南極磷蝦中氟含量的兩種測定方法優(yōu)化與比較

，3，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所食品工程與營養(yǎng)研究室，山東青島 266071；3.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

南極磷蝦（Euphausia superba Dana），資源蘊藏量巨大，據(jù)估計在6.5億t～10億t，是可供人類利用的海洋動物資源中蘊藏量最為豐富的一種，也是人類重要的后備蛋白庫[1]。南極磷蝦營養(yǎng)豐富，除富含蛋白質(zhì)、必需氨基酸和亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸外，還含有鈣、鉀、鎂、鍶等多種礦物質(zhì)元素，開發(fā)潛力巨大[2-4]。目前已有20多個國家正在進行南極磷蝦加工工藝及生物活性物質(zhì)提取的研究，其研究熱點集中于南極磷蝦原料的保鮮、生物活性物質(zhì)的提取、蝦油、蝦膏及蝦糜的加工工藝等[5]，但高氟含量成為開發(fā)利用的“瓶頸”。

氟是非金屬中最活潑的元素，氧化能力很強，可以同絕大部分非金屬元素和金屬元素反應(yīng)，生成氟化物。適量的氟是人體所必需的，可以與牙齒鈣質(zhì)生成不溶于水的氟化鈣，預(yù)防齲齒。過量的氟對機體的多種組織器官及系統(tǒng)均有影響，會引起氟斑牙、氟骨癥[6]。氟化物可以通過生物鏈蓄積進入人體[7]，主要積聚在骨組織（骨骼和牙齒）中[8]。世界衛(wèi)生組織（WHO）提出，人均每天適宜的氟攝入量ADI值為2.5 mg～4.0 mg。國標（GB/T 5009.18-2003）《食品中氟的測定》中規(guī)定了食品中氟的三種測定方法，分別為擴散-氟試劑比色法、灰化蒸餾-氟試劑比色（ADFRC）法和離子選擇電極（ISE）法[9]。谷類、果蔬、肉類、蛋類及豆制品等食品的氟含量低于5 mg/kg，南極磷蝦整蝦的氟含量可達1 300 mg/kg～2 400 mg/kg（干重計）[3]。因此，探討國標中3種方法是否適用于南極磷蝦中氟含量的測定具有重要意義。擴散-氟試劑比色法的方法檢出限為0.10 mg/kg，所用的塑料擴散盒不易購買，樣品前處理較為繁瑣，檢測分析周期為24 h～30 h，檢測范圍0.10 mg/kg～1.00 mg/kg，不適于測定高氟含量的南極磷蝦樣品。本文比較并優(yōu)化了ADFRC法和ISE法檢測南極磷蝦中氟含量的操作條件，采用精密度和t檢驗比較兩種方法檢測結(jié)果的差異性，旨在篩選出適宜檢測高氟含量南極磷蝦樣品的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

南極磷蝦由遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司提供，-20℃冰柜中儲藏。

蝦膏、蝦糜及蝦醬均由實驗室加工制作，蝦膏和蝦糜于-20℃冰柜中儲藏，蝦醬于-4℃冰柜中儲藏。

蝦糜的加工工藝：南極磷蝦→篩分→漂洗→瀝水→脫殼采肉→裝盤、稱重→速凍→脫盤、包冰→包裝、冷藏

蝦膏的加工工藝：南極磷蝦→篩分→漂洗→瀝水→脫殼采肉→酶解→分離→濃縮→調(diào)味殺菌→成品包裝

蝦醬的加工工藝：南極磷蝦→篩分→漂洗→瀝水→脫殼采肉→發(fā)酵→分離→濃縮→調(diào)味殺菌→成品包裝

1.2 試驗試劑

氟標準溶液，茜素氨羧絡(luò)合劑（氟試劑），硝酸鑭溶液，丙酮，緩沖液（pH4.7），硝酸鎂溶液（100 g/L），氫氧化鈉溶液（100 g/L），乙酸溶液（1 mol/L），酚酞-乙醇指示液（10 g/L），硫酸（2+1），鹽酸溶液（1+11），總離子強度緩沖溶液（TISAB）。

所用試劑均為A.R級，依照GB/T 5009.18-2003《食品中氟的測定》配制。所用水均為雙蒸水。

1.3 儀器與設(shè)備

UNICO UV-2000型紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；雷磁PHS-3C離子計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；氟離子選擇電極PF-1-01型：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；甘汞電極232型：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；分析天平：賽多利斯BSA型；pH計STARTER 3C：奧豪斯儀器有限公司；九陽料理機JYL-C020：九陽股份有限公司；快速混勻器SZ-1型：江蘇金城國勝實驗儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱101-1AB型：天津市泰斯特儀器有限公司；磁力攪拌器78-1型：常州國華電器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 ADFRC法

取100 g左右的南極磷蝦鮮樣，絞肉機攪碎。稱取5.00 g左右南極磷蝦樣品于30 mL坩堝中，加5.0 mL硝酸鎂溶液（100 g/L）和 0.5 mL氫氧化鈉溶液（100 g/L），混勻后浸泡30 min，烘箱中105℃蒸干，低溫炭化，550℃灰化6 h，干燥器中冷卻。按國標GB/T 5009.18-2003《食品中氟的測定》9.3規(guī)定蒸餾，9.4規(guī)定測定。

1.4.2 ISE法

稱取2.00 g左右南極磷蝦樣品，置于50 mL刻度管中，加入10 mL鹽酸溶液，組織混勻機混勻（避免樣品粘在瓶壁上），密閉浸提1 h，加入25 mLTISAB，再加水定容，混勻。氟離子選擇電極和甘汞電極與測量儀器相連接。電極插入盛有雙蒸水的50 mL塑料燒杯中，塑料燒杯中放有與其配套的磁力攪拌子，在電磁攪拌中，讀取平衡電位值，更換2次～3次水后，待電位值平衡后，一般回升到360 mV以上，即可進行樣液與標準液的電位測定。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析

分別用兩種方法測定南極磷蝦中的氟含量，每次3個平行，重復(fù)2次，結(jié)果以平均值X、標準偏差SD及相對標準偏差RSD表示，采用SPSS17.0進行配對樣品的t檢驗分析，若概率P＜0.05，則差異顯著；若P＞0.05，則差異不顯著。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 ADFRC法的檢測條件優(yōu)化

2.1.1 最適波長的確定

以未加氟標準使用液蒸餾得到的餾出液為空白，測定 1.0 μg/10 mL 氟標準使用液在 550、560、570、580、590、600、610、620 nm 下的吸光度，結(jié)果顯示波長在560 nm～590 nm之間，吸光度穩(wěn)定，且在580 nm條件下，示數(shù)最快達到穩(wěn)定。波長越大，吸光度值越小。雖然在550 nm吸光度較大，但是結(jié)果不穩(wěn)定，有較大波動。確定波長580 nm為ADFRC法的測定波長。

圖1 波長對吸光度的影響Fig.1 Effect of wavelength on the absorbance

2.1.2 樣品稀釋倍數(shù)對吸光度的影響

按照國標GB/T 5009.18-2003規(guī)定，以氟濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。氟濃度為0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/10mL，得到標準曲線 Y=0.012X+0.007 4，R2=0.995 2，線性范圍較窄 0.1 mg/kg～2.0 mg/kg。樣品經(jīng)灰化蒸餾，得到蒸餾原液，其吸光度不在標準曲線線性范圍內(nèi)，需對樣品原液進行稀釋。樣品原液稀釋10倍、25倍、50倍，測樣品吸光度，計算南極磷蝦氟含量（以濕基計），每組實驗三次平行，見表1。

結(jié)果顯示，稀釋25倍的樣品濃度氟含量測定結(jié)果準確，后續(xù)試驗選擇樣品餾出液稀釋25倍。

表1 樣品稀釋倍數(shù)對吸光度的影響Table 1 Effect of sample dilution multiple on the absorbance

2.2 ISE法的檢測條件優(yōu)化

2.2.1 取樣量及加酸量

采用國標ISE法測定2012年南極磷蝦整蝦的氟含量（以濕基計），結(jié)果見表2中A組數(shù)據(jù)，南極磷蝦整蝦的氟含量X為312.43 mg/kg，SD為10.622 3，樣品平行性不好，需對取樣量及加酸量進行優(yōu)化。以取樣量和加酸量作為變化參數(shù)，分別設(shè)置取樣1、2、3 g，鹽酸體積10、15、20 mL，得到九種試驗組合，每組三次平行，研究取樣量和加酸量對ISE檢測方法的影響。

表2 取樣量及加酸量的選擇Table 2 Selection of sampling quantity and hydrochloric acid volume

樣品測定時，必須用TISAB調(diào)節(jié)pH在5～6之間，以消除與氟離子形成絡(luò)合物的鐵、鋁及硅酸根等干擾離子及酸度的影響。當添加鹽酸20 mL，TISAB 25 mL，定容50 mL時，測定待測液的pH在5.0～5.2之間。當鹽酸體積超過20 mL時，待測液的pH低于5.0，因此設(shè)定鹽酸最大添加量為20 mL。結(jié)果顯示（見表2），A、B、C三組樣品平行性不好，D、E、F、G、H、I六組樣品平行性均較好，測定結(jié)果均在310.18±4.075 4左右。由于南極磷蝦氟含量分布不均，加大取樣量可以提高樣品的代表性，綜合取樣量與加酸量的檢測結(jié)果，確定取樣2 g，添加鹽酸10 mL，TISAB25 mL，進行后續(xù)試驗。

2.2.2 標準曲線

比較國標ISE法和標準溶液添加法的標準曲線。標準溶液添加法的標準曲線：加10 mL鹽酸，25 mL TISAB，定容到 50 mL，此標準液氟濃度為 0 μg/mL；連續(xù)添加 100、200、200、200、100 μL 的 1.0 mg/mL 氟標準溶液得到濃度為 1.996 0、5.964 2、9.901 0、13.806 7、15.748 0 μg/mL的氟標準液；以電極電位為縱坐標，氟標準液濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。分別用兩種方法的標準曲線計算2012年南極磷蝦整蝦的氟含量（以濕基計），按照2.2.1優(yōu)化的取樣量和加酸條件進行樣品測定，樣品三次平行，結(jié)果見表3。

表3 標準曲線Table 3 Standard curves of two methods

采用國標法與標準溶液添加法分別繪制標準曲線，得到的曲線方程沒有顯著差別，均具有良好的線性相關(guān)性（R2＞0.999）。南極磷蝦氟含量，國標法測定結(jié)果（308.78±2.588 7）mg/kg，RSD 為 0.838 4；標準溶液添加法測定結(jié)果（304.47±2.651 7）mg/kg，RSD 為 0.870 9。與國標方法相比，采用標準溶液添加法，操作簡單，節(jié)省時間及試劑，同時也減小誤差，因此確定采用標準溶液添加法繪制標準曲線。

2.3 兩種方法測定結(jié)果差異性分析

分別采用優(yōu)化后的ADFRC法和ISE法測定2012年南極磷蝦中的氟含量（以濕基計）。取3個樣，每組6次平行，見表4。

表4 兩種測定方法的精密度比較Table 4 Precision comparison of the two methodsmg/kg

結(jié)果顯示，ADFRC法測定樣品氟含量306.63mg/kg～311.73 mg/kg，ISE法測定樣品氟含量304.93 mg/kg～306.64 mg/kg，數(shù)據(jù)均在（306.62±2.620 2）mg/kg。兩種方法相比，ADFRC法SD較大，RSD在5.9879%～9.2794%之間，樣品平行性不好；ISE法SD較小，RSD在0.4123%～0.903 1%之間，樣品平行性較好。

2號樣品的氟含量在三組樣品的測定結(jié)果中標準差及相對標準偏差均居中，取其測定結(jié)果進行配對樣品 t檢驗，見表 5、6。

表5 兩種測定方法的結(jié)果比較Table 5 Comparison of the results of two methods mg/kg

表6 配對樣品t檢驗Table 6 Paired t-test of samples

結(jié)果顯示，雙尾概率P=0.681大于0.05，表明兩種方法測定南極磷蝦整蝦的氟含量不存在顯著性差異。結(jié)合表5，ISE法的SD值（2.507 3）明顯低于ADFRC法的SD值（20.071 4），表明ISE法的樣品平行性較好，因此確定采用ISE法測定南極磷蝦制品中的氟含量。

2.4 南極磷蝦及其制品中氟含量的測定

采用ISE法測定2012年南極磷蝦各部位及其制品中的氟含量，見表7。

表7 南極磷蝦及其制品中氟含量（濕重）Table 7 Fluorine content of Antarctic krill and its products（wet weight） mg/kg

結(jié)果顯示，南極磷蝦中的氟含量的分布具有甲殼＞頭部＞肌肉的變化特征，與文獻報道一致[10]。蝦膏及蝦醬加工過程中去掉蝦頭，蝦糜加工不去蝦頭，致使蝦膏及蝦醬中氟含量低于蝦糜。在加工過程中去掉甲殼及頭部可降低南極磷蝦制品中的氟含量。

3 結(jié)論

本文分別對兩種方法的檢測條件進行優(yōu)化，確定ADFRC法的測定波長為580 nm，樣品餾出液稀釋25倍測定樣品中氟含量；確定ISE法取樣2g，加鹽酸10mL，浸提1 h，加TISAB 25 mL，定至50 mL，采用標準溶液添加法繪制標準曲線，測定樣品中氟含量。兩種測定方法相比，ADFRC法操作復(fù)雜繁瑣，需配制硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、硝酸鑭、茜素氨羧絡(luò)合劑等大量試劑，樣品經(jīng)前處理后和系列氟標準都需逐一蒸餾，費時費力，對操作人員要求相對較高，不適宜大批樣品的測定[11]；ISE法只需配制總離子強度緩沖液和鹽酸溶液，操作簡便省時，適合大批量樣品的快速測定。ADFRC法的檢出限是 0.10 μg/mL[9]，ISE 法的檢出限 0.02μg/mL[12]。與ADFRC法相比，ISE法樣品平行性好，檢測范圍更寬，可以測定水、血液及尿中氟含量（1.0 μg/mL），也可測定南極磷蝦干粉中氟含量（2 518.6 mg/kg）[13]。

應(yīng)用ISE法測定南極磷蝦各部位及蝦糜、蝦膏及蝦醬中氟含量。結(jié)果顯示，南極磷蝦各部位中氟含量的分布具有甲殼>頭部>肌肉的變化特征，在加工過程中去掉甲殼及頭部可降低南極磷蝦制品中的氟含量。

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