂質(zhì)體結構和功能的破壞。當脂質(zhì)體被冷凍時，冰核的形成首先在脂質(zhì)體的外水相，然后無規(guī)則地形成冰晶，而后內(nèi)水相形成冰晶，這樣造成了外水相溶質(zhì)濃度的升高。因此當冰晶在外水相一旦生成，雙分子膜內(nèi)外的滲透壓隨之產(chǎn)生。結晶的形成和滲透壓的產(chǎn)生同時對脂質(zhì)體膜造成了嚴重的機械破壞，最后導致脂質(zhì)體膜破裂，失去原來的完整結構。脂質(zhì)膜的破裂可能由于滲透壓的產(chǎn)生、冰晶對磷脂基團的粘附力、溶解于脂質(zhì)體內(nèi)的氣體聚集成氣泡排出以及磷脂的相變溫度轉(zhuǎn)變。

文獻中測得當濃度為15%時葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度分別為－38.5、－32.4、－30.4、－29.2℃，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較低時，得到的凍干品常出現(xiàn)明顯的藥物滲漏［11］。海藻糖為非還原性二糖，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較高，可以使脂質(zhì)體在完全脫水時保持完整形態(tài)，本研究中海藻糖對表柔比星脂質(zhì)體保護作用顯著優(yōu)于其他保護劑，故選擇海藻糖單用作為凍干保護劑。在冷凍干燥過程中，如果溫度高于藥品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，藥品的黏度會迅速降低，導致表面萎縮，發(fā)生塌陷現(xiàn)象。

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