n-3PUFA對不同飲食大鼠體重、hs-CPR及凝血功能的影響

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（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001；3.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣西南寧 530021）

n-3多不飽和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fattyacids，n-3 PUFA）是指第一個雙鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端第3位的多雙鍵不飽和脂肪酸，主要的n-3 PUFA包括 α-亞麻酸（α-linolenic aicd，ALA），二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。目前保健食品市場上常見的n-3 PUFA有來源于深海魚類脂肪的深海魚油（主要含有EPA和DHA），和來源于植物種子油脂的ALA。不少研究報道表明[1-3]，n-3 PUFA能降低糖尿病患者血清低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平，對心血管疾病、糖尿病等患者有輔助治療效果。有代謝研究報道表明，ALA在體內(nèi)約有10%～20%被轉(zhuǎn)換成EPA和DHA[4]。雖然ALA在體內(nèi)代謝可生成EPA和DHA從而發(fā)揮類似深海魚油的作用，但是其作用效果和機制目前研究還不夠透徹。目前尚無n-3 PUFA對動物超敏C-反應(yīng)蛋白（high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）和凝血功能影響的研究報道。

本實驗研究設(shè)計用普通飼料喂養(yǎng)SD大鼠模擬正常飲食人群，用高糖高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠模擬高糖高脂飲食人群，同時分別灌胃給予高、中、低3個劑量的ALA和深海魚油。每7天稱量1次體重，56 d后取血測量hs-CRP和凝血4項，用以考察兩者對不同飼料喂養(yǎng)下健康大鼠體重、hs-CRP和凝血功能的影響，從而為不同飲食結(jié)構(gòu)人群是否需要補充此類n-3 PUFA提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級健康的6周齡SD大鼠，體重（140±20）g（由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK桂2009-0002），飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物房：室溫（25±2）℃、相對濕度（55±5）%，12/12 h光照，自由獲取食物和飲水。

2.2 材料與儀器

α-亞麻酸（General Nutrition Corporation，批號：1836CM2668），深海魚油（General Nutrition Corporation，批號：E67562），無水乙醇（分析純），hs-CRP 測定試劑盒：長春匯力生物技術(shù)有限公司，批號：13012；凝血四項測定試劑盒：上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號：13023；ST16 型離心機：Sorvall公司；7600 型全自動生化儀：日本Hitachi公司；CA1500全自動血凝儀：日本Sys-mex公司。

1.2 方法

1.2.1 飼料配制

飼料配制由廣西中醫(yī)藥研究院實驗動物中心完成，普通飼料采用清潔級大鼠維持飼料。高糖高脂飼料的配制處方：基礎(chǔ)飼料粉末（63.8%），蔗糖（20%），豬油（10%），蛋黃粉（5%），膽固醇（1%），膽酸鈉（0.2%）。

1.2.2 ALA和深海魚油灌胃液的配制

別將ALA和深海魚油軟膠囊剪破，并將其中的內(nèi)容物擠出，用1%的乙醇溶液配成濃度分別為60、30和15 mg/mL的溶液，搖勻后小劑量分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動物分組

大鼠適應(yīng)性靜養(yǎng)3d～4d后，隨機分為14組，每組10只，雌雄各半，分別分為：空白對照組（普通飼料喂養(yǎng)），高糖高脂對照組（高糖高脂飼料喂養(yǎng)）；普通飼料喂養(yǎng)的ALA高、中、低劑量組，普通飼料喂養(yǎng)的深海魚油高、中、低劑量組；高糖高脂飼料喂養(yǎng)的ALA高、中、低劑量組，高糖高脂飼料喂養(yǎng)的深海魚油高、中、低劑量組。

1.2.4 給藥處理

根據(jù)上述分組情況將大鼠給予不同的飼料喂養(yǎng)，并每天按10 mL/kg的劑量灌胃相應(yīng)的溶液一次。其中，空白對照組和高糖高脂對照組分別灌胃1%乙醇溶液，ALA高中低劑量組分別灌胃600、300和150 mg/kg的ALA，深海魚油高中低劑量組分別灌胃600、300和150 mg/kg的深海魚油。每7天稱量一次各只老鼠的體重，根據(jù)體重調(diào)節(jié)灌胃體積，一共連續(xù)灌胃56 d。末次灌胃后當日晚禁食不禁水12 h，次日晨將大鼠用10%水合氯醛以3 mL/kg的劑量腹腔注射麻醉后，用一次性采樣針進行腹腔主動脈取血，先取1.6 mL全血加入抗凝試管（已精密加入枸櫞酸鈉溶液（0.109 mol/L）0.2 mL的一次性采血管）中，迅速混勻；剩余全血加入普通采血試管中。將抗凝試管置離心機離心15 min（3 000r/min），分離血清，6h內(nèi)測定凝血四項；將普通采血試管靜置1 h后，置離心機離心10 min（30 00 r/min），分離血清，測定hs-CRP。

1.2.5 體重測定

灌胃前一天（0 d），14組大鼠分別稱重，記錄體重。給藥處理期間，每7天稱重1次，觀察大鼠體重變化。

1.2.6 超敏C反應(yīng)蛋白的測定

采用全自動血生化儀，參照試劑盒說明書進行測定。

1.2.7 凝血四項的測定

采用全自動血凝儀，按照試劑盒說明書測定凝血酶原時間（prothrombintime，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時間（thrombintime，TT）和纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性意義，P＜0.01為有極顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗動物的一般情況

實驗過程中，用高糖高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠因一時無法適應(yīng)新的飼料，實驗開始前3周的食量明顯比用普通飼料喂養(yǎng)的大鼠要小，但第21天以后食量逐漸恢復(fù)正常，體重迅速增加。各組大鼠均無腹瀉現(xiàn)象發(fā)生，但是灌胃ALA和深海魚油的大鼠糞便比其他組大鼠油和軟。各組大鼠的其他生理狀態(tài)如活動、磨牙、毛色等總體一致。由于整個實驗過程歷時較長（8周，56 d），在某次灌胃的過程中有可能產(chǎn)生導(dǎo)致動物死亡的因素發(fā)生（例如灌胃操作失誤使灌胃液流到大鼠肺部，導(dǎo)致大鼠肺部感染而死亡），因此有9個實驗組出現(xiàn)了大鼠死亡的情況。因為每組大鼠的死亡個數(shù)沒有超過1個，所以對整體實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析不會產(chǎn)生影響。

2.2 n-3 PUFA對大鼠體重的影響

實驗開始前，各組大鼠的體重無顯著性差異。實驗開始前21天，用高糖高脂飼料喂養(yǎng)的各組大鼠由于食量下降，體重增長速率普遍比用普通飼料喂養(yǎng)的各組大鼠低（P＜0.01）。從第21天開始，大鼠逐漸適應(yīng)了新的飼料，食量逐漸恢復(fù)正常，而且由于高糖高脂飼料所含熱量比普通飼料高，大鼠體重迅速增加。到第56天，所有用高糖高脂飼料喂養(yǎng)各組大鼠的體重均趕上甚至超過所有用普通飼料喂養(yǎng)大鼠的體重，結(jié)果見圖1-4。

在用普通飼料喂養(yǎng)的大鼠中，灌胃了n-3 PUFA的各組大鼠，從第21天開始，體重都比空白對照組大鼠的體重增速要快。其中，灌胃深海魚油的各組大鼠體重比灌胃ALA的各組大鼠增速更快，并且深海魚油各劑量組間的體重增長還存在一定的量效關(guān)系，以高劑量組的體重增速最快，最終體重甚至超過高糖高脂飼料對照組大鼠的體重。結(jié)果見圖1和圖3。

圖1 ALA對普通飼料喂養(yǎng)大鼠體重的影響Fig.1 Effect of ALA on rats'weight when the rats were fed by normal diet

圖2 ALA對高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重的影響Fig.2 Effect of ALA on rats'weight when the rats were fed by sucrose and fat rich diet

圖3 深海魚油對普通飼料喂養(yǎng)大鼠體重的影響Fig.3 Effect of deep-sea fish oil on rats'weight when the rats were fed by normal diet

圖4 深海魚油對高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重的影響Fig.4 Effect of deep-sea fish oil on rats'weight when the rats were fed by sucrose and fat rich diet

在用高糖高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠中，灌胃了n-3 PUFA的各組大鼠的體重增長曲線和高糖高脂對照組大鼠相似。結(jié)果見圖2和圖4。

2.3 n-3 PUFA對大鼠超敏C-反應(yīng)蛋白及凝血四項的影響

和空白對照組相比，所有用普通飼料喂養(yǎng)大鼠的hs-CRP，都無顯著性差別；所有用高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的hs-CRP都有升高的趨勢，其中灌胃深海魚油大鼠的hs-CRP顯著性升高（P＜0.01）。和高糖高脂對照組相比，用高糖高脂喂養(yǎng)并灌胃深海魚油大鼠的hs-CRP也顯著性升高（P＜0.01）。結(jié)果提示：高糖高脂飼料喂養(yǎng)能使大鼠的hs-CRP有升高的趨勢，一旦深海魚油和高糖高脂飼料同時攝入會導(dǎo)致大鼠hs-CRP顯著性升高。結(jié)果見表1。

表1 n-3 PUFA對大鼠超敏C-反應(yīng)蛋白及凝血四項影響（x±s）Table 1 The effect of n-3 PUFA on hs-CRP and four projects of blood coagulation（x±s）

各實驗組之間的PT和TT沒有顯著性差異。和空白對照組相比，所有用高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的FIB極顯著性升高（P＜0.05），并且灌胃n-3 PUFA對FIB并無影響。和空白對照組相比，高糖高脂對照組的APTT有降低的趨勢但無顯著性意義；用高糖高脂喂養(yǎng)并灌胃深海魚油大鼠的APTT降低有顯著性意義（P＜0.05）。結(jié)果提示：深海魚油和高糖高脂飼料的同時攝入會導(dǎo)致大鼠APTT顯著性降低。結(jié)果見表1

3 討論

在已有的臨床研究報道中，n-3 PUFA的服用劑量范圍非常廣，從400 mg/d至16.2 g/d不等，對人類最有效的口服劑量目前還在研究當中[5-8]。本實驗研究所用灌胃劑量是在參考了已報道的臨床研究使用劑量，并結(jié)合GNC公司深海魚油和ALA產(chǎn)品說明書的推薦劑量，最后選擇了一個比較適中的臨床使用劑量范圍，并通過體表面積法換算得到大鼠的灌胃劑量。

結(jié)果表明，灌胃56 d n-3 PUFA能使普通飼料喂養(yǎng)大鼠的體重明顯增加，其中深海魚油高劑量組體重增加的效果和用高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠導(dǎo)致的體重增加相當。結(jié)果提示：長期大量服用n-3 PUFA容易導(dǎo)致正常飲食人群發(fā)生肥胖，不應(yīng)長期盲目過量服用該類保健品。

在本實驗研究的灌胃劑量下，ALA灌胃56 d對兩種飼料喂養(yǎng)大鼠的hs-CRP以及凝血四項都沒有影響。目前，對ALA的研究較少，而且由于動物實驗的給藥劑量差別很大，使實驗結(jié)果存在很大的不一致性。給藥劑量不足，會導(dǎo)致實驗結(jié)果沒有顯著性差異。但是如果給藥劑量過大，對ALA的有效性評價也必須審慎給出結(jié)論。因為ALA在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)換成EPA和DHA，在高劑量給藥時，ALA顯現(xiàn)出的效果是其本身作用產(chǎn)生的、還是由于轉(zhuǎn)換成EPA和DHA而產(chǎn)生的，還有待商榷。另外一方面，過量的給藥劑量即使顯現(xiàn)一定的療效，但在臨床也不具備應(yīng)用價值。目前，一種先進的小鼠模型已經(jīng)被研制出來[9]，其可以抑制ALA在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成EPA和DHA，這種小鼠模型將非常有助于正確評估ALA的療效。

在本實驗研究中，所有用高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的FIB都比空白對照組顯著升高，證明高糖高脂飼料能使機體處于高凝狀態(tài)；深海魚油對普通飼料喂養(yǎng)大鼠的hs-CRP以及凝血四項都沒有影響，但是對高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的hs-CRP有顯著性升高的影響，同時顯著性降低APTT。hs-CRP是一種由細胞因子如IL-6、TNF-a等誘導(dǎo)的急性時相反應(yīng)蛋白，是反應(yīng)進行性炎癥的敏感標志物。有臨床研究報道[10-12]表明，2型糖尿病患者以及糖尿病腎病患者的hs-CRP顯著升高，認為hs-CRP作為一個重要的篩選指標，對于預(yù)測2型糖尿病患者并發(fā)動脈粥樣硬化具有積極意義。APTT是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較敏感和常用的篩選指標，F(xiàn)IB則是參與動脈粥樣硬化形成的主要前體物質(zhì)。另有臨床研究報道[13-15]表明，2型糖尿病患者的PT和APTT均有明顯的下降，而FIB則明顯升高。本實驗結(jié)果表明，大鼠同時攝入深海魚油和富含飽和脂肪酸的高糖高脂飼料，會誘發(fā)機體進行性炎癥，同時使機體處于高凝狀態(tài)，易導(dǎo)致內(nèi)源性凝血的發(fā)生，這種作用否也預(yù)示著胰島素抵抗的增加，還有待于進一步研究確證。根據(jù)實驗結(jié)果可以推測，長期高糖高脂飲食人群并不適宜補充深海魚油，深海魚油對高血脂及糖尿病患者的輔助治療效果應(yīng)是在杜絕高糖高脂飲食的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。

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