溫和壓力對(duì)面包酵母C I C C 1 4 4 7谷胱甘肽合成的影響

，*

（1.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江臺(tái)州 317200；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

1921年Hopkins首先發(fā)現(xiàn)了谷胱甘肽，并命名為glutathione（GSH），其化學(xué)結(jié)構(gòu)在 1930 年得到確定[1]，由L-半胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸縮合而成[2]。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑，能減少氧化劑對(duì)巰基的破壞作用，保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)不被氧化[3]。谷胱甘肽不僅具有解毒作用，而且可以作為功能性食品添加劑[4]，在肉制品中添加GSH可以強(qiáng)化風(fēng)味，添加到水果罐頭中可以防止色素沉積等[5]。

壓力對(duì)細(xì)胞代謝的影響已有相關(guān)報(bào)道[6-7]。壓力一方面影響微生物酶促反應(yīng)進(jìn)而使微生物細(xì)胞代謝發(fā)生改變，另一方面壓力會(huì)影響微生物基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而改變微生物細(xì)胞的代謝[8]。壓力大小和保壓時(shí)間、加壓前培養(yǎng)時(shí)間、升降壓速率、培養(yǎng)基成分、溫度、pH等[9-11]壓力作用條件都會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生一定的影響。本文研究了溫和壓力（0.1 MPa～5.0 MPa）對(duì)面包酵母CICC1447生物合成GSH的影響，得到最優(yōu)加壓條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1447由工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)）保藏；四氧嘧啶ALLOXAN（分析純）購(gòu)自Sigma公司；GSH標(biāo)品（色譜純）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HA-X型高壓反應(yīng)設(shè)備：海安縣石油科研儀器廠；CR22G II高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；FACSC alibur型流式細(xì)胞儀：美國(guó)碧迪公司；752型紫外光柵分光光度計(jì)：上海精密儀器科學(xué)技術(shù)有限公司；SCIENTZ—ⅡD超聲波破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

從保藏斜面上挑取1～2環(huán)菌體，接入YEPD種子培養(yǎng)基中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)16 h～24 h后，再以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基（酵母膏5 g/L、葡萄糖 30 g/L、硫酸鎂 1.5 g/L、硫酸銨 5 g/L、硫酸鉀3.6 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、硫酸錳0.008 g/L，硫酸亞鐵0.008 g/L、pH 6.0[12]），進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。500 mL三角瓶中裝液量為100mL、30℃、150r/min培養(yǎng)20h后轉(zhuǎn)入高壓反應(yīng)釜進(jìn)行加壓發(fā)酵，同時(shí)以常壓發(fā)酵作為對(duì)照。

1.3.2 GSH質(zhì)量濃度測(cè)定

利用溫差破碎法提取GSH，采用四氧嘧啶法進(jìn)行GSH質(zhì)量濃度測(cè)定[13]。

1.3.3 菌體量的測(cè)定

采用烘干恒重法測(cè)定菌體量[14]。

1.3.4 細(xì)胞存活率及活細(xì)胞數(shù)的計(jì)算方法

采用美蘭染色并用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.3.5 染色劑與胞內(nèi)DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度測(cè)定

參照肖安風(fēng)等人的方法用生理鹽水懸浮離心收集的酵母細(xì)胞[16]，制成約1×107cells/mL的細(xì)胞懸液，在500 μL 細(xì)胞懸液中加入 75 μg碘化丙啶（PI），避光反應(yīng)5 min。將染色好的樣品放入流式細(xì)胞儀，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，使用660/16nm帶通濾片檢測(cè)PI熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 常壓發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為了研究溫和壓力對(duì)面包酵母谷胱甘肽生物合成能力的影響，對(duì)面包酵母進(jìn)行常壓發(fā)酵試驗(yàn)，作為對(duì)照見圖1。

由圖1可知，發(fā)酵27 h時(shí)菌體量達(dá)到最大，同時(shí)GSH質(zhì)量濃度也達(dá)到最大36.67 mg/L。27 h時(shí)后GSH與菌體量同時(shí)下降，可能由于發(fā)生菌體自溶導(dǎo)致GSH質(zhì)量濃度降低。

圖1 面包酵母CICC1447 GSH常壓發(fā)酵曲線Fig.1 Fomentation curve of GSH under atmospheric pressure of Saccharomyces cerevisiae CICC1447

2.2 保壓時(shí)間對(duì)GSH合成的影響

以高純空氣（O2∶N2=21∶79）為加壓介質(zhì)，在發(fā)酵20 h時(shí)以0.05 MPa/min速率將壓力升到1.0 MPa，研究保壓時(shí)間對(duì)GSH生物合成量的影響，空白對(duì)照為常壓發(fā)酵見圖2。

圖2 保壓時(shí)間對(duì)面包酵母CICC1447 GSH合成的影響Fig.2 Effect of holding time on the synthesis of GSH of Saccharomyces cerevisiae CICC1447

圖3 保壓時(shí)間對(duì)面包酵母CICC1447的影響Fig.3 Effectofholdingtimeon SaccharomycescerevisiaeCICC1447

由圖2可以看出，在1.0 MPa壓力下處理時(shí)間6 h后，酵母胞內(nèi)積累GSH的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值42.86 mg/L，較常壓發(fā)酵提高了15.36%。保壓9 h的處理組GSH合成量低于保壓6 h的處理組。

由圖3可知，隨著保壓處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母菌細(xì)胞的存活率由100%（0 h）下降到85.67%（9 h），加壓6 h后菌體量也有所下降。這可能是酵母細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間受到壓力刺激后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致胞內(nèi)代謝發(fā)生變化甚至因細(xì)胞膜的破損而自溶。GSH作為應(yīng)激性反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，在菌體受到壓力刺激時(shí)，為了維持正常的代謝活動(dòng)，菌體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)開始大量積累GSH。但隨著保壓時(shí)間延長(zhǎng)，菌體存活率下降，可能部分菌體細(xì)胞破碎，從而使GSH濃度反而降低。

2.3 壓力對(duì)GSH合成量的影響

在20 h時(shí)以升降壓速率為0.05 MPa/min將壓力分別升到 0.5、1.0、1.5、2.0 MPa，選擇保壓時(shí)間 6 h 進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見圖4。

圖4 壓力對(duì)面包酵母CICC1447 GSH合成的影響Fig.4 Effect of pressure on the synthesis of GSH of Saccharomyces cerevisiae CICC1447

當(dāng)壓力為0.5 MPa時(shí)，GSH濃度較對(duì)照組提高17.03%，但隨著壓力的進(jìn)一步增加，GSH濃度開始下降，當(dāng)壓力超過(guò)1.5 MPa后，GSH濃度迅速下降。圖5證明壓力大小對(duì)面包酵母細(xì)胞存活率、菌體量的影響較大，隨著壓力的升高，當(dāng)壓力超過(guò)1.0 MPa時(shí)，酵母菌的存活率迅速下降，由0.5 MPa時(shí)的98.23%下降到2.0 MPa時(shí)的62.45%。菌體在低壓條件下，為了應(yīng)對(duì)壓力刺激，促進(jìn)了GSH的積累，但當(dāng)壓力超過(guò)菌體承受極限，代謝出現(xiàn)紊亂，使存活細(xì)胞中應(yīng)激代謝產(chǎn)物含量降低[17]，單位質(zhì)量細(xì)胞生產(chǎn)的GSH開始下降，另一方面大量細(xì)胞開始破碎，細(xì)胞總量降低，也加速了GSH產(chǎn)量的降低。因此確定0.5 MPa為酵母菌積累GSH的最佳壓力條件。

圖5 壓力對(duì)面包酵母CICC1447的影響Fig.5 Effect of pressure on Saccharomyces cerevisiae CICC1447

2.4 升降壓速率對(duì)GSH合成量的影響

在上述最優(yōu)條件下，以升降壓速率分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 MPa/min 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從圖 6 可以看出，當(dāng)升降壓速率在0.10 MPa/min以下時(shí)，升降壓速率對(duì)積累合成GSH的影響不大。但當(dāng)升降壓速率大于0.10 MPa/min時(shí)，GSH的濃度隨升降壓速率的增大而減小。升降壓速率會(huì)對(duì)細(xì)胞存活率和菌體量產(chǎn)生影響（圖7）。細(xì)胞存活率和菌體量在升降壓速率為0.05 MPa/min～0.10 MPa/min時(shí)變化不大，隨著升降壓速率提高，細(xì)胞存活率迅速下降。

圖6 升降壓速率對(duì)面包酵母CICC1447 GSH合成的影響Fig.6 Effect of pressurization and depressurization rates on the synthesis of GSH of Saccharomyces cerevisiae CICC1447

圖7 升降壓速率對(duì)面包酵母CICC1447的影響Fig.7 Effect of pressing and depressing rates on Saccharomyces cerevisiae CICC1447

升降壓速率對(duì)GSH合成影響的主要原因在于菌體對(duì)壓力變化速率的適應(yīng)能力。升降壓速率小，菌體有足夠的時(shí)間來(lái)調(diào)節(jié)以適應(yīng)壓力變化，升降壓速率過(guò)大后，菌體難以快速調(diào)節(jié)自適應(yīng)系統(tǒng)使內(nèi)外壓力平衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[18]。說(shuō)明在升降壓速率較低時(shí)酵母細(xì)胞可以通過(guò)自身調(diào)節(jié)適應(yīng)壓力變化[19]。升降壓速率的變化在影響細(xì)胞存活率及細(xì)胞量的同時(shí)，也會(huì)改變菌體產(chǎn)生的應(yīng)激性反應(yīng)，升降壓速率較低時(shí)促進(jìn)GSH的積累，當(dāng)升降壓速率過(guò)大，菌體難以快速平衡內(nèi)外壓力而破裂死亡，進(jìn)而影響了GSH的積累。

2.5 溫和壓力下PI與酵母胞內(nèi)DNA結(jié)合產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度變化

為證明壓力是否造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，將常壓下培養(yǎng)20 h的酵母CICC1447細(xì)胞于1.0 MPa、N2為加壓介質(zhì)條件下分別處理1 h和3 h，以常壓處理為對(duì)照樣，利用流式細(xì)胞術(shù)分析壓力處理樣品與對(duì)照樣品PI熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果表1。

表1 不同壓力及時(shí)間下面包酵母CICC1447熒光強(qiáng)度的比較Table 1 Comparison of fluorescence intensities of Saccharomyces cerevisiae CICC1447 cells under different pressure and time

從表1顯示常壓對(duì)照組面包酵母CICC1447細(xì)胞1 h和3 h的細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別為2.32和2.58。而在1.0 MPa下保持1 h和3 h，細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別增加至2.47和2.93，較常壓對(duì)照組分別提高了6%和13.56%。PI主要是與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光，其不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞死亡后細(xì)胞膜破損，PI可進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生熒光信號(hào)。長(zhǎng)時(shí)間壓力處理對(duì)細(xì)胞影響較大，一方面壓力處理可刺激細(xì)胞GSH產(chǎn)量的提高，但如果壓力時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而造成細(xì)胞死亡，從而降低GSH產(chǎn)量。

3 結(jié)論

以面包酵母CICC1447為研究對(duì)象，研究了不同的保壓時(shí)間、壓力、升降壓速率及加壓前培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GSH生物合成量的影響，確定了保壓時(shí)間6 h、壓力0.5 MPa、升降壓速率 0.05 MPa/min～0.10 MPa/min，GSH產(chǎn)量較常壓提高了17.21%。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，溫和壓力短時(shí)間處理可刺激細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，提高GSH產(chǎn)量，但當(dāng)較高壓力長(zhǎng)時(shí)間處理后，細(xì)胞膜破碎，細(xì)胞死亡，會(huì)降低GSH產(chǎn)量。

說(shuō)明利用加壓作為脅迫條件在一定條件下可以提高應(yīng)激產(chǎn)物GSH的生物合成能力，這對(duì)提高谷胱甘肽產(chǎn)量有一定的指導(dǎo)意義?？梢岳^續(xù)研究壓力作用下GSH合成酶系酶活的變化，以便更深入地探討加壓應(yīng)激反應(yīng)作用機(jī)理。

[1] PENNINCKX M J,ELSKENS M T.Metabolism and functions of glutathione in micro-organisms[J] .Advances in Microbial Physiology,1993,34:239-301

[2] 賈貞,王丹,游松.谷胱甘肽的研究進(jìn)展[J] .沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,26(3):238-242

[3] 袁平戈,張大志.還原型谷胱甘肽的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用[J] .藥品評(píng)價(jià),2006,3(5):385-390

[4] 劉超,袁建國(guó),李峰.谷胱甘肽國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展[J] .山東食品發(fā)酵,2010(4):7-10

[5] 周宇光,付國(guó)平,肖仔君.谷胱甘肽的生產(chǎn)和應(yīng)用研究進(jìn)展[J] .食品工業(yè)科技,2003,24(3):89-91

[6] FUMIYOSHI ABE,CHIAKI KATO,KOKI HORIKOSHI.Pressureregulated metabolism in microorganisms[J] .Trends in Microbiology,1999,7(11):447-453

[7] WELCH T J,FAREWELL A,NEIDHARDT F C,et al.Stress response of Escherichia coli induced by elevated hydrostatic pressure[J] .Journal of Bacteriology,1993,175(22):7170-7177

[8] LEE J M,GIANCHANDANI E P,PAPIN J A.Flux balance analysis in the era of metabolomics[J] .Briefings in Bioinformatics,2006,7(2):140-150

[9] 范志華.壓力對(duì)酵母菌及其產(chǎn)海藻糖的影響[D] .天津:天津科技大學(xué),2004

[10] JANKOWSKA A,REPS A,PROSZEK A,et al.Influence of the high pressure on some biochemical properties of kefir microflora(effect of HPP on kefir microflora)[J] .High Pressure Research,2003,23(1):87-92

[11] 趙波,趙文杰,顧敏,等.硫酸銨與對(duì)酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的影響[J] .中國(guó)醫(yī)學(xué)工業(yè)雜志,2009,40(3):180-182

[12] 喬長(zhǎng)晟,劉伯寧,徐旭,等.壓力作用下面包酵母胞內(nèi)谷胱甘肽和麥角固醇的變化[J] .中國(guó)生物工程雜志,2006,26(1):56-59

[13] 劉娟,王雅琴,劉剛,等.發(fā)酵液中還原型三種測(cè)定方法的改進(jìn)及其比較[J] .北京化工大學(xué)學(xué)報(bào),2004,31(3):37-38

[14] 范崇東,王淼.酵母細(xì)胞中GSH的微波輔助提取[J] .食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(4):27-31

[15] 陳娜.壓力對(duì)谷胱甘肽生物合成的影響及其分離提取工藝研究[D] .天津:天津科技大學(xué),2008

[16] 肖安風(fēng),周祥山,周利,等.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)畢赤酵母的細(xì)胞活性[J] .微生物學(xué)通報(bào),2006,33(6):22-26

[17] 喬長(zhǎng)晟,賈士儒,徐旭,等.壓力影響酵母海藻糖生成的初步研究[J] .食品科學(xué),2005,26(5):34-37

[18] 姜岷,陳可泉,蔡婷,等.超高靜壓在琥珀酸生產(chǎn)菌株選育中應(yīng)用[J] .微生物學(xué)通報(bào),2008,35(4):561-564

[19] 周曉.反復(fù)間歇真空發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母適應(yīng)性進(jìn)化的系統(tǒng)分析[D] .天津:天津大學(xué),2011

[20] 熊福星.酵母細(xì)胞酶法催化合成谷胱甘肽研究[D] .南昌:南昌大學(xué),2012

[21] 劉娟,何秀萍,王雅琴.高產(chǎn)谷胱甘肽的酵母融合菌株的選育及其培養(yǎng)條件的研究[J] .微生物學(xué)通報(bào),2003,43(1):99-103