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    黑麥冬工廠化育苗關(guān)鍵技術(shù)研究

    2014-07-18 18:24:33王華宇陳乃明何貴整陳麗文時(shí)群賴崇健
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:組織培養(yǎng)

    王華宇 陳乃明 何貴整 陳麗文 時(shí)群 賴崇健

    摘要:基于消毒成功的黑麥冬無(wú)菌組培苗,對(duì)繼代、壯苗、生根及培養(yǎng)過(guò)程中幾個(gè)重要的技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:最佳增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 4 mg/L+NAA 0.4 mg/L;最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L。增殖過(guò)程中進(jìn)行小叢芽增殖,光照強(qiáng)度設(shè)定為800~1 300 lx,可以獲得較高的增殖系數(shù)和生長(zhǎng)量;在培養(yǎng)過(guò)程中制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)組培苗進(jìn)行分級(jí),可以節(jié)省接種材料,得到一致性較好的種苗。

    關(guān)鍵詞:黑麥冬;組織培養(yǎng);工廠化育苗

    中圖分類號(hào): S688.404+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)02-0138-03

    收稿日期:2013-06-09

    基金項(xiàng)目:珍稀樹種苗木培育技術(shù)推廣項(xiàng)目(編號(hào):桂林科字[2011]第02號(hào))。

    作者簡(jiǎn)介:王華宇(1981—),男,河南南陽(yáng)人,碩士,工程師,從事植物組織培養(yǎng)和園藝栽培學(xué)研究。E-mail:hywangsky@163.com。黑麥冬(Ophiopogon planiscapus cv. Arabicus)別名黑龍,為百合科沿階草屬多年常綠簇生草本植物,是近年來(lái)引進(jìn)的新品種之一。其株高15 cm左右,葉片近黑色,狹長(zhǎng)狀,長(zhǎng) 10~15 cm,形如韭菜。黑麥冬耐寒性、抗逆性強(qiáng),是優(yōu)良的地被觀葉植物,在歐洲和北美園林應(yīng)用較多,對(duì)種苗的需求呈現(xiàn)供不應(yīng)求的局面,但在國(guó)內(nèi)目前應(yīng)用尚少。黑麥冬通常依靠分株繁殖,但由于其生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)極低,很難滿足市場(chǎng)需求。目前,關(guān)于麥冬屬植物離體快繁的研究較多[1-4],但利用組培技術(shù)進(jìn)行黑麥冬工廠化生產(chǎn)方面的技術(shù)和工藝研究尚未見報(bào)道。本研究在黑麥冬組織培養(yǎng)再生完整植株的工作基礎(chǔ)上,開展了工廠化生產(chǎn)過(guò)程中的若干關(guān)鍵技術(shù)研究,形成了一套高效的黑麥冬組培苗擴(kuò)繁工藝,實(shí)現(xiàn)了組培苗的工廠化生產(chǎn)。

    1材料與方法

    1.1材料

    以黑麥冬莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)的優(yōu)良組培苗為試驗(yàn)材料。

    1.2工廠化生產(chǎn)中的若干關(guān)鍵技術(shù)研究

    1.2.1培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)增殖培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基,生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基。(1) 增殖培養(yǎng)基:細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA協(xié)同使用時(shí),其濃度比例設(shè)為10 ∶1,具體配方如下:MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L;MS+6-BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/L;MS+6-BA 3 mg/L +NAA 0.3 mg/L;MS+6-BA 4 mg/L +NAA 0.4 mg/L;MS+6-BA 4 mg/L;MS+6-BA 5 mg/L +NAA 0.5 mg/L;MS+6-BA 6 mg/L +NAA 0.6 mg/L;(2) 壯苗培養(yǎng)基:MS;MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.05 mg/L;MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.1 mg/L;MS+6-BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/L;MS+6-BA 3 mg/L +NAA 0.3 mg/L;(3)生根培養(yǎng)基:1/2MS+NAA 0.05 mg/L;1/2MS+NAA 0.1 mg/L;1/2MS+IBA 0.1 mg/L;1/2MS+NAA 0.2 mg/L;1/2MS+NAA 0.1 mg/L +IBA 0.1 mg/L。

    1.2.2培養(yǎng)條件除特別說(shuō)明外,上述培養(yǎng)基均添加3%蔗糖和0.6%瓊脂粉,pH值5.8~6.0。培養(yǎng)室溫度為 (25±2) ℃,光照時(shí)間12 h/d,增殖接管光強(qiáng)為800~1 300 lx,生根階段光強(qiáng)為2 000~3 000 lx。

    1.2.3切割方法對(duì)增殖的影響將增殖苗按照單芽、小叢芽(2~3芽/叢,下同)切除愈傷組織、小叢芽基部愈傷保留 2/3、小叢芽基部愈傷全保留的方式切割,觀察不同切割方法對(duì)增殖苗生長(zhǎng)的影響。

    1.2.4光照強(qiáng)度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響以散射光狀態(tài)下(約500 lx)生長(zhǎng)的增殖苗為對(duì)照,觀察不同光強(qiáng)對(duì)黑麥冬生長(zhǎng)的影響。設(shè)置光強(qiáng)為800~1 300 lx、1 500~2 000 lx、2 000~3 500 lx。

    1.2.5試管苗分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制定在增殖階段,按照組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),達(dá)到一定規(guī)格的進(jìn)行壯苗培養(yǎng),小芽和愈傷繼續(xù)增殖培養(yǎng);在壯苗階段,制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),達(dá)到一定規(guī)格的進(jìn)行生根培養(yǎng),小芽和愈傷繼續(xù)進(jìn)行增殖或壯苗培養(yǎng)。

    2結(jié)果與分析

    2.1不同激素配比對(duì)組培苗增殖的影響

    挑選生長(zhǎng)健壯的叢生芽,保留基部愈傷組織2/3左右,以2~3株/叢的團(tuán)塊轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基,培養(yǎng)5周觀察生長(zhǎng)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。不同激素組合對(duì)黑麥冬的增殖率和長(zhǎng)勢(shì)影響不同(表1)。隨著6-BA濃度的增加(1~6 mg/L),增殖系數(shù)隨之增加。6-BA濃度提高3 mg/L時(shí),增殖率可以達(dá)到100%;當(dāng)6-BA濃度達(dá)到4 mg/L時(shí),增殖系數(shù)可以達(dá)到28,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,同時(shí)添加0.4 mg/L的NAA可以促進(jìn)組培苗抽葉(圖1-A);當(dāng)6-BA濃度提高到5 ~6 mg/L時(shí),增殖系數(shù)雖然分別達(dá)到2.8和3.1,芽點(diǎn)較多,但叢生芽有僵化、玻璃化趨勢(shì),影響正常生長(zhǎng)。因此選用培養(yǎng)基MS+6-BA 4 mg/L+NAA 0.4 mg/L 為金葉苔草繼代增殖的最佳培養(yǎng)基。

    2.2不同切割方法對(duì)組培苗增殖的影響

    由表2可知,不同的切割方式對(duì)組培苗的增殖效率和生長(zhǎng)狀況影響較大。單芽的方式接種,產(chǎn)生的芽點(diǎn)少,增殖率只有83%,且生長(zhǎng)勢(shì)差,有黃葉出現(xiàn)。采用叢芽接種的方式時(shí),全部切除愈傷后會(huì)產(chǎn)生較多新的愈傷,但芽點(diǎn)較少;全部保留愈傷組織,老化的組織變?yōu)楹诤稚璧K營(yíng)養(yǎng)吸收,影響增殖?;勘A?/3愈傷組織的情況下,新生的芽點(diǎn)數(shù)量和生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。表1不同激素配比對(duì)黑麥冬組培苗增殖的影響

    培養(yǎng)基(mg/L)接種數(shù)(株)增殖率(%)增殖系數(shù)芽生長(zhǎng)狀況MS+6-BA 1+NAA 0.1150941.4芽點(diǎn)少,苗細(xì),長(zhǎng)勢(shì)弱MS+6-BA 2+NAA 0.2150981.9芽點(diǎn)較少,苗細(xì)MS+6-BA 3+NAA 0.31501002.3芽點(diǎn)較多,較粗壯MS+6-BA 4+NAA 0.41501002.8芽點(diǎn)多,苗粗壯MS+6-BA 41501002.7芽點(diǎn)多,抽葉較少M(fèi)S+6-BA 5+NAA 0.51501002.8芽點(diǎn)多,稍有玻璃化MS+6-BA 6+NAA 0.61501003.1芽點(diǎn)多,有玻璃化注:增殖率=(增殖株數(shù)/接種數(shù))×100%;增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/出芽株數(shù)。表2、表3同。

    2.3不同壯苗培養(yǎng)基對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響

    選取高度2 cm以上的叢生芽接入不同的壯苗培養(yǎng)基中,每瓶接種10叢,培養(yǎng)5周時(shí)進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。如表3所示,不同的壯苗培養(yǎng)基具有不同的增殖系數(shù),6-BA濃度的對(duì)組培苗的增殖系數(shù)和生長(zhǎng)狀況影響很大。當(dāng)不添加6-BA或濃度不高于1 mg/L時(shí),抽出的苗較細(xì)弱,生長(zhǎng)勢(shì)較弱,愈傷組織分化較慢;當(dāng)6-BA濃度達(dá)到2 mg/L時(shí),組培苗粗壯,芽點(diǎn)抽出較多且生長(zhǎng)勢(shì)良好(如圖1-B);當(dāng)6-BA濃度達(dá)到 3 mg/L 時(shí),植株矮化且愈傷化比較嚴(yán)重,不利于后期生根。綜合叢生芽的株高和長(zhǎng)勢(shì)情況,選取MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L為金葉苔草的壯苗培養(yǎng)基。通過(guò)壯苗階段,可以提高金葉苔草種苗的質(zhì)量和一致性,有利于后期生根。表3不同激素配比對(duì)黑麥冬壯苗的影響培養(yǎng)基(mg/L)接種數(shù)(株)增殖系數(shù)生長(zhǎng)狀況MS1501.1苗極細(xì),愈傷組織抽芽慢,黃葉多MS+6-BA 0.5+NAA 0.051501.2苗細(xì),愈傷組織抽芽慢,有黃葉MS+6-BA 1+NAA 0.11501.5苗較細(xì),芽點(diǎn)抽出較均勻MS+6-BA 2+NAA 0.21501.8苗粗壯,芽點(diǎn)抽出均勻MS+6-BA 3+NAA 0.31502.3苗粗壯,矮化,愈傷組織多

    2.4不同激素種類和濃度對(duì)試管苗生根的影響

    當(dāng)壯苗培養(yǎng)5周時(shí),選取高度3 cm以上的植株切去基部愈傷組織,轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)(圖1-C),培養(yǎng)6周后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由表4可以看出,當(dāng)選擇NAA和IBA配合使用時(shí),黑麥冬根系發(fā)達(dá),生根率達(dá)到93%,且試管苗長(zhǎng)勢(shì)良好(圖1-D)。單獨(dú)添加NAA時(shí),濃度從0.05 mg/L遞增至0.2 mg/L,生根率隨之增加,但濃度達(dá)到0.15 mg/L時(shí),基部會(huì)有愈傷組織產(chǎn)生,影響根系質(zhì)量。單獨(dú)添加IBA 0.1 mg/L時(shí),效果比較微弱,生根率只有73%。當(dāng)配合NAA使用,選用培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.1 mg/L +IBA 0.1 mg/L時(shí),可以得到最佳的生根效果。表4不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑麥冬組培苗生根的影響

    培養(yǎng)基(mg/L)接種數(shù)(株)生根系數(shù)生根率(%)根系生長(zhǎng)狀況1/2MS+NAA 0.051004.185一致性差,根較細(xì)長(zhǎng)1/2MS+NAA 0.11004.789一致性較好,根較粗壯1/2MS+IBA 0.11003.973一致性差,根細(xì)長(zhǎng)1/2MS+NAA 0.1+IBA 0.11005.193一致性好,根粗壯1/2MS+NAA 0.151005.091一致性較好,有愈傷組織1/2MS+NAA 0.21004.793有愈傷組織,根粗短注:生根率=(生根株數(shù)/接種數(shù))×100%;生根系數(shù)=生根數(shù)量/接種株數(shù)。

    2.5不同光照強(qiáng)度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

    對(duì)組培苗增殖階段進(jìn)行報(bào)紙覆蓋遮光、調(diào)整日光燈數(shù)量和功率進(jìn)行光照強(qiáng)度設(shè)置,培養(yǎng)5周后,進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。從表5中可以看出,在完全散射光條件(500 lx)下,增殖苗葉片較嫩葉色較淺;光照超過(guò)1 500 lx又不利于黑麥冬的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。選擇光照強(qiáng)度800~1 300 lx光照,12 h/d作為培養(yǎng)條件,可以實(shí)現(xiàn)試管苗的正常生長(zhǎng),并能夠達(dá)到最大的增殖效率和較大的生長(zhǎng)量。據(jù)測(cè)算,封閉工廠化組培中水電費(fèi)約占組培成本的45%,其中主要是電費(fèi)[5]。所以降低光照強(qiáng)度對(duì)于降低生產(chǎn)成本具有重要意義。

    2.6試管苗分級(jí)對(duì)工廠化生產(chǎn)的影響

    在增殖和壯苗過(guò)程中,依據(jù)組培苗的高度、愈傷和芽點(diǎn)的情況進(jìn)行分級(jí),有利于減少接種材料的浪費(fèi)、提高接種效率,從而得到一致性較好的種苗。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和操作方式如表6所示。

    2.7生產(chǎn)工藝

    黑麥冬工廠化生產(chǎn)工藝流程如圖2所示。

    3結(jié)論與討論

    黑麥冬的增殖系數(shù)相對(duì)較低,本試驗(yàn)中增殖系數(shù)達(dá)到28,與此前報(bào)道結(jié)果相符[1]。如果繼續(xù)增高6-BA濃度,增殖系數(shù)稍有提高,但組培苗會(huì)出現(xiàn)玻璃化趨勢(shì),所以減少接種材料的浪費(fèi),對(duì)于規(guī)?;a(chǎn)顯得尤為重要。通過(guò)對(duì)比試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)保留基部愈傷組織2/3左右,以2~3株/叢的團(tuán)塊增殖,可有效地減少材料浪費(fèi),提高接種效率。

    在組培過(guò)程中針對(duì)組培苗的不同階段,制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)提高生產(chǎn)效率、生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)一致的種苗非常重要。在石斛的組培生產(chǎn)中,早已有類似的標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。本試驗(yàn)中針對(duì)增殖和壯苗環(huán)節(jié)制定了篩選標(biāo)準(zhǔn),有利于優(yōu)化生產(chǎn)流程、合理使用接種材料。若在后期生根環(huán)節(jié)進(jìn)行種苗規(guī)格分級(jí),可得到一致性較好的移栽苗,便于進(jìn)行管理和出售。

    在上述研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了黑麥冬種苗的規(guī)模化生產(chǎn),生產(chǎn)出種性一致的種苗20余萬(wàn)株,為進(jìn)一步推廣黑麥冬的應(yīng)用奠定了種源基礎(chǔ)。目前黑麥冬組培苗以外銷居多,國(guó)內(nèi)園林應(yīng)用尚為稀少,但黑麥冬以其特殊的葉色及其良好的適應(yīng)性,有望成為我國(guó)廣大地區(qū)的優(yōu)良地被植物。

    致謝:本研究中的試驗(yàn)材料和技術(shù)方法得到了上海師范大學(xué)鄭志仁博士的大力幫助,在此表示衷心感謝!

    參考文獻(xiàn):

    [1]鄭志仁,婁玉霞,錢宇,等. 黑麥冬的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊,2008,44(1):119-120.

    [2]雷加容,余金龍,羅紅蓉,等. 麥冬組培與快速繁殖技術(shù)研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,18(3):368-369.

    [3]王蔚,高山林,劉蓁,等. 川麥冬脫病毒和組織培養(yǎng)技術(shù)的研究[J]. 藥物生物技術(shù),2006,13(4):274-278.

    [4]曾守君,吳坤林,陳國(guó)華,等. 矮生沿階草的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊,2004,40(3):350.

    [5]謝玲玲,王爾惠. 工廠化生產(chǎn)組培苗的成本控制技術(shù)[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,46(1):30-32.

    [6]化海霞,鄭志仁,王莉莉,等. 鐵皮石斛試管種苗分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,28(2):41-44.

    [7]孫志蓉,陳明穎,王美云,等. 環(huán)草石斛試管苗生長(zhǎng)節(jié)律及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中草藥,2009,40(3):443-447.

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